Мыши, у которых вырабатываются связывающие белки, содержащие vl-домены

Мыши, у которых вырабатываются связывающие белки, содержащие vl-домены

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Предоставляются подобные иммуноглобулинам белки, включающие константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина, а также связывающие белки, содержащие вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, слитый с константным доменом легкой цепи, и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, слитый с константным доменом тяжелой цепи. Также предоставляются клетки, экспрессирующие такие связывающие белки, мыши, у которых они вырабатываются, и имеющие к ним отношение способы и композиции.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитела обычно включают тетрамерную структуру, содержащую две идентичные тяжелые цепи, каждая из которых включает константную область тяжелой цепи (C_H), слитую с вариабельным доменом тяжелой цепи (V_H), и объединена с константной областью легкой цепи (C_L), слитой с вариабельным доменом легкой цепи (V_L). В случае типичного IgG человека размер молекулы антитела составляет от приблизительно 150 кДа до приблизительно 170 кДа (например, в случае IgG3, который включает более длинную шарнирную область), в зависимости от субкласса IgG (например, IgG1, IgG3, IgG4) и (варьирующей) длины вариабельной области.

В типичном антителе V_H- и V_L-домены объединяются с образованием сайта связывания, который связывает антиген-мишень.

По этой причине свойства антитела, касающиеся аффинности и специфичности, могут в значительной степени зависеть от характеристик V_H- и V_L-доменов. В типичных антителах у людей и у мышей V_H-домены соединяются в пары с V_L-доменами или λ, или κ. Однако также известно, что можно создать V_L-домены, которые специфически связывают антиген-мишень в отсутствие когнатного V_H-домена (например, V_H-домена, который в природе представлен в рамках антитела и объединяется с конкретным V_L-доменом), и что можно выделить V_H-домены, которые специфически связывают антиген-мишень в отсутствие когнатного V_L-домена. Таким образом, значительное разнообразие связывающих белков на основе иммуноглобулинов предоставляет, как правило, рекомбинация, приводящая к конкретному V_H или V_L (и соматической гипермутации, если она происходит), а также комбинация пары когнатных V_H/V_L-доменов. Была бы целесообразной разработка композиций и способов, в которых используются другие источники разнообразия.

В данной области техники существует необходимость в связывающих белках на основе структур иммуноглобулинов, включая вариабельные области иммуноглобулинов, такие как вариабельные области легких цепей, и включая связывающие белки, которые демонстрируют расширенное разнообразие по сравнению с традиционными антителами. Также существует необходимость в дополнительных способах и животных для выработки полезных связывающих белков, включая связывающие белки, которые включают разнообразные последовательности вариабельных областей легких цепей иммуноглобулинов. Также необходимы пригодные формы связывающих белков на основе иммуноглобулинов, которые обеспечивают расширенное многообразие связывающих белков, из которых выбирают, и расширенное многообразие вариабельных доменов иммуноглобулинов, в том числе композиции и способы для создания соматически мутированных и клонально отобранных вариабельных доменов иммуноглобулинов для использования, например, для создания терапевтических средств для человека.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте описываются связывающие белки, которые включают вариабельные домены иммуноглобулинов, которые происходят от вариабельных доменов легких цепей (т.е. каппа (κ) и/или лямбда (λ)) иммуноглобулинов, но не из вариабельных доменов тяжелых цепей полноразмерных иммуноглобулинов. Также предоставляются способы и композиции для выработки связывающих белков, включающие генетически модифицированных мышей.

В одном аспекте предоставляются конструкции нуклеиновых кислот, клетки, эмбрионы, мыши и способы для выработки белков, которые включают одну или более последовательностей вариабельных областей легких цепей κ и/или λ иммуноглобулинов и последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая белки, которые включают вариабельный домен легкой λ или κ человека и последовательность константной области тяжелой цепи человека или мыши.

В одном аспекте предоставляется мышь, содержащая кодирующий тяжелую цепь иммуноглобулина локус, включающий замену одного или более генных сегментов «variable region» (V_H), генных сегментов «diversity» тяжелой цепи (D_H) и генных сегментов «joining» тяжелой цепи (J_H) в эндогенном мышином локусе, кодирующем тяжелые цепи, одним или более генными сегментами вариабельной области легкой цепи (V_L) и одним или более генными сегментами «joining region» легкой цепи (J_L).

