Антигены вируса гриппа h1n1 с широким спектром активности, оптимизированные с применением вычислительных средств

Антигены вируса гриппа h1n1 с широким спектром активности, оптимизированные с применением вычислительных средств

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА HA РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/498800, поданной 20 июня 2011 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к оптимизированным белкам-гемагглютининам вируса гриппа, которые вызывают иммунный ответ с широким спектром активности в отношении изолятов вируса гриппа H1N1, и к их применению в качестве вакцин.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

	Вирус гриппа является представителем семейства Orthomyxoviridae. Существует три подтипа вирусов гриппа, обозначаемые как вирус гриппа A, вирус гриппа B и вирус гриппа C. Вирион вируса гриппа содержит геном, состоящий из сегментированной отрицательно-полярной нити РНК, которая кодирует следующие белки: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксный белок (M1), белок протонного канала (M2), нуклеопротеин (NP), основный белок полимеразного комплекса 1 (PB1), основный белок полимеразного комплекса 2 (PB2), кислый белок полимеразного комплекса (PA) и неструктурный белок 2 (NS2). Белки HA, NA, M1 и M2 являются белками, ассоциированными с мембраной, тогда как NP, PB1, PB2, PA и NS2 являются белками, ассоциированными с нуклеокапсидом. Белок М1 является наиболее распространенным белком в частицах вируса гриппа. Белки HA и NA являются гликопротеинами оболочки, которые отвечают за прикрепление вируса и проникновение вирусных частиц в клетку, а также являются источниками основных иммунодоминантных эпитопов для нейтрализации вируса и защитного иммунитета. Как белок HA, так и белок NA считаются наиболее важными компонентами профилактических вакцин против гриппа.
	Ежегодно сезонные вспышки гриппа являются причиной более 300000 случаев госпитализации и 36000 смертельных случаев только в США (Simonsen et al., Lancet Infect Dis 7:658-66, 2007). Появление нового вируса гриппа H1N1 в 2009 г. показало, насколько быстро пандемия нового вида гриппа может распространиться по всему миру.
	В настоящее время в США лицензированы два типа подходов к вакцинации против гриппа – применение инактивированной сплит-вакцины и применение вакцины на основе живого ослабленного вируса. Инактивированные вакцины могут эффективно индуцировать гуморальный иммунный ответ, но, как правило, вызывают только незначительный клеточный иммунный ответ. Вакцины на основе живого вируса не могут вводиться пациентам с ослабленным иммунитетом или беременным таковым в связи с имеющимся у них повышенным риском развития инфекции. Таким образом, существует потребность в вакцине против вируса гриппа, обладающей широким спектром защитной активности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

	В данном документе раскрывается создание оптимизированных полипептидов HA вируса гриппа H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром активности в отношении изолятов вируса гриппа H1N1. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего образования консенсусных последовательностей на основании строения определенных вирусов H1N1, выделенных с 1918 по 2011 гг.
	В данном документе обеспечиваются рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, имеющие оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром активности в отношении вируса гриппа H1N1. В некоторых вариантах осуществления полипептид HA содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида содержит не более 5, не более 6, не более 7, не более 8, не более 9 или не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления в полипептиде HA вируса гриппа отсутствует N-концевой метиониновый остаток.
	Молекулы выделенных нуклеиновых кислот и векторы, кодирующие рекомбинантные полипептиды HA, также обеспечиваются в настоящем раскрытии. Дополнительно обеспечиваются выделенные клетки, содержащие такие векторы.
	Также представлены вирусоподобные частицы (VLP), сходные с частицами вируса гриппа, и белки слияния, содержащие оптимизированные полипептиды HA, раскрытые в данном документе.
	Дополнительно представлены композиции, которые содержат оптимизированные полипептиды HA вируса гриппа, белки слияния или VLP, раскрытые в данном документе, в фармацевтически приемлемом носителе. Способы вызова иммунного ответа в отношении вируса гриппа у субъекта путем введения раскрываемых композиций, белков слияния или VLP также обеспечиваются в настоящем раскрытии.

Также представлены способы иммунизации субъекта против вируса гриппа путем введения субъекту композиции, содержащей VLP, которая содержит оптимизированный полипептид HA.

Вышеизложенные и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания, которое приводится со ссылкой на прилагаемые фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГУРА 1 представляет собой схематическое изображение способа, применяемого для образования консенсусной последовательности HA H1N1 в соответствии со cпособом 1.

