Способ получения композиции иммуноглобулинов

Способ получения композиции иммуноглобулинов

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения композиции иммуноглобулинов с вирусной безопасностью, и к препаратам антител и фармацевтическим композициям, которые можно получать с применением этого способа.

Предпосылки создания изобретения

Композиции иммуноглобулинов, полученные из плазмы человека и пригодные для внутривенного введения, известны в данной области и в течение нескольких десятилетий играют важную роль в лечении широкого ряда заболеваний. Иммуноглобулины применяют, например, для лечения инфекций у человека, и их можно отнести к различным классам с различными биохимическими и физиологическими свойствами. Иммуноглобулин G участвует в защите против вирусных антигенов, в то время как IgM является преимущественно активным в иммунных ответах против бактерий и токсинов.

Растворы иммуноглобулинов содержат IgG, IgA и IgM в разных процентных соотношениях, где различные препараты имеют различные применения в лечении, например, препараты с более высоким процентным содержанием IgM применяют для профилактики или лечения бактериальных инфекций. В отличие от препаратов IgG антитела IgM легко агрегируют в растворе. Препараты IgM сложно стабилизировать, особенно если их обогащают в сравнении с концентрациями в плазме и сохраняют в жидком растворе.

Растворы иммуноглобулинов обычно получают из фракций плазмы или сыворотки крови, например, фракций Коэна. Затем эти фракции подвергают ряду стадий очистки для удаления загрязнений, таких как вирусы, денатурированные белки, протеазы и липиды. Плазму человека для фракционирования собирают от тысяч доноров, и она может содержать патогенные вирусы, несмотря на тестирование источника плазмы. Таким образом, стадии способа инактивации или удаления вирусов являются необходимыми для получения безопасных продуктов для применения в медицине. В данной области известно несколько способов инактивации/удаления вирусов, например, химическая обработка, облучение УФС-светом или фильтрация через нанометровые фильтры, которые осуществляют для обеспечения полной вирусной безопасности. Однако такие стадии могут оказывать негативное влияние на активность иммуноглобулинов; например, увеличенные периоды времени облучения УФС могут снижать выход нативного и активного IgM, полученного в конечном растворе иммуноглобулина.

Способность стадий способа удалять или инактивировать вирус подтверждают с применением моделей способа получения в лабораторном масштабе, и для каждой стадии определяют степень удаления или инактивации. Увеличение степени инактивации/удаления добавляет фармацевтическому продукту дополнительную вирусную безопасность. Современные руководства регулирующих органов требуют, по меньшей мере, двух эффективных стадий для оболочечных и безоболочечных вирусов в производстве происходящих из плазмы лекарственных средств.

В дополнение к вирусам, которые потенциально присутствуют, является также необходимым удаление других загрязнений, подобно липидам, протеазам, агрегатам белка и денатурированным иммуноглобулинам, для поучения продукта с хорошей переносимостью. Денатурированные иммуноглобулины особенно представляют потенциальный риск для пациентов, поскольку они обладают высокой способностью неспецифически активировать комплемент, приводя к тяжелым побочным эффектам у пациентов, которым вводят эти денатурированные иммуноглобулины. Эту антикомплементарную активность (ACA) измеряют посредством стандартизированного теста, описанного в Европейской фармакопее.

Удаление всех этих загрязнений является необходимым для того, (1) чтобы продукт являлся переносимым пациентом после внутривенного введения, (2) чтобы обеспечить соответствие продукта инструкциям по биологической безопасности, относящимся к загрязнению вирусами, (3) чтобы дать возможность продукту оставаться стабильным во время долгосрочного хранения и (4) чтобы получить желаемую смесь соединений/фармацевтическую композицию.