В одном аспекте предоставляется мышь, содержащая кодирующий тяжелые цепи иммуноглобулинов локус, включающий замену всех или по существу всех генных сегментов V_H, D_H и J_H одним или более генных сегментов V_L и одним или более генных сегментов J_L для образования последовательности генного сегмента V_L в эндогенном локусе, кодирующем тяжелые цепи (VL_H-локусе), причем VL_H-локус способен к рекомбинированию с эндогенным геном C_H мыши с образованием реаранжированного гена, который происходит от генного сегмента V_L, генного сегмента J_L и эндогенного гена C_H мыши.

В одном варианте осуществления сегменты V_L являются человеческими сегментами V_L. В одном варианте осуществления сегменты J_L являются человеческими сегментами J_L. В конкретном варианте осуществления сегменты V_L и J_L являются человеческими V_L- и J_L-сегментами.

В одном варианте осуществления все или по существу все генные сегменты V_H, D_H и J_H заменены по меньшей мере шестью генными сегментами Vκ человека и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. В одном варианте осуществления все или по существу все генные сегменты V_H, D_H и J_H заменены по меньшей мере 16 генными сегментами Vκ человека (Vκ человека) и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. В одном варианте осуществления все или по существу все генные сегменты V_H, D_H и J_H заменены по меньшей мере 30 генными сегментами Vκ человека и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. В одном варианте осуществления все или по существу все генные сегменты V_H, D_H и J_H заменены по меньшей мере 40 генными сегментами Vκ человека и по меньшей мере одним генным сегментом Jκ. В одном варианте осуществления по меньшей мере один генный сегмент Jκ включает два, три, четыре или пять генных сегментов Jκ человека.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты являются Vκ-сегментами человека. В одном варианте осуществления сегменты Vκ человека включают 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5 и 1-6. В одном варианте осуществления Vκ-сегменты включают 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16. В одном варианте осуществления Vκ-сегменты человека включают 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 и 2-30. В одном варианте осуществления Vκ-сегменты человека включают 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 и 2-40.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты являются Vκ-сегментами человека и включают 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15 и 1-16. В одном варианте осуществления Vκ-сегменты, кроме того, включают 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 и 2-30. В одном варианте осуществления Vκ-сегменты, кроме того, включают 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 и 2-40.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты являются Vλ-сегментами человека и включают фрагмент кластера A локуса, кодирующего легкие цепи λ человека. В конкретном варианте осуществления фрагмент кластера A локуса, кодирующего легкие цепи λ человека, простирается от hVλ3-27 до hVλ3-1 включительно.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты включают фрагмент кластера В локуса, кодирующего легкие цепи λ человека. В конкретном варианте осуществления фрагмент кластера В локуса, кодирующего легкие цепи λ человека, простирается от hVλ5-52 до hVλ1-40 включительно.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты включают последовательность для вариабельной области легкой цепи λ человека, которая включает геномный фрагмент кластера А и геномный фрагмент кластера B. В одном варианте осуществления последовательность для вариабельной области легкой цепи λ человека включает по меньшей мере один генный сегмент кластера A и по меньшей мере один генный сегмент кластера B.

В одном варианте осуществления сегменты V_L включают по меньшей мере один генный сегмент кластера B и по меньшей мере один генный сегмент кластера C.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты включают hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 и 3-12. В конкретном варианте осуществления V_L-сегменты включают непрерывную последовательность локуса, кодирующего легкие цепи λ, которая простирается от Vλ3-12 до Vλ3-1. В одном варианте осуществления непрерывная последовательность включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 hVλ. В конкретном варианте осуществления hVλ включают 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 и 3-12. В конкретном варианте осуществления hVλ включают непрерывную последовательность локуса, кодирующего легкие цепи λ, которая простирается от Vλ3-12 до Vλ3-1.

