Антигены, ассоциированные с воспалительным заболеванием кишечника

Антигены, ассоциированные с воспалительным заболеванием кишечника

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к лечению и обнаружению воспалительного заболевания кишечника (IBD). Изобретение включает применение агента специфического связывания, который связывает изоформу ED-Α фибронектина, в частности агента специфического связывания, связывающего домен ED-Α фибронектина. Например, агент специфического связывания может быть конъюгирован с иммуносупрессивной или противовоспалительной молекулой, такой как интерлейкин-10.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Воспалительное заболевание кишечника (IBD) представляет собой группу воспалительных состояний, поражающих ободочную кишку и тонкий кишечник. Основными типами IBD являются болезнь Крона (CD) и неспецифический язвенный колит (UK). Патогенез IBD характеризуется различной ангиогенной регуляцией, вносящей вклад в хроническое воспалительное состояние кишечника и закрепление этого состояния (Chidlow et al., 2006, Am J Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 29, G5-G18). Болезнь Крона может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта, тогда как неспецифический язвенный колит обычно ограничен ободочной и прямой кишкой (Summers RW, Elliott DE, Qadir K, Urban JF, Thompson R, Weinstock JV (2003) Am. J. Gastroentol., 98: 2034-2041). В зависимости от его тяжести для лечения неспецифического язвенного колита может требоваться иммуносупрессия, чтобы контролировать его симптомы, и лечение обычно включает введение противовоспалительных молекул.

Известно, что IBD характеризуется повышающей регуляцией провоспалительных цитокинов, таких как IFN(интерферон)-γ, IL(интерлейкин)-6 и IL-12 (например IL-12р70). Например, известно, что болезнь Крона ассоциирована с избыточным продуцированием IL-12/IL-23 и IFN-γ/IL-17 (Strober et al. (2007), The Journal of Clinical Investigation, 117(3), 514-521). Описан также синтез IL-12p70 и IL-23 во время активной болезни Крона (Fuss et al. 2006, Inflamm. Bowel Dis. 12: 9-15).

Фибронектин (FN) представляет собой гликопротеин и широко экспрессируется в ряде нормальных тканей и жидкостей организма. Он является компонентом внеклеточного матрикса (ЕСМ) и играет роль во многих биологических процессах, включая клеточную адгезию, клеточную миграцию, гемостаз, тромбоз, заживление раны, дифференцировку тканей и онкогенную трансформацию.

Различные изоформы FN образуются в результате альтернативного сплайсинга трех областей (ED-Α, ED-B, IIICS) первичного транскрипта пре-мРНК FN, где данный процесс модулируется цитокинами и внеклеточным рН (Balza (1988) FEBS Lett., 228, 42-44; Carnemolla (1989) J. Cell Biol., 106, 1139-1148; Borsi (1990) FEBS Lett. 261, 175-178). Фибронектин содержит два глобулярных экстра-домена типа III, которые могут подвергаться альтернативному сплайсингу: ED-Α и ED-B (ffrench-Constant (1995) Exp. Cell Res., 22, 261-271, Kaspar et al. (2006) Int. J. Cancer, 118, 1331-1339). ED-A мышиного фибронектина мыши и человеческого фибронектина идентичны на 96,7% (только 3 аминокислоты различаются между 90-аминокислотными последовательностями).