Начальную очистку растворов IgM человека проводят классическими способами фракционирования плазмы Коэна или их хорошо известными модификациями (например, Коэна/Онкли, Кистлера/Нитшманна). С применением способа осаждения холодным этанолом фракцию IgM выделяют во фракции III или фракции I/III (также называемые B или B+I). Описаны способы очистки растворов белка, обогащенных IgM, начиная с фракции III или I/III. В EP0013901 описан способ очистки, начиная с фракции III, включающий стадии с применением обработки октановой кислотой, β-пропиолактоном и стадию адсорбции с применением анионообменной смолы. Этот способ применяют для получения Pentaglobin^® (пентаглобин^®)- до настоящего времени единственного коммерчески доступного внутривенного продукта IgM. В EP0352500 описано получение концентрата IgM для внутривенного введения с уменьшенной антикомплементарной активностью при использовании анионообменной хроматографии, β-пропиолактона, облучения УФС-светом и стадии инкубации при повышенной температуре (40°C-60°C). Поскольку β-пропиолактон является очень реакционноспособным веществом, вызывающим химическую модификацию белков, существует также значительная потеря противовирусной и антибактериальной активности иммуноглобулинов. Препарат, полученный таким способом, являлся стабильным в жидком растворе в течение ограниченного времени из-за химической модификации. Концентрация IgM составляла более 50% общего содержания иммуноглобулинов.

Получение растворов белка, обогащенных IgM без химической модификации β-пропиолактоном, описано в EP0413187 (Biotest) и EP0413188 (Biotest). Эти способы включают подвергание подходящего раствора белка обработке октановой кислотой и анионообменной хроматографии, начиная с фракции Коэна III или II/III. В патенте EP0413187 (Biotest) обработку октановой кислотой проводят путем перемешивания в течение 15 мин для удаления липидов, присутствующих во фракции Коэна III.

Поскольку большие количества иммуноглобулинов внутривенно вводят пациентам, необходимо получение переносимого фармацевтического препарата. Препараты IgM описаны как трудно получаемые для внутривенного введения. IgM по природе является сильным активатором комплемента после связывания антигенов. Таким образом, неспецифическая антикомплементарная активность денатурированных молекул IgM является намного более опасной для пациентов, чем у денатурированных молекул IgG. Препарат по EP0413187 обладал низкой антикомплементарной активностью, от 0,6 до 0,8 CH₅₀/мг белка, но нуждался в стабилизации и инактивации вируса β-пропиолактоном. Считается, что низкая антикомплементарная активность составляет ≤1 CH₅₀/мг белка согласно монографии EP для иммуноглобулинов.

В EP0413188B1 (Biotest) описано получение обогащенного IgM препарата для внутривенного введения при использовании анионообменной хроматографии для снижения антикомплементарной активности. Кроме того, описана термическая обработка при pH 4-4,5 при 40-60°C, предпочтительно, от 50 до 54°C, для снижения антикомплементарной активности. Этот препарат необходимо было лиофилизировать для обеспечения стабильности препарата в течение нескольких месяцев. Не смогли показать долгосрочной стабильности в форме жидкого раствора.

По другому способу описано применение мягкой термической обработки препаратов IgM при 40-62°C, предпочтительно, 45-55°C, при pH 4,0-5,0 (EP 0450412, Miles) для уменьшения неспецифической активации комплемента. В этой патентной заявке октановую кислоту добавляют к суспензии фракции Коэна III для удаления активатора прекалликреина и липопротеинов центрифугированием. Тем не менее, эта мягкая термическая обработка приводит к частичной потере антигенных детерминант IgM. Это может увеличивать риск образования неоантигенов, приводя к увеличенной иммуногенности для человека или потере активности.

Получение содержащего IgM раствора белка для внутривенного введения с использованием обработки протеазой (например, пепсином) после стадии осаждения октановой кислотой описано в EP0835880 (US 6136312, ZLB). Обработка протеазой приводит к частичной фрагментации молекулы иммуноглобулина, уменьшающей полную функциональную активность частей Fab и Fc. Таким образом, обработанные протеазой иммуноглобулины нельзя рассматривать как немодифицированные. Этот способ получения приводит также приблизительно к 5% фрагментов с молекулярной массой <100 кДа.

Описанные способы проведения обработки октановой кислотой (EP0413187 и EP0835880) обладают таким недостатком, при котором обработка октановой кислотой не является эффективной в отношении удаления и инактивации безоболочечных вирусов, и по существу не удаляет всю протеолитическую активность.

В EP 0345543 (Bayer, Miles) описан высококонцентрированный препарат IgM, по меньшей мере, с 33% IgM для терапевтического применения, где препарат является по существу свободным от титров изоагглютинина. В этой патентной заявке осаждение октановой кислотой проводят путем добавления октановой кислоты, и изоагглютинины удаляют аффинной хроматографией на Synsorb. Конечный препарат необходимо лиофилизировать.