В одном варианте осуществления hVλ включают 13-28 или более hVλ. В конкретном варианте осуществления hVλ включают 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25 и 3-27. В конкретном варианте осуществления hVλ включают непрерывную последовательность локуса, кодирующего легкие цепи λ, которая простирается от Vλ3-27 до Vλ3-1.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты включают 29-40 hVλ. В конкретном варианте осуществления V_L-сегменты включают непрерывную последовательность локуса, кодирующего легкие цепи λ, которая простирается от Vλ3-29 до Vλ3-1, и непрерывную последовательность локуса, кодирующего легкие цепи λ, которая простирается от Vλ5-52 до Vλ1-40. В конкретном варианте осуществления все или по существу все последовательности между hVλ1-40 и hVλ3-29 у генетически модифицированной мыши по существу состоят из последовательности для λ человека размером приблизительно 959 п.о., обнаруживаемой в природе (например, в популяции людей), расположенной 3’ от генного сегмента hVλ1-40 (3’ от 3’ нетранслируемого участка), рестрикционного сайта (например, PI-SceI), за которым следует последовательность для λ человека размером приблизительно 3431 п.о., расположенная 5’ от генного сегмента hVλ3-29, обнаруживаемая в природе.

В одном варианте осуществления Jκ является Jκ человека и выбирается из группы, состоящей из Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 и их комбинации. В конкретном варианте осуществления Jκ включает с Jκ1 до Jκ5 включительно.

В одном варианте осуществления V_L-сегменты являются Vλ-сегментами человека, а генный сегмент Jκ включает RSS со спейсером из 12 п.о., причем RSS располагается непосредственно на 5’-конце генного сегмента Jκ. В одном варианте осуществления генные сегменты V_L являются Vλ человека, и VL_H-локус включает два или более генных сегментов Jκ, при этом каждый из них включает RSS со спейсером из 12 п.о., причем RSS располагается непосредственно на 5’-конце каждого генного сегмента Jκ.

В конкретном варианте осуществления V_L-сегменты включают следующие друг за другом генные сегменты κ человека, охватывающие локус κ человека от Vκ4-1 до Vκ2-40 включительно, а сегменты J_L включают следующие друг за другом генные сегменты, охватывающие локус κ человека от Jκ1 до Jκ5 включительно.

В одном варианте осуществления, в котором V_L-сегментами являются Vλ-сегменты, и между V_L-сегментами и J-сегментами не присутствует D_H-сегмент, V_L-сегменты фланкированы 3’ (т.е. соседствуют с 3’-конца с) имеющей спейсер из 23 п.о. RSS, а Jκ-сегменты, в случае их присутствия, или Jλ-фрагменты, в случае их присутствия, фланкированы 5’ (т.е. соседствуют с 5’-конца с) имеющей спейсер из 12 п.о. RSS.

В одном варианте осуществления, в котором генными сегментами V являются генные сегменты Vκ, и между генными сегментами V и генными сегментами J не присутствует D_H-сегмент, каждый из генных сегментов Vκ соседствует с 3’-конца с имеющей спейсер из 12 п.о. RSS, а каждый из сегментов Jκ, в случае их присутствия, или сегментов Jλ, в случае их присутствия, соседствует с 5’-конца с имеющей спейсер из 23 п.о. RSS.

В одном варианте осуществления мышь содержит реаранжированный ген, который происходит от генного сегмента V_L, генного сегмента J_L и эндогенного мышиного гена C_H. В одном варианте осуществления реаранжированный ген является соматически мутированным. В одном варианте осуществления реаранжированный ген включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более N-добавлений. В одном варианте осуществления число N-добавлений и/или соматических мутаций, отмечаемых в реаранжированном гене, происходящем от V_L-сегмента и J_L-сегмента, превышает в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раз или по меньшей мере в 5 раз число N-добавлений и/или соматических мутаций, отмечаемых в реаранжированном гене вариабельного домена легкой цепи (происходящем от того же генного сегмента V_L и того же генного сегмента J_L), который подвергается реаранжировке в эндогенном локусе для легких цепей. В одном варианте осуществления реаранжированный ген находится в B-клетке, которая специфически связывает представляющий интерес антиген, причем B-клетка связывает представляющий интерес антиген с K_D в низком наномолярном диапазоне или ниже (например, с K_D, составляющей 10 нМ или меньше). В конкретном варианте осуществления V_L-сегмент, J_L-сегмент или оба эти сегмента являются генными сегментами человека. В конкретном варианте осуществления V_L- и J_L-сегменты являются генными сегментами κ человека. В одном варианте осуществления мышиный ген C_H выбирают из IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В конкретном варианте осуществления мышиный IgG выбирают из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C и IgG3. В другом конкретном варианте осуществления мышиным IgG является IgG1.