Описана экспрессия ED-Α фибронектина в опухолевых клетках и в солидных опухолях на уровне мРНК при раке молочной железы (Jacobs et al. (2002) Human Pathol, 33, 29-38, Matsumoto et al. (1999) Jpn. J. Cancer Res., 90, 320-325) и раке печени (Oyama et al. (1989) JBC, 264, 10331-10334, Tavian et al. (1994) Int. J. Cancer, 56, 820-825) и на уровне выделенного белка при фибросаркоме, рабдомиосаркоме и меланоме (Borsi et al. (1987) J. Cell Biol., 104, 595-560). Помимо рака, экспрессия ED-Α фибронектина описана при ревматоидном артрите (WO 2009/056268). В WO 2010/078950 также описана экспрессия ED-Α фибронектина при эндометриозе, псориазе и псориатическом артрите, тем не менее, гистохимический анализ выявил, что при рассеянном склерозе и при неспецифическом язвенном колите экспрессия ED-Α является от очень слабой до почти отсутствующей. Иммуногистохимические анализы, описанные авторами Brenmoehl et al. (Int. J. Colorectal Dis. (2007) 22: 611-623), показывают, что экспрессия ED-A снижается в воспаленной слизистой оболочке кишечника пациентов с CD по сравнению с контрольной слизистой оболочкой и повышается при неспецифическом язвенном колите. В статье Brenmoehl et al. (2007) также описана повышенная экспрессия изоформ ED-Α и ED-B в фибротической слизистой оболочке пациентов с CD. Экспрессия изоформ ED-A и ED-B в фибротической слизистой оболочке ожидается, поскольку известно, что эти изоформы фибронектина вовлечены в заживление ран. В статье Brenmoehl et al. (2007) отсутствует предположение, что ED-Α экспрессируется во время (активной) CD, с учетом сниженной экспрессии ED-Α в воспаленной слизистой оболочке кишечника пациентов с CD по сравнению со слизистой оболочкой, имеющей происхождение от контрольных пациентов. Применение агентов связывания, связывающих изоформу ED-Α фибронектина, для лечения или диагностики IBD также не раскрыто в данном документе.

Интерлейкин-10 (IL-10) представляет собой противовоспалительный цитокин, функционирующий как важный регулятор иммунной системы. Хотя известно, что IL-10 играет множество различных ролей в иммунной системе, его две основные активности включают ингибирование продуцирования цитокинов макрофагами и ингибирование вспомогательных функций макрофагов в процессе активации Т-клеток (Abbas A, Lichtman A, Pober J., 1994, Cellular and Molecular Immunology. 2nd Ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company). Эффекты этих действий заставляют IL-10 играть, в основном, противовоспалительную роль в иммунной системе. IL-10 первоначально был известен как ингибирующий фактор синтеза цитокина (CSIF), и открытие этого белка было основано на его биологической активности (Delves Ρ, Roitt I (eds), 1998, Encyclopedia of Immunology, 2nd Ed. San Diego: Academic Press). В связи с его хорошо известными противовоспалительными свойствами терапия IL-10 была внедрена как потенциально новая противовоспалительная терапия при болезни Крона (CD) (Fedorak et al., Gastroenterology (2000) 119, 1473-1482.; Schreiber et al., Gastroenterology (2000) 119, 1461-1472; Colombel et al., Gut (2001) 49, 42-46).

Авторами Asadullah et al. (Pharmacology Reviews, (2003), 55, 245-269) сделан обзор уровня техники относительно терапии интерлейкином-10 при ряде воспалительных заболеваний. При обзоре хронического воспалительного заболевания кишечника Asadullah et al. сообщают о проведении нескольких обширных многоцентровых испытаний, тестирующих множественные дозировки IL-10 у пациентов со слабой/умеренной или устойчивой к терапии CD, а также у пациентов, проходящих лечебную резекцию подвздошной кишки или тонкотолстокишечную резекцию, чтобы предотвратить эндоскопическую послеоперационную встречаемость, путем системного введения (Fedorak et al., Gastroenterology (2000) 119, 1473-1482.; Schreiber et al., Gastroenterology (2000) 119, 1461-1472; Colombel et al., Gut (2001) 49, 42-46.). Эти данные указывают на то, что терапия IL-10 безопасна и хорошо переносится. Тем не менее, лечение IL-10 не приводило в результате к значительно более высоким скоростям ремиссии или к клиническому улучшению по сравнению с введением плацебо.

Было обнаружено, что клинические результаты в целом неудовлетворительны, и Herfarth и Scholmerich обсуждали несколько объяснений неудач данной терапевтической стратегии (Gut (2002) 50, 146-147).

Таким образом, существует необходимость в эффективных терапиях различных состояний IBD.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что анти-EDA антитело, слитое с IL-10, обладало следующей способностью (1) селективно локализоваться в участках воспаленной ободочной кишки in vivo у мышей с заболеванием IBD и (2) снижать сывороточные уровни некоторых провоспалительных цитокинов у мышей с заболеванием IBD, в частности интерферона-гамма, IL-6 и IL-12р70.

Понижающая регуляция провоспалительных цитокинов посредством введения анти-EDA антитела, слитого с IL-10, была особенно неожиданной, поскольку авторы Tilg et al. (Gut (2002), 50, 191-195) сообщают, что лечение пациентов с болезнью Крона рекомбинантным человеческим IL-10 индуцирует интерферон-гамма. Авторы Shibata et al. (J. Immunol., (1998) 161, 4283-4288) также сообщают, что IL-10 усиливает продуцирование NK-клетками IFN-гамма, но ингибирует продуцирование макрофагами факторов, индуцирующих IFN-гамма.

