Векторы, условно экспрессирующие терапевтические белки, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и их применение

Векторы, условно экспрессирующие терапевтические белки, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к области генной терапии для лечения заболеваний и расстройств, например, рака, лизосомных болезней накопления, заболеваний глаз, заболеваний печени или инфекционные заболевания. Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено конструирование иммунных клеток или клеток для поддерживающей терапии (TSC) для экспрессии одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и применение указанных клеток в качестве терапевтических средств. Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение включает вектор, например, аденовирусный, для условной экспрессии описанных в настоящей заявке терапевтических белков (например, иммуномодуляторов), например, IL-12, TNF-альфа, и способы применения таких векторов.

Уровень техники

[0002] Интерлейкин-12 (IL-12) является представителем семейства цитокинов I типа, вовлеченного в содействие ряду биологических процессов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, защитный иммунный ответ и подавление образования опухолей (Abdi et al., 2006; Adorini, 1999; Adorini, 2001; Adorini et al., 2002; Adorini et al., 1996; Akhtar et al., 2004; Akiyama et al., 2000; A1-Mohanna et al., 2002; Aliberti et al., 1996; Allavena et al., 1994; Alii и Khar, 2004; Alzona et al., 1996; Amemiya et al., 2006; Araujo et al., 2001; Arulanandam et al., 1999; Athie et al., 2000; Athie-Morales et al., 2004; Bertagnolli et al., 1992; Bhardwaj et al., 1996; Biedermann et al., 2006; Brunda и Gately, 1994; Buchanan et al., 1995; Romani et al., 1997; Rothe et al., 1996; Satoskar et al., 2000; Schopf et al., 1999; Thomas et al., 2000; Tsung et al., 1997; Wolf et al., 1994; Yuminamochi et al., 2007). Все больше данных свидетельствует о том, что IL-12 может быть перспективной мишенью для борьбы с заболеваниями человека (например, раком).

[0003] Несмотря на тот факт, что IL-12 остается перспективным противораковым терапевтическим агентом ввиду мощной активности, поддерживающей противоопухолевые NK-клетки 1 типа, CD4⁺-T-клетки и CD8⁺-Т-клетки (Trinchieri, 2003), описанная токсичность рекомбинантного человеческого IL-12 (rhIL-12) у пациентов (Atkins et al., 1997), а также ограниченность соответствующих требованиям GMP источников rhIL-12 для клинического применения, препятствовали успешному внедрению основанных на IL-12 терапевтических подходов. Таким образом, представляется логичным, что геннотерапевтический подход может представлять собой более безопасный, более разумный вариант лечения. Действительно, первая стадия клинических испытаний по внедрению внутриопухолевой или перитуморальной доставки рекомбинантных вирусных (Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005) или плазмидных IL-12 кДНК (Heinzerling et al., 2005), или модифицированных по гену IL-12 аутологичных фибробластов (Kang et al., 2001) оказалась безопасной и хорошо переносилась.

[0004] Тем не менее, объективные клинические ответы у пациентов с меланомой или разнообразными карциномами, получающих такую генную терапию, были редкими, изменчивыми, неустойчивыми и в значительной степени сосредоточенными на участке лечения (Heinzerling et al., 2005; Kang et al., 2001; Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005). В случаях, когда регрессия заболевания была частичной или полной, было отмечено увеличение частоты встречаемости проникающих в опухолевые ткани лимфоцитов (Heinzerling и др., 2005; Sangro и др., 2004) и увеличение уровней циркулирующих опухолеспецифических CD8+-T-клеток (Heinzerling et al., 2005), что указывает на улучшение перекрестного примирования антиген-специфичных Т-клеток у этих пациентов.

[0005] Так как перекрестное примирование специфичных Т-клеток лучше всего осуществляется дендритными клетками (ДК), которые служат естественным, но регулируемьм источником IL-12 (Berard et al., 2000), недавно представленные данные о превосходной доклинической эффективности основанной на ДК генной терапии IL-12 представляют большой интерес (Satoh et al., 2002; Tatsumi et al., 2003; Yamanaka et al., 2002). Например, было показано, что внутриопухолевая (внуториопухолевая; i.t.) инъекция ДК, сконструированных для синтеза IL-12p70 (посредством рекомбинантной аденовирусной инфекции) приводит к значительному усилению перекрестного примирования популяции высокореактивных опухолеспецифичных CD8+-Т-клеток совместно с отторжением опухоли в мышиных моделях (Tatsumi et al., 2003). Учитывая прежнее применение рекомбинантного аденовируса, кодирующего mIL-12 под CMV-промотором (rAd.cIL12, (Tatsumi et al., 2003)), определяющим фактором было продуцирование IL-12 сконструированными ДК, следовательно, иммунологическое воздействие этого цитокина, на ранних этапах - в опухолевом образовании, а затем в дренирующих опухоль лимфатических узлах, не может быть оценено в отношении терапевтического результата. Таким образом, существует необходимость в ДК, сконструированных для условной экспрессии IL-12 с целью регулирования как уровней трансгенной экспрессии, так и временного распределения трансгенной активации. В соответствии с настоящим изобретением предложено применение таких клеток с перспективным терапевтическим результатом.