ФИГУРА 2 представляет собой схематическое изображение способа, применяемого для образования консенсусной последовательности HA H1N1 в соответствии со способом 2.

ФИГУРА 3 представляет собой схематическое изображение способа, применяемого для образования консенсусной последовательности HA H1N1 в соответствии со способом 4.

ФИГУРА 4 представляет собой схематическое изображение способа, применяемого для образования консенсусной последовательности HA H1N1 в соответствии со способом 5.

ФИГУРА 5 представляет схематическое изображение способа, применяемого для образования консенсусной последовательности HA H1N1 в соответствии со способом 6.

ФИГУРА 6 представляет собой диаграмму, на которой изображены сывороточные титры антител, ингибирующих гемагглютинацию (HAI), индуцированные инфицированием мышей COBRA H1N1. У мышей, инфицированных COBRA VLP, сходных с частицами вируса гриппа H1N1, определяли сывороточные титры HAI-антител (COBRA, способ 1). Антисыворотку тестировали в отношении сезонного вируса гриппа H1N1 A/Новая Каледония/20/1999. Результаты представлены как трансформированное путем логарифмирования по основанию 2 среднее геометрическое значение титра (+S.E.M.) антисыворотки, отобранной на 3, 5, 8 и 12 неделе после инфицирования.

ФИГУРА 7 представляет собой результат вестерн-блоттинга, демонстрирующий экспрессию белка COBRA HA (консенсусная последовательность, способ 1). Белок COBRA HA H1N1 образовывался в результате трансляции in vitro, и лизаты культур клеток анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Дорожка 1, вирус A/Новая Каледония/20/1999; дорожка 2, секретируемый COBRA HA H1N1; дорожка 3, 5 мкг VLP, сходных с частицами H1N1, с COBRA; дорожка 4, 10 мкг VLP с COBRA. COBRA HA (дорожка 2) мигрирует соответственно его ожидаемому молекулярному весу, что подтверждает экспрессию синтетического белка.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

	Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с помощью стандартных буквенных обозначений для нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода для аминокислот, как определено в §1.822 главы 37 Свода федеральных нормативных актов США. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но подразумевается, что комплементарная цепь включена в документ посредством любой ссылки на указываемую цепь. В прилагаемом перечне последовательностей:
	SEQ ID NO: 1-11 являются аминокислотными последовательностями оптимизированных белков HA H1N1;
	SEQ ID NO: 12 является консенсусной аминокислотной последовательностью, образованной на основании сравнения оптимизированных белков HA H1N1;
	SEQ ID NO: 13 является последовательностью нуклеиновой кислоты, соответствующей HA H1N1, ген которого был подвергнут оптимизации кодонов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Сокращения

COBRA: антиген с широким спектром активности, оптимизированный с применением вычислительных средств

HA: гемагглютинин

HAI: ингибирование гемагглютинации

HRP: пероксидаза хрена

M1: матриксный белок 1

NA: нейраминидаза

PFU: бляшкообразующая единица

VLP: вирусоподобная частица

II. Термины и способы

Если не указано иное, технические термины используются согласно традиционному способу употребления. Определения часто используемых терминов в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, Genes V, опубликованном в Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (под ред.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованном в Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (под ред.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованном в VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Для того чтобы облегчить обзор различных вариантов осуществления настоящего раскрытия, представлены следующие объяснения конкретных терминов.

Адъювант. Вещество или среда, которые неспецифически усиливают иммунный ответ в отношении антигена. Адъюванты могут включать суспензию минеральных веществ (квасцы, гидроксид алюминия или фосфат алюминия), на которой адсорбируется антиген; или эмульсию типа “вода в масле”, в которой раствор антигена эмульгирован в минеральном масле (например, неполный адъювант Фрейнда), иногда с включением убитых микобактерий (полный адъювант Фрейнда) для дополнительного усиления антигенных свойств. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды (как, например, содержащие мотив CpG) можно также применять в качестве адъювантов (например, см. патенты США №№6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; 6339068; 6406705; и 6429199). Адъюванты также включают биологические молекулы, такие как костимулирующие молекулы. Иллюстративные биологические адъюванты включают IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L и 41 BBL.

Вводить. Как применяется в данном документе, введение композиции субъекту означает предоставление, нанесение или приведение композиции в контакт с субъектом. Введение может осуществляться любым из ряда путей, как, например, местный, пероральный, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подоболочечный и внутрикожный пути.