Таким образом, в первом аспекте изобретения предложен агент специфического связывания, например молекула антитела, связывающий изоформу экстра-домен А (ED-Α) фибронектина (A-FN), для применения в способе лечения IBD. В изобретении также предложено применение агента специфического связывания, например молекулы антитела, связывающего изоформу экстра-домен А (ED-Α) фибронектина, для изготовления лекарственного средства для лечения IBD. В изобретении также предложен способ лечения IBD у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего агент специфического связывания, связывающий изоформу ED-A фибронектина. Предпочтительно агент специфического связывания связывает изоформу ED-Α человеческого фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом первом аспекте изобретения может связывать ED-A фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом первом аспекте изобретения, может быть конъюгирован с молекулой, обладающей иммуносупрессивной или противовоспалительной активностью, с выявляемой меткой, с радиоактивным изотопом или с биоактивной молекулой, такой как цитокин, гормон, терапевтический радиоактивный изотоп, цитотоксическое лекарственное средство. Агент специфического связывания может быть конъюгирован с биоактивной молекулой посредством расщепляемого линкера.

В предпочтительном воплощении агент специфического связывания, например молекула антитела, конъюгирован с молекулой, обладающей иммуносупрессивной или противовоспалительной активностью, такой как IL-10.

IBD по отношению к данному изобретению может представлять собой активную IBD. В частности, IBD может представлять собой болезнь Крона (CD), неспецифический язвенный колит (UK), коллагенозный колит, лимфоцитарный колит, ишемический колит, диверсионный колит, болезнь Бехчета или неопределенный колит. IBD может представлять собой CD или UK. IBD может представлять собой CD, коллагенозный колит, лимфоцитарный колит, ишемический колит, диверсионный колит, болезнь Бехчета или неопределенный колит. В одном воплощении изобретения IBD не представляет собой UK. IBD может представлять собой IBD, обычно не ограниченное воспалением в ободочной и прямой кишке, такое как CD. IBD может представлять собой IBD, поражающее не только выстилающую поверхность кишечника. Предпочтительно IBD представляет собой CD. Термины CD, UK, коллагенозный колит, лимфоцитарный колит, ишемический колит, диверсионный колит, болезнь Бехчета и неопределенный колит, как используют в данном описании, могут относиться к активной CD, активному UK, активному коллагенозному колиту, активному лимфоцитарному колиту, активному ишемическому колиту, активному диверсионному колиту, активной болезни Бехчета и активному неопределенному колиту, соответственно.

Во втором аспекте изобретения предложен агент специфического связывания, например молекула антитела, связывающий изоформу ED-A фибронектина, для применения в доставке молекулы, конъюгированной с агентом специфического связывания, к IBD-ткани. В изобретении также предложено применение агента специфического связывания, например молекулы антитела, связывающего изоформу ED-Α фибронектина, для изготовления лекарственного средства для доставки молекулы, конъюгированной с агентом специфического связывания, к IBD-ткани. В изобретении также предложен способ доставки молекулы к IBD-ткани у человека или животного, где эта молекула конъюгирована с агентом специфического связывания, связывающим изоформу ED-Α фибронектина, с образованием конъюгата, и данный способ включает введение конъюгата человеку или животному. Предпочтительно агент специфического связывания связывает изоформу ED-Α человеческого фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом втором аспекте изобретения, может связывать ED-A фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом втором аспекте изобретения может быть конъюгирован с выявляемой меткой, радиоактивным изотопом или биоактивной молекулой, такой как цитокин, гормон, терапевтический радиоактивный изотоп или цитотоксическое лекарственное средство. Агент специфического связывания может быть конъюгирован с биоактивной молекулой посредством расщепляемого линкера.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, предпочтительно конъюгирован с IL-10.