В одном варианте осуществления мышь содержит B-клетку, в которой вырабатывается с локуса на хромосоме B-клетки связывающий белок, по существу состоящий из четырех полипептидных цепей, причем эти четыре полипептидных цепи по существу состоят из (a) двух идентичных полипептидов, которые включают эндогенную мышиную C_H-область, слитую с V_L; и (b) двух идентичных полипептидов, которые включают эндогенную мышиную C_L-область, слитую с V_L-областью, которая является когнатной по отношению к V_L-области, которая слита с мышиной C_H-областью и, в одном варианте осуществления, является V_L-областью человека (например, κ человека). В одном варианте осуществления V_L-областью, слитой с эндогенной C_H-областью, является V_L-область человека. В конкретном варианте осуществления V_L-областью человека, слитой с мышиной C_H-областью, является Vκ-область. В конкретном варианте осуществления V_L-область человека, слитая с мышиной C_H-областью, идентична V-области, кодируемой реаранжированной нуклеотидной последовательностью легкой цепи зародышевого типа человека. В конкретном варианте осуществления V_L-область человека, слитая с мышиной C_H-областью, включает две, три, четыре, пять, шесть или более соматических гипермутаций. В одном варианте осуществления V_L-область человека, слитая с мышиной C_H-областью, кодируется реаранжированным геном, который включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более N-добавлений.

В одном варианте осуществления по меньшей мере 50% всех молекул IgG, которые вырабатываются у мыши, включают полипептид, который включает С_Н-область изотипа IgG и V_L-область, причем длина указанного полипептида составляет не более 535, 530, 525, 520 или 515 аминокислот. В одном варианте осуществления по меньшей мере 75% всех молекул IgG включают полипептид, описанный в этом параграфе. В одном варианте осуществления по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% всех молекул IgG включают полипептид, описанный в этом параграфе. В конкретном варианте осуществления все молекулы IgG, которые вырабатываются у мыши, включают полипептид, длина которого не превышает длину полипептида, описанного в этом параграфе.

В одном варианте осуществления у мыши вырабатывается связывающий белок, включающий первый полипептид, который включает эндогенную мышиную C_H-область, слитую с вариабельным доменом, кодируемым реаранжированным генным сегментом V человека и генным сегментом J, но не генным сегментом D_H, и второй полипептид, который включает эндогенную мышиную C_L-область, слитую с V-доменом, кодируемым реаранжированным генным сегментом V человека и генным сегментом J, но не генным сегментом D_H, и связывающий белок специфически связывает антиген с аффинностью в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне. В одном варианте осуществления J-сегментом является J-сегмент человека (например, генный сегмент κ человека). В одном варианте осуществления V-сегментом человека является Vκ-сегмент человека. В одном варианте осуществления вариабельный домен, который слит с эндогенной мышиной C_H-областью, включает большее число соматических мутаций, чем вариабельная область, которая слита с эндогенной мышиной C_L-областью; в конкретном варианте осуществления вариабельная область, слитая с эндогенной мышиной C_H-областью, включает больше в приблизительно 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз или более соматических мутаций, чем V-область, слитая с эндогенной мышиной C_L-областью; в конкретном варианте осуществления V-область, слитая с мышиной C_H-областью, включает больше на по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 или более соматических мутаций, чем V-область, слитая с эндогенном мышиной C_L-областью. В одном варианте осуществления V-область, слитая с мышиной C_H-областью, кодируется реаранжированным геном, который включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более N-добавлений.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует связывающий белок, включающий первый вариабельный домен легкой цепи (V_L1), слитый с последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, и второй вариабельный домен легкой цепи (V_L2), слитый с константной областью легкой цепи иммуноглобулина, причем V_L1 включает число соматических гипермутаций, которое превышает в приблизительно 1,5 -приблизительно 5 раз число соматических гипермутаций, присутствующих в V_L2. В одном варианте осуществления число соматических гипермутаций в V_L1 больше в приблизительно 2 - приблизительно 4 раза, чем в V_L2. В одном варианте осуществления число соматических гипермутаций в V_L1 больше в приблизительно 2 - приблизительно 3 раза, чем в V_L2. В одном варианте осуществления V_L1 кодируется последовательностью, которая включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более N-добавлений.

В одном аспекте предоставляется генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует иммуноглобулин, который по существу состоит из следующих полипептидов: одних двух идентичных полипептидов, каждый из которых по существу состоит из C_H-области, слитой с вариабельным доменом, который происходит от генных сегментов, которые по существу состоят из генного сегмента V_L и генного сегмента J_L, и других двух идентичных полипептидов, каждый из которых по существу состоит из C_L-области, слитой с вариабельным доменом, который происходит от генных сегментов, которые по существу состоят из сегмента V_L и сегмента J_L.