В целом, получение содержащего IgM препарата с низкой антикомплементарной активностью является возможным, если иммуноглобулины химически или ферментативно модифицируют и/или дополнительно очищают хроматографией и/или подвергают мягкой термической обработке.

Тем не менее, способами предшествующего уровня техники, приводящими к препарату немодифицированного иммуноглобулина, невозможно достигать возможности инактивации вирусов для всех потенциально присутствующих вирусов. Хотя несколько способов, таких как обработка растворителем/детергентом, обработка октановой кислотой, фильтрация через нанометровые фильтры и термическая обработка, являются эффективными для инактивации или удаления оболочечных вирусов, существует только немного способов для инактивации или удаления безоболочечных вирусов, например, парвовирусов. Эти безоболочечные вирусы по большей части являются чрезвычайно малыми, обычно проходя через нанометровые фильтры с размерами пор более 20 нм. Этот размер пор является слишком малым для молекул IgM, имеющих диаметр вплоть до 30 нм. Безоболочечные вирусы эффективно инактивируют химическими веществами, подобными β-пропиолактону, которые, однако, также приводят к модифицированному иммуноглобулину с нарушенными функциями. Другой эффективной обработкой является облучение УФС (EP 1842561, CAF-DCF). Однако известные обработки растворителем/детергентом, обработка октановой кислотой и слабая термическая обработка не оказывают существенного эффекта на безоболочечные вирусы.

Таким образом, все препараты, содержащие химически немодифицированные IgM, которые получены способами предшествующего уровня техники, и которые обладают низкой антикомплементарной активностью, не являются безопасными для применения человеку по отношению к безоболочечным вирусам, например, парвовирусам.

Таким образом, способы предшествующего уровня техники, которыми выделяют содержащие IgM препараты с переносимостью при внутривенном введении, обладают определенными недостатками, такими как неспособность эффективно инактивировать или удалять безоболочечные вирусы, и ограниченная способность удалять протеолитическую активность при сохранении в то же время IgM в растворе с высоким выходом. (Протеолитическая активность относится к сумме протеаз, присутствующих в препарате). Поскольку жидкий препарат белка должен поддаваться хранению в течение длительных периодов времени (например, 2 года), остаточную активность протеаз необходимо исключать, поскольку эта активность может приводить к деградации фармацевтического препарата.

Таким образом, цель настоящего изобретения направлена на эти недостатки.

Краткое описание сущности изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции иммуноглобулинов IgM из фракции плазмы, содержащей иммуноглобулины, включающему:

(a) обеспечение фракции плазмы в виде раствора, содержащего иммуноглобулины;

(b) смешивание C₇-C₉ карбоновой кислоты с раствором и обработку смешанного раствора вибросмесителем для осаждения загрязняющих белков; и

(c) отделение осажденных белков от раствора для получения содержащей IgM композиции иммуноглобулинов.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что применение вибросмесителя на стадии, когда раствор иммуноглобулина смешивают с карбоновой кислотой, обладает необычайными преимуществами. Эта стадия способа обеспечивает более эффективное удаление нежелательных белков (включая протеазы) и образует промежуточный продукт, лучше подходящий для стадий дальнейшей переработки, используемых для получения иммуноглобулинового лекарственного средства; промежуточный продукт дает возможность стадиям дальнейшей переработки быть более эффективными. В частности, содержащую иммуноглобулин IgM композицию, полученную на стадии (c), можно комбинировать с дополнительными стадиями обработки, такими как обработка в слабокислых условиях и обработка облучением УФС, для получения содержащего IgM иммуноглобулинового продукта или препарата антитела, который является пригодным для внутривенного введения и который обладает следующими преимущественными свойствами: (i) является химически немодифицированным; (ii) обладает вирусной безопасностью, (iii) обладает низкой протеолитической активностью (и таким образом является стабильным в ходе долгосрочного хранения); (iv) обладает низкой антикомплементарной активностью; и (v) сохраняет высокий уровень нативного и активного IgM. Уровень вирусной безопасности, достигаемый способами, описанными в данном описании, ранее не мог быть получен. Кроме того, с применением способа по настоящему изобретению получают содержащий IgM иммуноглобулиновый продукт или препарат антитела с комбинацией этих свойств, которая ранее не могла быть получена.