[0006] Многие из указанных терапевтических белков, в настоящее время проходящих доклинические или клинические исследования, не обнаруживают вредных побочных эффектов при наличии в организме пациента до экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине пациента или в подходящем физиологическом контексте. Тем не менее, некоторые белки, такие как фактор некроза опухоли (TNF, ФНО), вызывают побочные эффекты при экспрессии вне нормальной физиологической ткани или контекста (например, при действии на нецелевые ткани). Системное или даже местное введение этого белка чрезвычайно токсично для многих неопухолевых типов клеток, и может способствовать анафилаксии и кахексии. Кроме того, длительное воздействие TNF-альфа может приводить к совершенно иным клеточным ответам, чем кратковременная стимуляция. По этим причинам безопасные и эффективные методики противораковой TNF-альфа терапии оставались недостижимыми.

[0007] В связи с проблемами, связанными с генной экспрессией генов посредством векторных композиций, содержащих белок, кодируемый представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, по-прежнему существует необходимость улучшения передачи векторных композиций, которые будут применяться для прямых инъекций или для клеточной терапии.

[0008] Лизосомные болезни накопления (ЛБН) представляют собой класс наследственных генетических заболеваний, терапию которых в настоящее время проводят только белковыми терапевтическими средствами в форме ферментной заместительной терапии.

[0009] ЛБН представляют собой группу из 49 генетически наследуемых заболеваний, характеризующихся дефицитом одного или более лизосомального фермента, что приводит к накоплению нерасщепленных макромолекул внутри лизосом. Накопление этих побочных продуктов вызывает увеличение лизосом в клетках, что приводит к повреждению и дегенерации клеток. Накопленное повреждение органов и тканей приводит к прогрессивному ухудшению физического и/или психического состояния, и, в конечном итоге, к смерти. Диагноз обычно ставят в раннем детстве. Тяжесть индивидуального заболевания варьирует и коррелирует с уровнями остаточной активности фермента, синтезируемого дефектным геном.

[0010] Заболеваемость ЛБН составляет примерно 1 случай на 5000 человек (130000 случаев во всем мире). Тяжесть варьирует и коррелирует с уровнями остаточной активности фермента, синтезируемого дефектным геном. Пациенты с тяжелыми формами доживают только до подросткового возраста, в то время как пациенты с менее тяжелыми формами могут доживать до взрослого возраста.

[0011] Ферментная заместительная терапия представляет собой единственный существующий способ терапии ЛБН. Терапия заключается в системной инфузии активных белков, направляющихся в лизосомы и расщепляющих накапливающиеся ненужные молекулы. Примеры белковых терапевтических средств для ЛБН включают фабразим (Fabrazyme) (Genzyme) для болезни Фабри, Элапразу (Elaprase) (Shire) для МПС II, Myozome (Genzyme) для болезни Помпе и церезим (Cerezyme) (Genzyme) для болезни Гоше.

[0012] Ферментной заместительной терапии присущи определенные недостатки, такие как необходимость посттрансляционной модификации белков; замещающие ферменты отличаются коротким периодом полураспада in viva; у пациентов развивается иммунный ответ на замещающие ферменты. Таким образом, в данной области техники по-прежнему существует потребность в альтернативе ферментной заместительной терапии для лечения лизосомальных болезней накопления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013] В соответствии с настоящим изобретением предложен рекомбинантный вектор, кодирующий белок(белки), обладающий(е) функцией(ями) одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), под контролем одного или более промотора. Согласно одному из вариантов реализации указанный один или более промотор является условным. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или более промотор является конститутивным. Согласно еще одному варианту реализации указанный вектор представляет собой аденовирусный вектор, кодирующий белок (белки), удаленный из промотора, который может быть условно активирован путем введения растворимого низкомолекулярного лиганда, в частности, диацилгидразинов (например, RG-115819, RG-115830 или RG-115932). Такой вектор позволяет контролировать экспрессию белка(ов) иммунными клетками, TSC и при прямом инъецировании векторов, содержащих терапевтические белки (например, иммуномодуляторы).