В третьем аспекте изобретения предложен агент специфического связывания, например молекула антитела, связывающий изоформу ED-A фибронектина, для применения в способе диагностики IBD. В изобретении также предложено применение агента специфического связывания, связывающего изоформу ED-Α фибронектина, для изготовления диагностического продукта для диагностики IBD. В изобретении также предложен способ обнаружения или диагностики IBD у человека или животного, включающий стадии:

а) введения человеку или животному агента специфического связывания, связывающего домен ED-Α фибронектина, и

б) определения присутствия или отсутствия агента специфического связывания в участках IBD организма человека или животного,

где локализация агента специфического связывания в участке IBD указывает на наличие IBD.

Предпочтительно агент специфического связывания связывает изоформу ED-Α человеческого фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом третьем аспекте изобретения может связывать ED-A фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом третьем аспекте изобретения может быть конъюгирован с выявляемой меткой или радиоактивным изотопом.

В четвертом аспекте изобретения предложен агент специфического связывания, связывающий изоформу ED-Α фибронектина, для применения в способе визуализации IBD-ткани. В изобретении также предложено применение агента специфического связывания, связывающего изоформу ED-A фибронектина, для изготовления визуализирующего агента для визуализации IBD-ткани. В изобретении также предложен способ обнаружения или визуализации IBD-ткани у человека или животного, включающий стадии:

а) введения человеку или животному агента специфического связывания, связывающего домен ED-Α фибронектина, и

б) обнаружения связывания агента специфического связывания с IBD-тканью в организме человека или животного.

Предпочтительно агент специфического связывания связывает изоформу ED-Α человеческого фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом четвертом аспекте изобретения, может связывать ED-A фибронектина.

Агент специфического связывания, например молекула антитела, для применения в этом четвертом аспекте изобретения, может быть конъюгирован с выявляемой меткой или радиоактивным изотопом.

В пятом аспекте в изобретении предложен конъюгат, содержащий связывающий агент, который связывает изоформу ED-Α, например ED-A, фибронектина, конъюгированный с IL-10, где конъюгат имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13. Данный конъюгат в настоящем описании обозначен как F8-IL10. Поскольку вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) данного конъюгата связаны посредством аминокислотного линкера из 5 аминокислот (см. Фиг. 1В), ожидают, что конъюгат образует нековалентные гомодимеры в растворе.

Агент специфического связывания, для применения в изобретении может представлять собой молекулу антитела, связывающую ED-A-изоформу фибронектина и/или ED-Α фибронектина, где антитело содержит одну или более чем одну определяющую комплементарность область (CDR) антитела F8, описанного в данном изобретении. Эти последовательности приведены ниже (см. SEQ ID NO: 1-6). Последовательности CDR антитела F8 также показаны на Фиг. 1.

Агент специфического связывания для применения в изобретении может содержать одну или более чем одну CDR, как описано в изобретении, например CDR3, и возможно также CDR1 и CDR2 с образованием набора CDR.

Предпочтительно агент специфического связывания для применения в изобретении содержит набор CDR H (тяжелой цепи) и/или L (легкой цепи) антитела F8, описанного в изобретении, имеющих десять или менее, например одну, две, три, четыре или пять, аминокислотных замен в пределах раскрытого набора CDR H и/или L.

Замены могут быть потенциально осуществлены в любом остатке в пределах набора CDR и могут в пределах CDR1, CDR2 и/или CDR3.

Агент специфического связывания для применения в изобретении, может включать молекулу антитела, например молекулу человеческого антитела. Агент специфического связывания обычно содержит VH- и/или VL-домен антитела. VH-домены агентов специфического связывания также предложены для применения в изобретении. В пределах каждого из доменов VH и VL находятся определяющие комплементарность области (CDR) и каркасные области (FR). Домен VH содержит набор HCDR, а домен VL содержит набор LCDR. Молекула антитела может содержать домен VH, содержащий VH CDR1, CDR2 и CDR3 и каркасную область. Альтернативно или также она может содержать домен VL, содержащий VL CDR1, CDR2 и CDR3 и каркасную область. Все последовательности VH и VL, последовательности CDR, наборы CDR и наборы HCDR и наборы LCDR, раскрытые в данном изобретении, представляют собой воплощения агента специфического связывания для применения в изобретении. Как описано в данном изобретении, "набор CDR" включает CDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, набор HCDR относится к HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а набор LCDR относится к LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Если не указано иное, "набор CDR" включает HCDR и LCDR.

Агент специфического связывания для применения в изобретении может содержать VH-домен антитела, содержащий определяющие комплементарность области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и каркасную область, где HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 1, и где, возможно, HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 2, и/или HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 3.