Антитело. Молекула иммуноглобулина, вырабатываемая B-лимфоцитами с определенной аминокислотной последовательностью. Выработка антител у людей или других животных происходит под действием специфического антигена (иммуногена). Антитела характеризуются специфической реакцией с антигеном, происходящей некоторым очевидным образом, при этом каждый из терминов “антитело” и “антиген” определен в отношении другого. Выражение “вызывать ответ с формированием антител” относится к способности антигена или другой молекулы индуцировать выработку антител.

Антиген. Соединение, композиция или вещество, которое может стимулировать выработку антител или Т-клеточный ответ у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые им. Антиген реагирует с продуктами специфических гуморальных или клеточных иммунных реакций, в том числе с таковыми, индуцируемыми гетерологичными иммуногенами. В некоторых вариантах осуществления раскрытых композиций и способов антиген представляет собой белок HA вируса гриппа.

Подвергнутый оптимизации кодонов. Термин “нуклеиновая кислота, подвергнутая оптимизации кодонов” относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая была изменена таким образом, что кодоны являются оптимальными для экспрессии в конкретной системе (такой как конкретный вид из группы видов). Например, нуклеотидная последовательность может быть оптимизирована для экспрессии в клетках млекопитающих. Оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка.

Белок слияния. Белок, образуемый путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, сконструированной из последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере часть двух различных (гетерологичных) белков. Для создания белка слияния последовательности нуклеиновых кислот должны находиться в одной той же рамке считывания и не содержать внутренних стоп-кодонов. Например, белок слияния содержит HA вируса гриппа, слитый с гетерологичным белком.

Гемагглютинин (HA). Поверхностный гликопротеин вируса гриппа. HA опосредует связывание вирусной частицы с клетками-хозяевами и последующее проникновение вируса в клетку-хозяина. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности многочисленных белков HA вируса гриппа известны в данной области техники и являются общедоступными, такие как депонированные в GenBank. HA (наряду с NA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Иммунный ответ. Ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Т-клетка, макрофаг или полиморфноядерный лейкоцит, на стимул, такой как антиген или вакцина. Иммунный ответ может затрагивать любую клетку тела, участвующую в защитной реакции организма-хозяина, включая, например, эпителиальную клетку, которая секретирует интерферон или цитокин. Иммунный ответ включает, но без ограничений, врожденный иммунный ответ или воспаление. Как применяется в данном документе, защитный иммунный ответ относится к иммунному ответу, который защищает субъекта от инфекции (предупреждает инфекцию или предупреждает развитие заболевания, ассоциированного с инфекцией). Способы оценивания иммунных ответов хорошо известны в данной области техники и включают, например, оценивание пролиферации и/или активности лимфоцитов (таких как B- или Т-клеток), секреции цитокинов или хемокинов, воспаления, выработки антител и т.п.

Иммуноген. Соединение, композиция или вещество, которое в соответствующих условиях способно стимулировать иммунный ответ, такой как выработка антител или Т-клеточный ответ, у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые им. Как применяется в данном документе, “иммуногенная композиция” представляет собой композицию, которая содержит иммуноген (например, полипептид HA).

Подвергать иммунизации. Предоставлять субъекту защиту от инфекционного заболевания, например, путем вакцинации.

Вирус гриппа. Вирус с сегментированной отрицательно-полярной нитью РНК, который принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа А инфицируют большое число видов птиц и млекопитающих, в том числе людей, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и кур. У животных большинство вирусов гриппа A вызывают локализованные инфекции дыхательных путей и кишечника в легкой форме. Тем не менее, высокопатогенные штаммы вируса гриппа A, такие как H5N1, вызывают системные инфекции домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. В 2009 г. вирус гриппа H1N1 был наиболее частой причиной заболевания людей гриппом. Новый штамм H1N1, происходящего от свиней, появился в 2009 г. и был объявлен пандемическим Всемирной организацией здравоохранения. Этот штамм был назван “вирусом свиного гриппа”. Вирусы гриппа A H1N1 также были причиной пандемии испанского гриппа в 1918 г., вспышки заболевания в Форт-Дикс в 1976 г. и эпидемии гриппа в России в 1977-1978 гг.

Выделенный. “Выделенный” биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота, белок или вирус) был практически отделен или очищен от других биологических компонентов (таких как клеточный дебрис или другие белки или нуклеиновые кислоты). Биологические компоненты, которые были “выделены”, включают компоненты, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Этот термин также охватывает рекомбинантные нуклеиновые кислоты, белки или вирусы (или VLP), а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты или пептиды.

Линкер. Одна или несколько аминокислот, которые служат в качестве спейсера между двумя полипептидами белка слияния.