[0014] Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен вектор для условной экспрессии белка(ов), обладающего(их) функцией(ями) одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), содержащий полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанную по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий один или более белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Согласно одному из вариантов реализации указанный терапевтический белок (например, иммуномодулятор) выбирают из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN или их субъединицы, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, ГМКСФ, IFN-альфа (ИФН-альфа), IFN-гамма (ИФН-гамма), CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (МСР3), XCL1 (лимфотактина), CXCL1 (MGSA-альфа), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6С-кина), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-дефенсина, HMGB1, Flt3L, IFN-бета (ИФН-бета), TNF-альфа, dnFADD, TGF-альфа, PD-L1, интерферирующей РНК, антисмыслового олигонуклеотида PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L, S100, CD40L, р53, сурвивина, гибрида р53-сурвивин, MAGE3, PSA и PSMA.

[0015] Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен вектор для экспрессии белка(ов), обладающего(их) функцией(ями) одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и белок, обладающий функцией IL-12, содержащий полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, причем указанную по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, (2) полинуклеотид, кодирующий указанный(е) белок(белки), обладающий(е) функцией(ями) указанного одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и (3) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12; причем по меньшей мере один полинуклеотид по (2) и (3) связан с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.

[0016] Согласно некоторым вариантам реализации вектор, предложенный в соответствии с настоящим изобретением, условно экспрессирует TNF-альфа. Согласно определенным вариантам реализации указанный вектор, например, аденовирусный вектор, условно экспрессирующий один или более белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), например, TNF-альфа, также содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид. Указанный сигнальный пептид может быть с оптимизированным составом кодонов. Согласно другим вариантам реализации указанный вектор дополнительно содержит 5’ нетранслируемую область (UTR), 3’-регуляторную область, либо их обе, и улучшает экспрессию и/или общий выход белка.

[0017] В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ получения популяции клеток, например, иммунных клеток или TSC, экспрессирующих белок(белки), обладающий(е) функцией одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора) посредством модификации (например, трансфекции, электропорации и т.д.) указанных клеток рекомбинантным вектором, условно экспрессирующим белок(белки), обладающий(е) функцией(ями) указанного одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), согласно которому указанный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий один или более белок, обладающий функцией терапевтического белкового (например, иммуномодулирующего) модулятора, связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.

[0018] Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ получения популяции клеток, например, иммунных клеток или TSC, экспрессирующих белки, обладающие функцией(ями) одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и белок, обладающий функцией IL-12, посредством модификации указанных клеток рекомбинантным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, (2) полинуклеотид, кодирующий указанный белок(белки), обладающий(е) функцией(ями) указанного одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и (3) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12; причем по меньшей мере один полинуклеотид по (2) и (3) связан с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.

[0019] Согласно некоторым вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ увеличения экспрессии терапевтического белка (например, иммуномодулятора), например, TNF-альфа, экспрессии иРНК или экспрессии белка, включающий получение вектора, условно экспрессирующего один или более белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и одну или более регуляторную последовательность, причем указанная одна или более регуляторная последовательность улучшает экспрессию указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов), в частности, TNF-альфа.

[0020] В соответствии с настоящим изобретением также предложена популяция клеток, например, иммунных клеток или TSC, экспрессирующих белок(белки), обладающий(е) функцией одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), которые были модифицированы (например, трансфицированы, электропорированы, и т.д.) рекомбинантным вектором, условно экспрессирующим белок(белки), обладающий(е) функцией(ями) указанного одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), причем указанный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий один или более белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.

[0021] Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена популяция клеток, например, иммунных клеток или TSC, экспрессирующих белки, обладающие функцией(ями) одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и белок, обладающий функцией IL-12, которые были модифицированы рекомбинантным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, (2) полинуклеотид, кодирующий указанный белок(белки), обладающий(е) функцией(ями) указанного одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и (3) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12; причем по меньшей мере один полинуклеотид по (2) и (3) связан с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.

[0022] Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая две или более популяции клеток, предложенных в соответствии с настоящим изобретением, например, иммунных клеток или TSC, причем каждая популяция клеток в указанной композиции экспрессирует один или более терапевтический белок (например, иммуномодулятор), отличный от одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), экспрессирующегося в другой(их) популяции(ях) клеток в указанной композиции. Согласно одному из вариантов реализации указанная композиция содержит две популяции клеток. Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция содержит более чем две популяции клеток. Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция содержит три популяции клеток. Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция содержит четыре популяции клеток.