В типичном случае домен VH спарен с доменом VL с обеспечением антигенсвязывающего сайта антитела, хотя, как дополнительно обсуждается ниже, для связывания антигена можно использовать только один домен VH или домен VL. Таким образом, агент специфического связывания для применения в изобретении может дополнительно содержать домен VL антитела, содержащий определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 и каркасную область, где LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 4, и где, возможно, LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 5 и/или LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 6.

Агент специфического связывания для применения в изобретении может предпочтительно содержать молекулу антитела к ED-Α фибронектина, содержащую домен VH и домен VL, где домен VH содержит каркасную область и набор определяющих комплементарность областей HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и где домен VL содержит определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 и каркасную область, и где:

HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;

HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;

LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и

LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

Одна или более чем одна CDR или набор CDR антитела можно прививать на каркасную область (например человеческую каркасную область) с получением молекулы антитела для применения в изобретении. Каркасные области могут содержать человеческие последовательности генного сегмента эмбрионального типа. Таким образом, каркасной области может быть возвращена последовательность эмбриональной линии, в силу чего один или более чем один остаток в пределах каркасной области изменяют для совпадения с остатками в эквивалентном положении в наиболее подобной человеческой каркасной области эмбрионального типа. Агент специфического связывания для применения в изобретении может представлять собой выделенную молекулу антитела, имеющую домен VH, содержащий набор HCDR в человеческой каркасной области эмбрионального типа, например DP47. Обычно агент специфического связывания также имеет домен VL, содержащий набор LCDR, например, в человеческой каркасной области эмбрионального типа. Человеческая каркасная область эмбрионального типа домена VL может представлять собой DPK22.

Домен VH для применения в изобретении может предпочтительно иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, представляющую собой домен VH антитела F8. Домен VL для применения в изобретении может предпочтительно иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, представляющую собой домен VL антитела F8 дикого типа.

Агент специфического связывания для применения в изобретении может представлять собой или содержать одноцепочечный Fv (scFv), содержащий домен VH и домен VL, соединенные через пептидный линкер. Специалист в данной области техники может выбрать соответствующую длину и последовательность линкера, например, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 аминокислот в длину, вплоть до примерно 15, вплоть до примерно 20 или вплоть до примерно 25 аминокислот в длину. Линкер может иметь аминокислотную последовательность GGSGG (SEQ ID NO: 9).

Агент специфического связывания может представлять собой диатело, представляющее собой поливалентный или мультиспецифический фрагмент, сконструированный путем слияния генов (WO 94/13804; Holliger et al. (1993а), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448).

Предпочтительно агент специфического связывания представляет собой scFv, образующий (стабильные) нековалентные гомодимеры в растворе. Например, как антитело F8, так и конъюгат F8-IL10, раскрытые в данном изобретении, включают scFv, который, как ожидают, образует (стабильные) нековалентные гомодимеры в растворе.

Одноцепочечный Fv (scFv) может содержаться внутри мини-иммуноглобулина или малого иммунопротеина (SIP), например, как описано в Li et al., (1997), Protein Engineering, 10: 731-736. SIP может содержать молекулу scFv, слитую с доменом СН4 секреторной изоформы IgE человека IgE-S2 (ε_S2-СН4; Batista et al., (1996), J. Exp. Med., 184: 2197-205), образуя гомодимерную мини-иммуноглобулиновую молекулу антитела.

Альтернативно агент специфического связывания для применения в изобретении может содержать антигенсвязывающий сайт внутри молекулы, не являющейся антителом, обычно обеспечиваемый одной или более чем одной CDR, например, набор CDR в белковом остове, не являющемся антителом. Агенты специфического связывания, включающие молекулы, не являющиеся антителом, и молекулы антитела, раскрыты более подробно в другом разделе данного изобретения.

Агент специфического связывания для применения в настоящем изобретении может представлять собой молекулу антитела, содержащую домен VH антитела F8, представленный в SEQ ID NO: 7, и/или домен VL антитела F8, представленный в SEQ ID NO: 8. Агент специфического связывания для применения в настоящем изобретении может представлять собой молекулу антитела, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11. Агент специфического связывания, конъюгированный с IL-10, по настоящему изобретению может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13.