Матриксный белок (M1). Структурный белок вируса гриппа, обнаруживаемый в оболочке вируса. Полагают, что M1 участвует в сборке и отпочковании.

Нейраминидаза (NA). Мембранный гликопротеин вируса гриппа. NA участвует в разрушении клеточного рецептора к HA вируса за счет отщепления концевых остатков сиаловой кислоты от углеводных фрагментов, расположенных на поверхности инфицированных клеток. NA также отщепляет остатки сиаловой кислоты от вирусных белков, предупреждая агрегацию вирусов. NA (наряду с HA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Функционально связанный. Первая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанный со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в том случае, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если этот промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и, при необходимости соединения двух областей, кодирующих белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Оптимизированный белок HA вируса гриппа. Как применяется в данном документе, “оптимизированный белок HA вируса гриппа” относится к консенсусной последовательности белка HA, образованной с помощью выравниваний последовательностей определенных вирусов H1N1, выделенных с 1918 по 2011 гг. (как описано в примере 1 ниже). Нуклеотидные последовательности, кодирующие оптимизированные белки HA, были (или могут быть) дополнительно оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих посредством оптимизации кодонов и оптимизации РНК (так, чтобы повысить стабильность РНК). Оптимизированные белки HA вируса гриппа, раскрываемые в данном документе (и приведенные в данном документе как SEQ ID NO: 1-11), также называют последовательностями “COBRA”. Оптимизированные полипептиды HA предназначены для того, чтобы вызывать у субъекта иммунный ответ с широким спектром активности. Применительно к настоящему раскрытию “с широким спектром активности” означает, что белковая последовательность вызывает такой иммунный ответ у субъекта, который является достаточным для ингибирования, нейтрализации или предупреждения инфицирования широким спектром вирусов гриппа (таких как большинство вирусов гриппа или все таковые в рамках определенного подтипа). В некоторых случаях оптимизированный белок HA вируса гриппа способен вызывать иммунный ответ, такой как защитный иммунный ответ, в отношении большинства изолятов вируса гриппа H1N1 или всех таковых.

Вспышка. Как применяется в данном документе, “вспышка” вируса гриппа относится к накоплению изолятов вируса внутри отдельной страны в определенный год.

Фармацевтически приемлемые среды. Фармацевтически приемлемые носители (среды), применимые в настоящем раскрытии, являются традиционными. В Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) описаны композиции и составы, пригодные для фармацевтической доставки одной или нескольких терапевтических композиций, таких как одна или несколько вакцин против гриппа, и дополнительных фармацевтических средств.

В целом, природа носителя будет зависеть от конкретного используемого способа введения. Например, составы для парентерального применения обычно содержат инъекционные жидкости, которые в качестве среды включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или т.п. В случае твердых композиций (например, в форме порошка, гранул, таблеток или капсул) обычные нетоксичные твердые носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической степени чистоты. Вводимые фармацевтические композиции в дополнение к биологически нейтральным носителям могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты и буферные средства, поддерживающие pH, и т.п., например, ацетат натрия или сорбитанмонолаурат.

Полипептид. Полимер, мономерами в котором являются аминокислотные остатки, соединенные друг с другом посредством амидных связей. Если аминокислоты представляют собой альфа-аминокислоты, можно применять L-оптический изомер или D-оптический изомер. Термины “полипептид” или “белок”, применяемые в данном документе, предназначены для охвата любой аминокислотной последовательности и включают модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. Термин “полипептид” конкретно предназначен для распространения на белки, встречающиеся в природе, а также полученные рекомбинантным или синтетическим путем. Термин “остаток” или “аминокислотный остаток” включает ссылку на аминокислоту, которая встроена в белок, полипептид или пептид.

Консервативные аминокислотные замены являются заменами, которые в случае их осуществления нарушают свойства исходного белка в наименьшей степени, то есть структура и в особенности функция белка сохраняются и существенно не изменяются вследствие таких замен. Примеры консервативных замен показаны ниже.

При консервативных заменах, как правило, сохраняется (a) структура полипептидного остова в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряд или гидрофобность молекулы в целевом сайте или (c) объем боковой цепи.

Замены, которые в общем, как ожидается, приведут к наибольшим изменениям свойств белка, будут неконсервативными, например, изменениями, при которых (а) гидрофильный остаток, например, серил или треонил, заменяется гидрофобным остатком, например, лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; (b) цистеин или пролин заменяется любым другим остатком, (с) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил, или гистидил, заменяется электроотрицательным остатком, например, глутамилом или аспартилом; или (d) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например, фенилаланин, заменяется остатком, который не имеет боковой цепи, например, глицином.