[0023] Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена сконструированная in vitro клетка, например, иммунная клетка или TSC, содержащая вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена сконструированная in vitro клетка, например, иммунная клетка или TSC, содержащая вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, (2) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и (3) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12; причем по меньшей мере один полинуклеотид по (2) и (3) связан с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором.

[0024] Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая две или более популяции in vitro сконструированных клеток, например, иммунных клеток или TSC, предложенных в соответствии с настоящим изобретением, причем каждая из указанных популяций in vitro сконструированных клеток в указанной композиции содержит вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, и (2) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), связанный с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором, и где каждая популяция in vitro сконструированных клеток в указанной композиции экспрессирует один или более терапевтический белок (например, иммуномодулятор), отличный от одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора), экспрессирующегося в другой(их) популяции(ях) in vitro сконструированных клеток в указанной композиции. Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая две или более популяции in vitro сконструированных клеток, например, иммунных клеток или TSC, где каждая из указанных популяций клеток содержит вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий генный переключатель, причем указанный полинуклеотид содержит (1) по меньшей мере одну последовательность транскрипционного фактора, функционально связанную с промотором, где указанная по меньшей мере одна последовательность транскрипционного фактора кодирует лиганд-зависимый транскрипционный фактор, (2) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и (3) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12; причем по меньшей мере один полинуклеотид по (2) и (3) связан с промотором, который активируется указанным лиганд-зависимым транскрипционным фактором. Согласно одному из вариантов реализации указанная композиция содержит две популяции in vitro сконструированных клеток. Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция содержит более чем две популяции in vitro сконструированных клеток. Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция содержит три популяции in vitro сконструированных клеток. Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция содержит четыре популяции in vitro сконструированных клеток.

[0025] В соответствии с настоящим изобретением также предложена фармацевтическая композиция, содержащая популяцию клеток, например, иммунных клеток или TSC, согласно описанию в настоящей заявке, или композиция, подходящая для прямой инъекции указанных экспрессионных векторов в отсутствие популяции клеток, т.е. непосредственно инъецируемая.

[0026] Согласно одному из вариантов реализации полинуклеотид, кодирующий один или более белок, обладающий функциями иммуномодулятора, находится под контролем промотора генного переключателя, а полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12, находится под контролем конститутивного промотора. Согласно еще одному варианту реализации и полинуклеотид, кодирующий белок(белки), обладающий функциями указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов), и полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12, находятся под контролем мультицистронного промотора указанного генного переключателя. Согласно еще одному варианту реализации полинуклеотид, кодирующий белок(белки), обладающий(е) функцией указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов), находится под контролем промотора генного переключателя, а полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий функцией IL-12, находится под контролем условного промотора, отличного от промотора генного переключателя. Согласно еще одному варианту реализации система генной регуляции полинуклеотида, кодирующего белок(белки), обладающий(е) функцией указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов) и система генной регуляции полинуклеотида, обладающего функцией IL-12, являются ортогональными. Согласно еще одному варианту реализации системы генной регуляции каждого полинуклеотида, кодирующего каждый белок, являются ортогональными.

[0027] Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением также предложен способ лечения раковых заболеваний, таких как, не ограничиваясь перечисленными, меланомные опухоли, глиомные опухоли, рак почки и рак предстательной железы, а также раковые заболевания, перечисленные в настоящей заявке в таблице 1. Показана противоопухолевая эффективность генной терапии IL-12B исследованиях на животных моделях при применении в форме рекомбинантного кДНК-вектора (Faure et al., 1998; Sangro et al., 2005), и даже большая при применении генно-модифицированных ДК (Satoh et al., 2002; Svane et al., 1999; Tatsumi et al., 2003; Yamanaka et al., 2002). Хотя к настоящему моменту в ходе первой стадии клинических испытаний генной терапии L-12 на человеке с применением плазмид или вирусных векторов и не удалось добиться стойких объективных клинических ответов на фоне рака (Heinzerling et al., 2005; Kang et al., 2001; Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005), генная терапия согласно описанию в настоящей заявке обеспечивает перспективный терапевтический метод.

[0028] Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(а) введение внутриопухолево в микроокружение опухоли, в окружающую опухоль область или системно популяции иммунных клеток, TSC или векторов, предложенных в соответствии с настоящим изобретением (или их комбинации), in vitro сконструированных для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора); и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и лечением указанной опухоли.

[0029] Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(a) введение внутриопухолево в микроокружение опухоли популяции иммунных клеток или TSC, сконструированных in vitro для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора); и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов) и лечение указанной опухоли.