Агент специфического связывания для применения в настоящем изобретении может также содержать одну или более чем одну, например все шесть, CDR анти-ED-A антител Н1, В2, С5, D5, Е5, С8, F1, В7, Е8 или G9 или их варианты либо домены VH и/или VL анти-ED-A антител Н1, В2, С5, D5, Е5, С8, F1, В7, Е8 или G9 или их варианты. Последовательности CDR и последовательности доменов VH и VL этих антител раскрыты в WO 2010/078950.

Подходящий вариант для применения в настоящем изобретении содержит антигенсвязывающий сайт антитела, содержащий домен VH и домен VL антитела F8, описанного в данном изобретении, где остаток лейцина (L) в положении 5 домена VH, представленного как SEQ ID NO: 7, заменен остатком валина (V) и/или остаток аргинина (R) в положении 18 домена VL, представленного как SEQ ID NO: 8, заменен остатком лизина (K).

Эти и другие аспекты изобретения более подробно раскрыты ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1А показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи (VH) анти-ED-A антитела F8 (SEQ ID NO: 7). Аминокислотная последовательность CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 1) анти-ED-A антитела F8 подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) анти-ED-A антитела F8 показана курсивом и подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR3 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3) анти-ED-A антитела F8 показана полужирным шрифтом и подчеркнута. На Фиг. 1В показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности анти-ED-A антитела F8 между доменами VH и VL (SEQ ID NO: 9). На Фиг. 1С показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 8) анти-ED-A антитела F8. Аминокислотная последовательность CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO: 4) анти-ED-A антитела F8 подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO: 5) анти-ED-A антитела F8 показана курсивом и подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO: 6) анти-ED-A антитела F8 показана жирным шрифтом и подчеркнута. На Фиг. 1D показана аминокислотная последовательность линкера между антителом F8 и IL-10, когда антитело конъюгировано с IL-10. На Фиг. 1Е показана аминокислотная последовательность человеческого IL-10.

На Фиг. 2 показаны результаты авторадиографии ободочной кишки от мышей с IBD и от здоровых мышей. Ободочные кишки собирали и экспонировали с помощью системы скрининга изображений на люминесцентном фосфорном покрытии (Molecular Dynamics) в течение 24 часов и визуализировали с помощью прибора Storm 860. Дорожка 1: ободочная кишка, взятая через 6 ч после инъекции от группы 0 (здоровая мышь); Дорожка 2: ободочная кишка, взятая через 6 ч после инъекции от группы 2 (мышь с IBD); Дорожка 3: ободочная кишка, взятая через 24 ч после инъекции от группы 0 (здоровая мышь); Дорожка 4: ободочная кишка, взятая через 24 ч после инъекции от группы 2 (мышь с IBD).

На Фиг. 3 показано биораспределение ¹²⁵I-F8-IL10 у здоровых или больных мышей. Диаграммы показывают биораспределение ¹²⁵I-F8-IL10 у здоровых и больных мышей через 6 часов после инъекции (А), через 24 часа после инъекции (В) и через 96 часов после инъекции (С). Через 96 часов видно преимущественное накопление ¹²⁵I-F8-IL10 в ободочной кишке и в мезентериальных лимфатических узлах (L.N.) больных мышей по сравнению со здоровыми мышами. Последовательность конъюгата F8-IL10, используемого в этих экспериментах, представлена в SEQ ID NO: 13.

На Фиг. 4 показаны уровни цитокинов у мышей, которым вводили F8-IL10. На верхней диаграмме представлены уровни цитокинов в сыворотке здоровых мышей (вода), больных мышей, которые не получали препарат (3% декстрансульфат натрия (DSS)), больных мышей, которые получали антитело F8 в формате малого иммунопротеина (F8SIP), больных мышей, которые получали F8-IL10 (F8-IL10). Приведены уровни следующих цитокинов (выраженные в пикограммах (пг) белка на мл сыворотки): интерлейкина 1β (IL1-b), интерлейкина 12 (IL-12p70), интерферона γ (IFNγ) и интерлейкина 6 (IL6).

На Фиг. 5 показаны уровни цитокинов у мышей, которым вводили F8-IL10. На верхней диаграмме представлены уровни цитокинов в сыворотке здоровых мышей (вода), больных мышей, которые не получали препарат (3% DSS), больных мышей, которые получали антитело F8 в формате малого иммунопротеина (F8SIP), больных мышей, которые получали F8-IL10 (F8-IL10). Приведены уровни следующих цитокинов (выраженные в пикограммах (пг) белка на мл сыворотки): кератиноцитарного хемокина (KC), интерлейкина 10 (IL10) и фактора некроза опухоли альфа (TNFa).