В частности, стадии способа по настоящему изобретению приводят к более высокой инактивации и удалению вирусных частиц, особенно очень устойчивых, безоболочечных вирусов, таких как парвовирусы, которые обычно являются не очень чувствительными к обработке октановой кислотой. Более того, достигают улучшенного удаления протеолитической активности по сравнению с общепринятым перемешиванием. Этих свойств достигают, сохраняя в то же время высокий уровень IgM, который является химически немодифицированным. Эти открытия противоречат общепринятой точке зрения, что обработка октановой кислотой не является эффективной стадией против безоболочечных вирусов, и улучшенной вирусной безопасности необходимо достигать посредством инактивации вируса более жесткими способами, такими как обработка β-пропиолактоном. Также было хорошо известно, что, например, повышение концентрации октановой кислоты для полного удаления протеолитической активности приводит к массовой потере IgM.

Результатов по настоящему изобретению достигают путем использования смешивающих устройств с применением режима вибрации в сочетании с обработкой октановой кислотой. Это является особенно неожиданным, поскольку известно, что IgM является очень чувствительным к напряжению сдвига, которое может приводить к нежелательной высокой антикомплементарной активности. Соответственно, невозможно было предусмотреть использования вибросмесителя для получения композиции IgM и невозможно было ожидать настолько благоприятного вклада применения вибросмешивания в ходе получения содержащего IgM раствора.

Более того, способом по настоящему изобретению, разделение, осуществляемое на стадии (c), такой как осветление фильтрацией обработанного октановой кислотой раствора, полученного на стадии (b), улучшается при использовании вибросмесителя. Разделения достигают более просто, с уменьшением времени обработки и производственной себестоимости, и стадия (c) приводит к прозрачному раствору, что создает преимущества для дальнейшей переработки. Общепринятые растворы, получаемые фильтрацией продуктов обработанных октановой кислотой содержащих IgM растворов, подвергнутых перемешиванию, являются опалесцирующими или мутными.

Содержащую IgM композицию, полученную на стадии (c), предпочтительно подвергают обработке в слабокислых условиях (например, pH 4) и стадии облучения УФС для дополнительного улучшения вирусной безопасности и стабилизации конечного продукта. Благодаря улучшенному осветлению содержащей IgM композиции иммуноглобулинов, полученной на стадии (c), становится возможным уменьшить необходимое время облучения УФС для достижения вирусной инактивации безоболочечных вирусов более 3 или 4 log₁₀. Это приводит к более высокому выходу нативного и активного IgM в ходе обработки УФС.

Неожиданно, эти стадии приводят к содержащему химически и ферментативно немодифицированный IgM раствору, обладающему более высокими выходами нативного и активного IgM, обладающему низкой антикомплементарной активностью и низкой протеолитической активностью, и обладающему высокой антибактериальной и противовирусной активностью, выдающейся вирусной безопасностью по отношению к оболочечным и безоболочечным вирусам; ключевой характеристикой для лекарственных средств, предназначенных для внутривенного введения. Более того, обработанный содержащий IgM раствор обладает улучшенной долгосрочной стабильностью, являясь очень стабильным в жидком растворе в течение более 12 месяцев при 2-8°C.

Соответственно, в следующем аспекте настоящее изобретение относится к препарату антитела, получаемому с применением способа по настоящему изобретению, указанного выше, и к препарату антитела, содержащему IgM и обладающему протеолитической активностью менее 8 Ед./л. В частности, препарат антитела является пригодным для внутривенного введения человеку и содержит IgG, IgA и IgM, где, по меньшей мере, 5% от общего количества иммуноглобулинов составляют IgM.

Кроме того, настоящее изобретение относится к препарату антитела по настоящему изобретению для применения в медицине. В одном варианте осуществления препарат антитела предназначен для применения в лечении иммунологических нарушений и бактериальных инфекций.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения, включающему введение препарата антитела по настоящему изобретению пациенту.

Настоящее изобретение в настоящее время описано более подробно только посредством примера, со ссылкой на сопутствующие фигуры.

На фиг.1 предоставлен обзор варианта осуществления настоящего изобретения, в котором показаны стадии, которые можно применять для получения препарата антитела, пригодного для внутривенного введения. На стадии обработки октановой кислотой с использованием устройства вибросмесителя большое значение придается обработке pH4 и обработке УФС. Исходный материал получают общепринятым способом осаждения плазмы человека холодным этанолом.