Предупреждение, лечение или уменьшение интенсивности заболевания. “Предупреждением” заболевания называется ингибирование полного развития заболевания. “Лечением” называется терапевтическое вмешательство, которое уменьшает интенсивность признака или симптома заболевания или патологического состояния после начала его развития. “Уменьшением интенсивности” называется снижение числа или уменьшение степени тяжести признаков или симптомов заболевания.

Промотор. Промотор представляет собой совокупность контрольных последовательностей нуклеиновых кислот, управляющих транскрипцией нуклеиновой кислоты. Промотор содержит необходимые последовательности нуклеиновых кислот, располагающиеся возле сайта инициации транскрипции. Промотор также необязательно содержит дистальные энхансерные или репрессорные элементы. “Конститутивный промотор” представляет собой промотор, который является постоянно активным и не подвергается регуляции внешними сигналами или молекулами. В отличие от этого, активность “индуцибельного промотора” регулируется внешними сигналами или молекулами (например, фактором транскрипции). В некоторых вариантах осуществления, представленных в данном документе, промотор представляет собой промотор CMV.

Очищенный. Термин “очищенный” не подразумевает абсолютную чистоту; его, скорее, предполагается использовать как относительный термин. Таким образом, например, очищенные пептид, белок, вирус, VLP или другое активное соединение представляют собой таковые, выделенные полностью или частично из белков и других примесей, которые в естественных условиях ассоциированы с ними. В некоторых вариантах осуществления термин “практически очищенный” относится к пептиду, белку, вирусу, VLP или другому активному соединению, выделенным из клетки, среды для культивирования клеток или другого неочищенного препарата и подвергнутым фракционированию для удаления различных компонентов из исходного препарата, таких как белки, клеточный дебрис и другие компоненты.

Рекомбинантный. Рекомбинантные нуклеиновая кислота, белок, вирус или VLP представляют собой таковые, содержащие последовательность, которая не встречается в природе, или содержащие последовательность, созданную путем искусственного объединения двух сегментов последовательности, которые в остальных случаях отделены друг от друга. Это искусственное объединение часто выполняют путем химического синтеза или, более часто, путем искусственного воздействия на выделенные сегменты нуклеиновых кислот, например, при помощи методик генной инженерии.

Идентичность последовательностей. Подобие между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот выражается в аспекте подобия между последовательностями, которое иначе называют идентичностью последовательностей. Идентичность последовательностей часто выражается в аспекте процентной идентичности (или подобия, или гомологии); чем выше процентное значение, тем более высоким является подобие двух последовательностей. Гомологи или варианты данного гена или белка будут обладать относительно высокой степенью идентичности последовательностей при выравнивании с применением стандартных способов.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; и Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Altschul et al., Nature Genet. 6:119-129, 1994.

Cредство поиска основного локального выравнивания (BLAST^TM) NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) доступно из нескольких источников, включая Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, Бетесда, Мэриленд) и Интернет, для применения вместе с программами анализа последовательностей blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx.

Субъект. Живые многоклеточные позвоночные организмы, категория, которая включает как человека, так и млекопитающих, отличных от человека, таких как приматы, отличные от человека.

Терапевтически эффективное количество. Количество определенного средства, достаточное для достижения желаемого эффекта у субъекта, подвергающегося лечению с помощью этого средства. Например, это может быть количеством вакцины против вируса гриппа, пригодным для вызова иммунного ответа у субъекта и/или предупреждения инфекции или заболевания, вызываемых вирусом гриппа. В идеале, применительно к настоящему раскрытию, терапевтически эффективным количеством вакцины против гриппа является количество, достаточное для повышения резистентности к инфекции, вызываемой вирусом гриппа, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, которое при этом не вызывает значительного цитотоксического эффекта у субъекта. Эффективное количество вакцины против гриппа, пригодное для повышения резистентности к инфекции, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, будет зависеть, например, от субъекта, подвергающегося лечению, способа введения терапевтической композиции и других факторов.

Трансформированный. Трансформированная клетка представляет собой клетку, в которую ввели молекулу нуклеиновой кислоты при помощи методик молекулярной биологии. Как применяется в данном документе, термин “трансформация” охватывает все методики, при помощи которых молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в такую клетку, в том числе трансфекцию с применением вирусных векторов, трансформацию с применением плазмидных векторов и введение “голой” ДНК путем электропорации, липофекции и ускорения частиц при помощи генной пушки.