На Фиг. 6 показан гистохимический анализ образцов ткани ободочной кишки пациентов, пораженной неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона, идентифицированных с антителом F8 в формате SIP и с фактором фон Виллебранда. Рисунок окрашивания, наблюдаемый с антителом F8 и с фактором фон Виллебранда показывает, что F8 окрашивает вновь образованные кровеносные сосуды, но не окрашивает нормальные сосуды у пациентов, страдающих неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона. Фактор фон Виллебранда обычно используют в качестве маркера нормальных кровеносных сосудов.

На Фиг. 7 показан гистохимический анализ образцов ткани ободочной кишки пациентов, пораженной неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона (справа), и непораженных ободочных кишок (слева). Рисунок окрашивания, наблюдаемый с антителом F8, показывает, что F8 более интенсивно окрашивает вновь образованные кровеносные сосуды в ободочной кишке, пораженной заболеванием.

ТЕРМИНОЛОГИЯ

Фибронектин

Фибронектин представляет собой антиген, подвергаемый альтернативному сплайсингу, и известен ряд альтернативных изоформ фибронектина, описанных в другом разделе настоящего изобретения. Экстра-домен A (EDA или ED-Α) также известен как ED, повтор А экстра-типа III (EIIIA) или EDI. Последовательность человеческого ED-Α опубликована Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 и Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. Последовательность ED-A человека также доступна в базе данных SwissProt как аминокислоты 1631-1720 (фибронектин типа III 12; экстра-домен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа Р02751. Последовательность мышиного ED-Α доступна в базе данных SwissProt как аминокислоты 1721-1810 (фибронектин типа III 13; экстра-домен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа Р11276.

Изоформа ED-Α фибронектина (A-FN) содержит экстра-домен A (ED-A). Последовательность человеческого A-FN может быть выведена из соответствующей последовательности предшественника человеческого фибронектина, доступной в базе данных SwissProt под номером доступа Р02751. Последовательность мышиного A-FN может быть выведена из соответствующей последовательности предшественника мышиного фибронектина, доступной в базе данных SwissProt под номером доступа Р11276. A-FN может представлять собой человеческую изоформу ED-A фибронектина. ED-Α может представлять собой экстра-домен А человеческого фибронектина.

ED-Α представляет собой последовательность из 90 аминокислот, встроенную в фибронектин (FN) в результате альтернативного сплайсинга, и локализована между доменом 11 и 12 FN (Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). В основном ED-A отсутствует в плазматической форме FN, но присутствует в большом количестве в процессе эмбриогенеза, ремоделирования ткани, фиброза, трансплантации сердца и роста солидной опухоли.

Альтернативный сплайсинг

Альтернативный сплайсинг относится к встречаемости различных паттернов сплайсинга первичного РНК-транскрипта ДНК с образованием различных мРНК. После эксцизии интронов отбор может определить, какие из экзонов сплайсируются вместе с образованием мРНК. Альтернативный сплайсинг приводит к образованию различных изоформ, содержащих различные экзоны и/или различное число экзонов. Например, одна изоформа может включать дополнительную аминокислотную последовательность, соответствующую одному или более чем одному экзону, которая может содержать один или более чем один домен. Агент специфического связывания

Данный термин описывает один агент из пары молекул, специфически связывающихся друг с другом. Агенты пары специфического связывания могут иметь природное происхождение, либо могут быть полностью или частично получены синтетическим путем. Один агент из пары молекул имеет область на его поверхности, либо полость, связывающуюся с определенной пространственной и полярной организацией другого агента из пары молекул, и, следовательно, комплементарной этому агенту. Примерами являются следующие типы пар связывания: антиген-антитело, биотин-авидин, гормон-рецептор гормона, рецептор-лиганд, фермент-субстрат. Настоящее изобретение относится к реакциям типа антиген-антитело.

Агент специфического связывания обычно содержит молекулу, имеющую антигенсвязывающий сайт. Например, агент специфического связывания может представлять собой молекулу антитела или белок, не являющийся антителом, который содержит антигенсвязывающий сайт. Агент специфического связывания, относящийся к данному изобретению, предпочтительно представляет собой молекулу антитела.