Подробное описание изобретения

Как описано выше, настоящее изобретение относится к способу получения содержащей IgM композиции иммуноглобулинов из фракции плазмы, содержащей иммуноглобулины. Фракции плазмы, пригодные для получения фармацевтических композиций иммуноглобулинов, и способы их получения хорошо известны в данной области. В частности, когда фармацевтические композиции иммуноглобулинов предназначены для введения человеку, фракцию плазмы получают из плазмы человека. Фракция плазмы предпочтительно представляет собой осажденную фракцию плазмы и наиболее предпочтительно, осажденную фракцию плазмы, полученную способом фракционирования по Коэну или с помощью его хорошо известных модификаций (например, Кистлера-Нитшманна). Наиболее предпочтительно, фракция представляет собой фракцию I/III или фракцию III (известные также как фракция B+I или фракция B) после фракционирования холодным этанолом. Предпочтительным является, чтобы иммуноглобулины фракции плазмы содержали, по меньшей мере, 5% IgM.

Стадия (a) включает предоставление фракции плазмы в виде раствора, содержащего иммуноглобулины. Во многих случаях фракция плазмы, содержащая иммуноглобулины, находится в твердой или полутвердой форме. Таким образом, задачей этой стадии является обеспечение перехода или перевод белка из фракции плазмы в раствор, так чтобы он находился в состоянии, подходящем для смешивания с карбоновой кислотой на стадии (b). Эта стадия может включать смешивание фракции плазмы с подходящим буфером. Предпочтительно, буфер имеет низкую молярность (т.е. менее 1M) и имеет pH от 4,5 до 5,5, например, 0,1M буфер ацетата натрия pH 5,05±0,1. Смешивание можно выполнять с использованием лопастной мешалки или вибросмесителя.

На стадии (b) раствор, образованный на стадии (a), смешивают с использованием вибросмесителя с C₇-C₉ карбоновой кислотой для осаждения загрязняющих белков (например, протеаз, вирусов и т.д.). Карбоновая кислота может быть разветвленной и/или может включать заместители, которые по существу не изменяют эффект стадии (b). Карбоновая кислота предпочтительно представляет собой октановую кислоту. Кислоту предпочтительно добавляют в концентрации, по меньшей мере, 0,075 кг/кг фракции плазмы, вплоть до концентрации 0,2 кг/кг. Более предпочтительно, кислоту добавляют при 0,8-0,15 кг/кг фракции плазмы, и наиболее предпочтительно, от 0,09 кг/кг до 0,13 кг/кг. Кислоту любой подходящей молярности можно применять для обеспечения правильной концентрации.

Можно использовать любой тип коммерчески доступного вибросмесителя, пригодного для применения в химической/фармацевтической промышленности. Примеры пригодных вибросмесителей доступны от Graber+Pfenninger GmbH. В частности, вибросмеситель «Labormodell Typ 1» можно использовать для экспериментов в лабораторном масштабе, и «Industriemixer Typ 4» можно использовать для препаратов в промышленном масштабе. Вибросмесители можно использовать согласно инструкциям производителя, и в частности, при установках, описанных производителями как подходящие для перемешивания растворов, содержащих белки. Например, вибросмесители обычно можно эксплуатировать при менее 100 Гц с амплитудой менее 10 мм, например, авторы настоящего изобретения проводили вибросмешивание в лабораторном масштабе с использованием «Labormodell Typ 1» при 50 Гц, с применением источника электропитания 230 В. Амплитуду вибрации процесса смешивания меняли от 0 до 3 мм, и для препарата IgM предпочтительно применяли 3 мм. Смесители с диаметром от 23 мм до 65 мм использовали для экспериментов в лабораторном масштабе. Для промышленного масштаба применяли диаметр смесителя 395 мм (диаметры отверстий 13,5 мм и 16 мм).

На стадии (b) pH смешанного раствора предпочтительно составляет 4,5-5,5, и более предпочтительно, от pH 4,8 до pH 5,3. Стадию можно проводить в буфере ацетата натрия, и, например, в буфере приблизительно 0,1M ацетата натрия. Температура, при которой проводят стадию (b), предпочтительно составляет от 10°C до 35°C, и более предпочтительно, 14-30°C.