В конкретном варианте осуществления два идентичных полипептида, которые содержат C_H-область, содержат мышиную C_H-область.

В конкретном варианте осуществления два идентичных полипептида, которые содержат C_L-область, содержат мышиную C_L-область.

В одном варианте осуществления вариабельным доменом, слитым с C_L-областью, является вариабельный домен, который является когнатным по отношению к вариабельному домену, слитому с C_H-областью.

В одном варианте осуществления вариабельный домен, который слит с эндогенной мышиной C_H-областью, включает большее число соматических гипермутаций, чем вариабельный домен, который слит с эндогенной мышиной C_L-областью; в конкретном варианте осуществления вариабельный домен, слитый с эндогенной мышиной C_H-областью, включает больше в приблизительно 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 раз или более соматических гипермутаций, чем вариабельный домен, слитый с эндогенной мышиной C_L-областью. В одном варианте осуществления вариабельный домен, слитый с эндогенной мышиной C_L-областью, кодируется геном, который включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более N-добавлений.

В одном варианте осуществления один или более V-сегментов и J-сегментов являются генными сегментами человека. В конкретном варианте осуществления как V-сегменты, так и J-сегменты являются генными сегментами κ человека. В другом конкретном варианте осуществления как V-сегменты, так и J-сегменты являются генными сегментами λ человека. В одном варианте осуществления V-сегменты и J-сегменты независимо выбирают из генных сегментов κ человека и λ человека. В конкретном варианте осуществления V-сегментами являются Vκ-сегменты, а J-сегментами являются Jλ-сегменты. В другом конкретном варианте осуществления V-сегментами являются Vλ-сегменты, а J-сегментами являются Jκ-сегменты.

В одном варианте осуществления одним или более вариабельных доменов, слитых с C_L-областью, и вариабельных доменов, слитых с C_H-областью, являются вариабельные домены человека. В конкретном варианте осуществления вариабельными доменами человека являются Vκ-домены человека. В другом конкретном варианте осуществления вариабельными доменами человека являются Vλ-домены человека. В одном варианте осуществления домены человека независимо выбирают из человеческих Vκ- и Vλ-доменов. В конкретном варианте осуществления вариабельным доменом человека, слитым с C_L-областью, является Vλ-домен человека, а вариабельным доменом человека, слитым с C_H-областью, является Vκ-домен человека. В другом варианте осуществления вариабельным доменом человека, слитым с C_L-областью, является Vκ-домен человека, а вариабельным доменом человека, слитым с C_H, является Vλ-домен человека.

В одном варианте осуществления генный сегмент V_L одних двух идентичных полипептидов выбирают из Vλ-сегмента человека и Vκ-сегмента человека. В одном варианте осуществления V_L-сегмент других двух идентичных полипептидов выбирают из Vλ-сегмента человека и Vκ-сегмента человека. В конкретном варианте осуществления V_L-сегментом одних двух идентичных полипептидов является Vκ-сегмент человека, а V_L-сегмент других двух идентичных полипептидов выбирают из Vκ-сегмента человека и Vλ-сегмента человека. В конкретном варианте осуществления V_L-сегментом одних двух идентичных полипептидов является Vλ-сегмент человека, а V_L-сегмент других двух идентичных полипептидов выбирают из Vλ-сегмента человека и Vκ-сегмента человека. В конкретном варианте осуществления V_L-сегментом человека одних двух идентичных полипептидов является Vκ-сегмент человека, и V_L-сегментом человека других двух идентичных полипептидов является Vκ-сегмент человека.

В одном варианте осуществления IgG мыши включает связывающий белок, вырабатываемый в ответ на антиген, причем связывающий белок включает полипептид, который по существу состоит из вариабельного домена и C_H-области, причем вариабельный домен кодируется нуклеотидной последовательностью, которая по существу состоит из реаранжированного V_L-сегмента и реаранжированного J-сегмента, и связывающий белок специфически связывает эпитоп антигена с K_D в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне.

В одном аспекте предоставляется мышь, у которой все или по существу все IgG, вырабатываемые ею в ответ на антиген, включают тяжелую цепь, которая включает вариабельный домен, причем вариабельный домен кодируется реаранжированным геном, происходящим от генных сегментов, которые по существу состоят из генного сегмента V и генного сегмента J. В одном варианте осуществления реаранжированный ген включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более N-добавлений.