Антигенсвязывающий сайт может обеспечиваться за счет расположения определяющих комплементарность областей (CDR) на остове белка, не являющегося антителом, такого как фибронектин или цитохром В и т.д. (Haan & Maggos, (2004), BioCentury, 12(5): А1-А6; Koide et al., (1998), Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al., (1997), Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469), либо за счет рандомизации или мутирования аминокислотных остатков петли в пределах белкового остова для придания связывающей специфичности к желаемой мишени. Подробный обзор остовов для конструирования новых связывающих сайтов в белках приведен в статье Nygren et al. (1997) (Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469). Миметики белкового остова антитела раскрыты в документе WO/0034784, в котором авторами изобретения раскрыты белки (миметики антител), содержащие домен фибронектина типа III, имеющий по меньшей мере одну рандомизированную петлю. Подходящий остов, в который можно прививать одну или более чем одну CDR, например набор HCDR, может обеспечивать любой доменный элемент суперсемейства иммуноглобулиновых генов. Остов может представлять собой человеческий или нечеловеческий белок человека. Преимущество остова белка, не являющегося антителом, состоит в том, что он может обеспечивать антигенсвязывающий сайт в молекуле остова, являющейся меньшей по размеру и/или более простой в получении, чем по меньшей мере некоторые молекулы антител. Малый размер связывающего агента может придавать полезные физиологические свойства, такие как способность к проникновению в клетки, к глубокому проникновению в ткани или к достижению мишени внутри других структур, либо к связыванию внутри полостей белка антигена-мишени. Обзор применения антигенсвязывающих сайтов в остовах белка, не являющегося антителом, приведен в статье Wess, 2004, In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7. Типичными являются белки, имеющие стабильный скелет и одну или более чем одну вариабельную петлю, в которых аминокислотную последовательность этой петли или петель подвергают специфичному или случайному мутированию для создания антигенсвязывающего сайта, который связывает антиген-мишень. Такие белки включают IgG-связывающие домены белка А из S. aureus, трансферрин, тетранектин, фибронектин (например 10-й домен фибронектина типа III) и липокалины. Другие подходы включают синтетические "микротела" (Selecore GmbH), основанные на циклотидах, представляющих собой малые белки, имеющие внутримолекулярные дисульфидные связи.

Кроме последовательностей антитела и/или антигенсвязывающего сайта, агент специфического связывания для применения в настоящем изобретении может содержать другие аминокислоты, например, образующие пептид или полипептид, такой как свернутый домен, или для придания молекуле другой функциональной характеристики в дополнение к способности связывать антиген. Связывающие агенты для применения в изобретении могут нести выявляемую метку или могут быть конъюгированы с токсином, молекулой, проявляющей иммуносупрессивное или противовоспалительное действие, либо с нацеливающей группировкой или ферментом (например, посредством пептидильной связи или линкера). Предпочтительно связывающие агенты для применения в изобретении конъюгированы с интерлейкином 10.

Например, связывающий агент может содержать каталитический сайт (например, в ферментативном домене), а также антигенсвязывающий сайт, связывающийся с антигеном и, следовательно, нацеливающий каталитический сайт на антиген. Каталитический сайт может ингибировать биологическую функцию антигена, например, посредством расщепления.

Хотя, как было отмечено, CDR могут находиться на остовах, не являющихся антителом, структура, предназначенная для того, чтобы нести CDR или набор CDR, как правило, представляет собой последовательность тяжелой или легкой цепи антитела либо ее существенный участок, в котором CDR или набор CDR расположены в положении, соответствующем CDR или набору CDR встречающихся в природе вариабельных доменов VH и VL антитела, кодируемых перегруппированными иммуноглобулиновыми генами. Структуры и локализации вариабельных доменов иммуноглобулина могут быть определены со ссылкой на книгу Kabat et al. (1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services) и ее переиздания, доступную в настоящее время в Интернете (на сайте immuno.bme.nwu.edu или в поиске "Kabat" с использованием любой поисковой системы).

Подразумевают, что область CDR или CDR указывает на гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, как определено Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services (Kabat et al., (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington, и последующие издания). Антитело обычно содержит 3 CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин "CDR" или "области CDR" используют в данном изобретении для указания соответственно случаю одной или нескольких из этих областей или да