Время смешивания с использованием вибросмесителя не является конкретно ограниченным, но оно предпочтительно составляет, по меньшей мере, 30 минут и не более 3 часов, и более предпочтительно, 40-110 минут. Периоды времени инкубации менее 30 минут могут снижать уровень инактивации вируса.

В одном варианте осуществления стадии (b) трифосфат кальция смешивают с раствором на стадии (b). Предпочтительно, его добавляют при 0,01-0,02 кг/кг фракции плазмы (как таковой в твердой или полутвердой форме). Трифосфат кальция можно добавлять одновременно, отдельно или последовательно с карбоновой кислотой. В предпочтительном варианте осуществления трифосфат кальция добавляют, по меньшей мере, через 20 минут после карбоновой кислоты.

На стадии (c) загрязняющие белки, осажденные на стадии (b), отделяют от раствора для получения содержащей IgM композиции иммуноглобулина (т.е. содержащего иммуноглобулин раствора). Эта стадия разделения не является конкретно ограниченной, но ее можно проводить любым пригодным способом, известным в данной области. Однако стадию разделения предпочтительно проводят с применением фильтрации, и более предпочтительно, ультрафильтрации, и результатом стадии (c), таким образом, является фильтрованный раствор.

Как описано выше, способ по настоящему изобретению является преимущественным в отношении производства, поскольку он, по-видимому, обеспечивает более эффективное осаждение загрязняющих белков, и, в результате, стадию (c) проще проводить. Когда разделяют смесь, полученную в результате стадии (b), достигают прозрачного очищенного раствора, т.е. содержащей IgM композиции иммуноглобулина. Фильтрация, таким образом, является более быстрой и простой.

Дополнительные стадии способа необходимы для перевода содержащей IgM композиции иммуноглобулина, полученной на стадии (c), в препарат антитела, пригодный для внутривенного введения.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению включает дополнительные стадии обработки содержащей IgM композиции иммуноглобулинов, полученной на стадии (c), в слабокислых условиях и, кроме того, подвергания обработанной кислотой композиции облучению УФС.

Для обработки в слабокислых условиях содержащую IgM композицию иммуноглобулинов, полученную на стадии (c), инкубируют от pH 3,5 до pH 4,5, и предпочтительно, от pH 3,8 до pH 4,2, для получения инкубированного раствора. Слабокислые условия можно создавать добавлением пригодной кислоты к содержащей IgM композиции иммуноглобулинов, например, pH можно доводить добавлением 0,2M HCl.

Стадию инкубации предпочтительно проводят от 32 до 42°C, и более предпочтительно, от 35 до 39°C. Время инкубации составляет предпочтительно, по меньшей мере, 2 часа и не более 24 часов, и более предпочтительно, по меньшей мере, 9 часов, но не более 16 часов.

На стадии облучения инкубированный раствор, полученный после обработки слабой кислотой, описанной выше, обрабатывают УФС-светом для получения облученного УФС раствора. Эту стадию можно проводить с использованием устройств, которые являются коммерчески доступными, таких как устройство UVivatec® (Bayer Technology Services). Предпочтительным является, чтобы инкубированный раствор обрабатывали при 254±10 нм от 200 до 500 Дж/м², более конкретно, от 200 до 300 Дж/м², для дополнительной инактивации вирусов и протеаз, которые потенциально присутствуют. Отмечено, что обработка УФС в мягких условиях, которая в норме является необходимой, возможна только для осветленного прозрачного фильтрата, который получают по настоящему изобретению после обработки октановой кислотой с вибросмешиванием. Более опалесцирующие или мутные растворы, в норме получаемые общепринятыми способами смешивания, могут нуждаться в более длительных периодах времени облучения, которые могут приводить к большей денатурации активного IgM и меньшим степеням инактивации вируса.

В дополнение к обработке слабой кислотой и облучению УФС, дополнительные стадии получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения могут также необязательно включать одну или более дополнительных стадий фильтрации. В одном варианте осуществления раствор белка можно адсорбировать на DEAE-Sephadex и затем отделить от Sephadex глубинной фильтрацией. Например, его можно дополнительно подвергать периодической адсорбции с помощью 75 мг на кг белка DEAE Sephadex при pH 5,8 для удаления нежелательного сопутствующего белка церулоплазмина.