Вакцина. Препарат на основе иммуногенного материала, способного стимулировать иммунный ответ, вводимый для предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения заболевания, такого как инфекционное заболевание. Иммуногенный материал может включать, например, ослабленные или убитые микроорганизмы (например, ослабленные вирусы) или антигенные белки, пептиды или ДНК, полученные из них. Вакцины могут вызвать как профилактический (предупредительный), так и терапевтический ответ. Способы введения варьируют в зависимости от вакцины, но могут включать прививку, проглатывание, ингаляцию или другие формы введения. Прививки могут производиться с помощью ряда различных путей, включая парентеральный, например, внутривенный, подкожный или внутримышечный. Вакцины можно вводить с адъювантом, чтобы форсировать иммунный ответ.

Вектор. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая позволяет производить вставку чужеродной нуклеиновой кислоты без нарушения способности вектора к репликации и/или интеграции в клетке-хозяине. Вектор может включать последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, например, точку начала репликации. Инсерционный вектор способен вставляться в нуклеиновую кислоту хозяина. Вектор может также содержать один или несколько селектируемых маркерных генов и других генетических элементов. Вектор экспрессии представляет собой вектор, содержащий необходимые регуляторные последовательности, позволяющие осуществлять транскрипцию и трансляцию вставленного гена или генов. В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия вектор кодирует белок HA, NA или М1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США № 2002/0106798; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

Вирусоподобная частица (VLP). Вирусные частицы, образованные одним или несколькими структурными белками вируса, но не имеющие вирусного генома. Поскольку VLP не имеют вирусного генома, они являются неинфекционными. Кроме того, VLP часто могут быть получены путем гетерологичной экспрессии и могут быть легко очищены. Большинство VLP содержат по меньшей мере сердцевинный вирусный белок, который управляет отпочкованием и высвобождением частиц из клетки-хозяина. Одним из примеров такого сердцевинного белка является M1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления, описываемых в данном документе, VLP, сходная с частицей вируса гриппа, содержит белки HA, NA и/или М1. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут быть получены путем трансфекции клеток-хозяев с помощью плазмид, которые кодируют белки HA и NA и необязательно белок М1. После инкубирования трансфицированных клеток в течение соответствующего периода времени, необходимого для обеспечения экспрессии белка (как, например, в течение приблизительно 72 часов), VLP можно выделять из надосадочной жидкости культуры клеток. В примере 2 приводится иллюстративный протокол очистки VLP, сходных с частицами вируса гриппа, от надосадочной жидкости культуры клеток. В этом примере VLP выделяют путем низкоскоростного центрифугирования (для удаления клеточного дебриса), вакуум-фильтрации и ультрацентрифугирования в 20% глицерине. Другие способы получения VLP, сходных с частицами вируса гриппа, известны в данной области техники (см., например, публикации заявки на патент США №№ 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769 и 2010/0239610).

Если не истолковывается иначе, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, что и обычно понимаемое средним специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Термины в единственном числе включают в себя определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Точно так же, слово “или” подразумевает включение слова “и”, если из контекста явно не следует иное. Поэтому “содержащий A или B” означает содержащий А, или В, или А и B. Дополнительно следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описываемым в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта в качестве контрольного документа будет выступать настоящее описание, включая пояснения терминов. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими.

III. Обзор некоторых вариантов осуществления

В данном документе раскрывается образование оптимизированных полипептидов HA вируса гриппа H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром активности в отношении вируса гриппа H1N1. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего образования консенсусных последовательностей на основании строения определенных вирусов H1N1, выделенных с 1918 по 2011 гг. Способы, применяемые для образования 11 консенсусных последовательностей HA, описаны в примере 1 и на фигурах 1-5. Аминокислотные последовательности 11 консенсусных полипептидов HA приведены в данном документе как SEQ ID NO: 1-11. Кроме того, аминокислотная консенсусная последовательность, образованная на основании сравнения SEQ ID NO: 1-11, представлена в данном документе как SEQ ID NO: 12.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, которые имеют оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром активности в отношении вируса гриппа H1N1. В некоторых вариантах осуществления полипептид HA содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11. В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида содержит не более 5, не более 6, не более 7, не более 8, не более 9 или не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.

В конкретных вариантах осуществления обеспечивается рекомбинантный полипептид HA вируса гриппа, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1; по меньшей мере на 99,2% идентичную SEQ ID NO: 2; по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 3; по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 4; по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 5; по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 6; по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 7; по меньшей мере на 99% ид