[0030] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(a) введение внутриопухолево в микроокружение опухоли двух или более популяций иммунных клеток или TSC, сконструированных in vitro для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), причем каждая популяция иммунных клеток или TSC экспрессирует отличный набор из одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора); и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества одного или более активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белков, обладающего функцией указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов) и лечение указанной опухоли.

[0031] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(a) введение внутриопухолево в микроокружение опухоли популяции иммунных клеток или TSC, сконструированных т vitro для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и белка, обладающего функцией IL-12, причем по меньшей мере один из белков, обладающих функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) или IL-12, находится под контролем условного промотора, который активируется лигандом; и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества указанного активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и/или белка, обладающего функцией IL-12, и лечением указанной опухоли.

[0032] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения опухоли у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(а) введение внутриопухолево в микроокружение опухоли двух или более популяций иммунных клеток или TSC, сконструированных in vitro для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и белка, обладающего функцией IL-12, причем каждая популяция иммунных клеток или TSC экспрессирует отличный набор из одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), причем по меньшей мере один из указанных белков, обладающих функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) или IL-12, находится под контролем условного промотора, который активируется лигандом; и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества одного или более активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией указанных терапевтических белков (например, иммуномодулятора) и/или белка, обладающего функцией IL-12, и лечением указанной опухоли.

[0033] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(a) введение указанному млекопитающему популяции модифицированных клеток, которые модифицированы для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора); и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и лечением указанного заболевания или расстройства.

[0034] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(a) введение указанному млекопитающему двух или более популяций модифицированных клеток, которые модифицированы для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), причем каждая популяция модифицированных клеток экспрессирует отличный набор из одного или более терапевтического белка (например, иммуномодулятора); и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества одного или более активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белков, обладающего функцией указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов), и лечением указанного заболевания или расстройства.

[0035] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(a) введение указанному млекопитающему популяции модифицированных клеток, которые модифицированы для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и белка, обладающего функцией IL-12, причем по меньшей мере один из указанных белков, обладающих функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) или IL-12, находится под контролем условного промотора, который активируется лигандом; и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества указанного активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и/или белка, обладающего функцией IL-12, и лечением указанного заболевания или расстройства.

[0036] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, включающий следующие этапы:

(а) введение указанному млекопитающему двух или более популяций модифицированных клеток, которые модифицированы для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и белка, обладающего функцией IL-12, причем каждая популяция модифицированных клеток экспрессирует отличный набор из одного или более белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), причем по меньшей мере один из указанных белков, обладающих функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора) или IL-12, находится под контролем условного промотора, который активируется лигандом; и

(b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества одного или более активирующего лиганда;

с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией указанных терапевтических белков (например, иммуномодуляторов) и/или белка, обладающего функцией IL-12, и лечением указанного заболевания или расстройства.

[0037] В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ определения эффективности терапии на основе сконструированных клеток, например, иммунных клеток или TSC, путем измерения уровня экспрессии или активности ИФН-гамма у пациента до начала терапии, с получением, таким образом, контрольного уровня, и последующего введения клеток, сконструированных для экспрессии одного или более белка, обладающего функциями терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и, необязательно, белка, обладающего функцией IL-12, введения эффективного количества активирующего лиганда, последующего измерения уровня экспрессии ИФН-гамма для получения экспериментального уровня, и сравнения контрольного уровня с экспериментальным для определения, эффективен ли терапевтический режим.

[0038] Также настоящее изобретение включает способ лечения опухоли, уменьшения размеров опухоли или предотвращения образования опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий (а) введение терапевтически эффективного количества вектора, условно экспрессирующего по меньшей мере один терапевтический белок (например, иммуномодулятор), в частности, IL-12, TNF-альфа, у указанного млекопитающего, (b) введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества одного или более активирующего лиганда, причем указанный активирующий лиганд активирует экспрессию белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), с индуцированном, таким образом, экспрессии белка, обладающего функцией терапевтического белка (например, иммуномодулятора), и лечением указанной опухоли.

[0039] Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ определения эффективности терапевтического режима, основанного на in vitro сконструированных клетках, например, иммунных клетках или TSC, у пациента, включающий:

(a) измерение уровня экспрессии или уровня активности, либо обоих, интерферона-гамма (ИФН-гамма) в первом биологическом образце, полученном перед введением in vitro сконструированных клеток от нуждающегося в этом пациента, с получением, таким образом, контрольного уровня;

(b) введение нуждающемуся в этом пациенту клеток, in vitro сконструированных для условной экспрессии одного или более белка, обладающего функциями терапевтического белка (например, иммуномодулятора) и, нео