В особенно предпочтительном варианте осуществления инкубированный раствор, полученный после обработки слабой кислотой, подвергают адсорбции на DEAE-Sephadex и затем отделяют от Sephadex глубинной фильтрацией, перед обработкой облучением УФС.

В другом варианте осуществления обрабатываемый раствор иммуноглобулина можно фильтровать через нанометровый фильтр. Фильтры с размером пор 75±5 нм-35±5 нм, или фильтры с номинальным размером пор 75-35 нм (например, Pall Ultipor DV50), можно использовать на различных стадиях в ходе процесса. (Номинальный размер пор, например, 50 нм, означает степень удержания ≥4 log₁₀ для вируса размером 50 нм или более). В предпочтительном варианте осуществления раствор, полученный на стадии DEAE-Sephadex, описанной в вышестоящем разделе, фильтруют через фильтр 0,2 мкм перед облучением УФС. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления раствор иммуноглобулина, полученный после облучения УФС, подвергают нанофильтрации, предпочтительно, через фильтр, имеющий размер пор 40-50 нм. Предпочтительно, эту стадию следует проводить в стерильных условиях.

Конечным препаратом антитела (т.е. обработанным содержащим IgM раствором иммуноглобулина), полученным способом, определенным выше, можно непосредственно заполнять контейнер в стерильных условиях. Альтернативно, препарат антитела можно составлять со стабилизирующим средством, таким как глицин. В частности, препарат можно составлять в глицинсодержащем буфере при pH от 4 до 5,5 и, предпочтительно, от 4,1 до 4,5. Препарат антитела можно также разводить до концентрации белка от 40 до 80 г/л и, предпочтительно, от 55 до 70 г/л.

Предпочтительно, способ по настоящему изобретению не включает стадию, состоящую из одной или более химических модификаций антител в препарате, ферментативной модификации антител или термической обработки антител (например, обработку антител при температуре 40°C или выше в течение 10 минут или более). Более конкретно, способ по настоящему изобретению не включает стадию контакта антител с β-пропиолактоном и/или пепсином.

Кроме того, настоящее изобретение относится к препарату иммуноглобулинов или препарату антитела, которые могут быть получены способом, описанным выше. Препарат иммуноглобулинов является поликлональным и может включать, по меньшей мере, 5% IgM, предпочтительно, по меньшей мере, 15% IgM и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 20% IgM. Другие иммуноглобулины представляют собой IgG и IgA. Предпочтительно, препарат иммуноглобулинов содержит от 5 до 30% IgM (наиболее предпочтительно, приблизительно от 15 до 30%), от 5 до 30% IgA (наиболее предпочтительно, от 15 до 30%) и от 40 до 70% IgG (наиболее предпочтительно, от 45 до 70%). В наиболее предпочтительном продукте содержание IgG составляет приблизительно 50%, и содержание каждого из IgM и IgA составляет приблизительно 25%. Значения обозначают процентное содержание, например, IgM от суммы IgG+IgA+IgM. Тем не менее, также возможно дополнительное обогащение IgM хорошо известными способами, подобно, например, анионообменной хроматографии. Значения могут быть определены нефелометрией или иммунопреципитацией согласно Ph. Eur. (current edition (2010) 2.9.17).

В частности, иммуноглобулины в препарате иммуноглобулинов не являются химически модифицированными. Препарат иммуноглобулинов не обрабатывают в ходе процесса его получения химическим веществом, таким как β-пропиолактон, для стерилизации продукта. Подобным образом, препарат не обрабатывают добавленной протеазой, такой как пепсин, для стерилизации продукта. Поэтому иммуноглобулины находятся в основном в нативной форме.

Препарат антитела обладает более низкой протеолитической активностью, чем препараты антител, описанные в предшествующем уровне техники. В частности, невозможно детектировать протеолитическую активность в препарате при его хранении в пределах 2-8°C. Протеолитическую активность можно измерять стандартизованными способами тестирования, известными в данной области, такими как способ с применением хромогенного субстрата, описанный ниже в примере 6. В таких способах протеолитическую активность оценивают смешиванием хромогенного субстрата (в частности, субстрата, чувствительного, по меньшей мере, к одной сериновой протеазе) и образца препарата антитела (обычно разведенного в буфере для соответствия линейному диапазону анализа) при 37°C и мониторингом кинетики поглощения с использованием спектрофотометра. Протеолитическую активность образца рассчитывают из начальной разницы поглощения (∆Abs/мин) с применением уравнения C (Ед./л)=S×∆Abs/мин×F(C=протеолитическая активность; S=коэффициент перевода, относящийся к специфическому изменению поглощения хромогенного субстрата; и F=коэффициент разведения). Применение субстрата осуществляют согласно инструкциям производителя.

Протеолитическую активность можно, в частности, оценивать посредством следующих стадий:

(a) 25 мг субстрата S-2288 (Chromogenix) растворяют в 7,2 мл воды для инъекций;

(b) образец препарата антитела разводят в буфере (100 мМ Трис.HCl pH 8,4, 106 мМ NaCl) для соответствия линейному диапазону анализа, и температуру доводят до 37°C;

(c) смешивают равные количества (например, 200 мкл) разведенного препарата антитела и растворенного субстрата;

(d) измеряют кинетику поглощения при 405 нм в течение 1-3 минут при 37°C с использованием спектрофотометра;

(e) протеолитическую активность образца рассчитывают из начальной разницы поглощения (∆Abs/мин) с применением уравнения C (Ед./л)=313×∆Abs/мин×F (C=протеолитическая активность, F=коэффициент разведения).

Предел количественного определения по данному способу составляет 8 Ед./л, и с применением образца препарата антитела по настоящему изобретению протеолитическая активность не поддается детекции. Поэтому уровень протеолитической активности в конечном продукте по настоящему изобретению составляет ниже 8 Ед./л.

Как и препараты, известные в данной области, препарат антитела по настоящему изобретению можно хранить при 5±3°C. Однако благодаря эффективной очистке способом по настоящему изобретению, стабильность препарата антитела является необычайно хорошей. Конечный продукт является стабильным в жидкой форме в течение, по меньшей мере, 3 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, двух лет при 2-8°C, что означает, что отсутствует фрагментация или полимеризация IgM более 5%, измеренных в HPSEC, увеличение протеолитической активности, уменьшение активности антитела IgM против Escherichia coli и активности антитела IgM против Pneumococcus saccharide более 25% и увеличение антикомплементарной активности более 25%, остающейся ниже 1 CH₅₀/мг белка. Кроме того, конечный продукт, полученный способом по настоящему изобретению, является стабильным в жидкой форме в течение, по меньшей мере, 3 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, одного года при комнатной температуре (от 23 до 27°C), как оценено по таким же критериям.

Способ по настоящему изобретению, кроме того, обеспечивает более высокий уровень удаления вирусов, чем способы предшествующего уровня техники, с получением препарата антитела, который является более безопасным, чем препараты антител из предшествующего уровня техники, особенно по отношению к активным безоболочечным вирусам, подобным, например, парвовирусам. Способом по настоящему изобретению можно удалять/инактивировать вирусы, и, в частности, безоболочечные вирусы, более чем на 3 log₁₀, предпочтительно, более чем на 4 log₁₀ и, наиболее предпочтительно, более чем на 5 log₁₀. Это приводит в результате к препарату антитела, который является по существу свободным от вирусов и, в частности, по существу свободным от безоболочечных вирусов (т.е. обладает вирусной безопасностью). Кроме того, способом по настоящему изобретению можно достигать этого уровня удаления/инактивации вирусных частиц без существенного влияния на количество активного IgM или на антикомплементарную активность препарата антитела. Соответственно, можно получать препараты антител, обладающие вирусной безопасностью по отношению к оболочечным и безоболочечным вирусам, которые содержат, по меньшей мере, 15%, более предпочтительно, по меньшей мере, 20% уровень IgM, и которые обладают антикомплементарной активностью ≤1 CH₅₀/мг белка.

Препарат антитела по настоящему изобретению является пригодным для применения в медицине, и его можно применять для лечения иммунологических нарушений и инфекций, в частности, нарушения с дефицитом IgM и бактериальных инфекций. Обогащенный IgM человека препарат поливалентных иммуноглобулинов для внутривенного введения, который можно получать способом по настоящему изобретению, содержит более высокие титры антител против клинически значимых грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также более высокие титры антител против эндотоксинов грамотрицательных бактерий и экзотоксинов грамотрицательных и гра