В одном варианте осуществления V-сегментом является V_L-сегмент. В одном варианте осуществления легкую цепь выбирают из легкой цепи κ и легкой цепи λ. В конкретном варианте осуществления легкой цепью является легкая цепь κ. В конкретном варианте осуществления V-сегментом является V-сегмент человека. В конкретном варианте осуществления V-сегментом является Vκ-сегмент человека, а J-сегментом является Jκ-сегмент человека.

В одном варианте осуществления J-сегментом является J_L-сегмент. В одном варианте осуществления легкую цепь выбирают из легкой цепи κ и легкой цепи λ. В конкретном варианте осуществления легкой цепью является легкая цепь κ. В конкретном варианте осуществления J-сегментом является J-сегмент человека. В другом варианте осуществления J-сегментом является J_H-сегмент. В конкретном варианте осуществления тяжелой цепью является тяжелая цепь мышиного происхождения. В другом конкретном варианте осуществления тяжелая цепь происходит от человека.

В одном варианте осуществления вариабельный домен тяжелой цепи, который создан на основе не более чем V-сегмента и J-сегмента, является соматически мутированным вариабельным доменом.

В одном варианте осуществления вариабельный домен тяжелой цепи, который создан на основе не более чем V-сегмента и J-сегмента, слит с мышиной C_H-областью.

В конкретном варианте осуществления все или по существу все IgG, вырабатываемые у мыши в ответ на антиген, включают вариабельный домен, который происходит от не более чем одного V-сегмента человека и не более чем одного J-сегмента человека, и вариабельный домен слит с константной областью IgG мыши, и IgG, кроме того, включает легкую цепь, которая включает V_L-домен человека, слитый с C_L-областью мыши. В конкретном варианте осуществления V_L-домен, слитый с C_L-областью мыши, происходит от Vκ-сегмента человека и Jκ-сегмента человека. В конкретном варианте осуществления V_L-домен, слитый с C_L-областью мыши, происходит от Vλ-сегмента человека и Jλ-сегмента человека.

В одном аспекте предоставляется мышь, у которой вырабатывается IgG, включающий первый CDR3 в полипептиде, включающем C_H-область, и второй CDR3 в полипептиде, включающем C_L-область, причем каждый и первый CDR3, и второй CDR3 независимо происходит от не более чем двух генных сегментов, причем два генных сегмента по существу состоят из генного сегмента V_L и генного сегмента J_L. В одном варианте осуществления CDR3 в полипептиде, включающем C_H-область, включает последовательность, которая происходит от нуклеотидной последовательности CDR3, включающей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 или более N-добавлений.

В одном варианте осуществления V_L-сегмент и J_L-сегмент являются генными сегментами человека. В одном варианте осуществления V_L-сегмент и J_L-сегмент являются генными сегментами κ. В одном варианте осуществления V_L-сегмент и J_L-сегмент являются генными сегментами λ.

В одном аспекте предоставляется мышь, у которой вырабатывается IgG, включающий первый CDR3 в первом полипептиде, включающем C_H-область, и второй CDR3 во втором полипептиде, включающем C_L-область, причем каждый и первый CDR3, и второй CDR3 включает последовательность аминокислот, в которой более чем 75% аминокислот происходят от генного сегмента V. В одном варианте осуществления CDR3 в полипептиде, включающем C_H-область, включает последовательность, которая происходит от нуклеотидной последовательности CDR3, включающей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 или более N-добавлений.

В одном варианте осуществления более чем 80%, более чем 90% или более чем 95% аминокислот первого CDR3 и более чем 80%, более чем 90% или более чем 95% аминокислот второго CDR3 происходят от V_L-сегмента.

В одном варианте осуществления не более чем две аминокислоты первого CDR3 происходят от генного сегмента, отличного от V_L-сегмента. В одном варианте осуществления не более чем две аминокислоты второго CDR3 происходят от генного сегмента, отличного от V_L-сегмента. В конкретном варианте осуществления не более чем две аминокислоты первого CDR3 и не более чем две аминокислоты второго CDR3 происходят от генного сегмента, отличного от V_L-сегмента. В одном варианте осуществления CDR3 IgG не включает аминокислотную последовательность, происходящую от генного сегмента D. В одном варианте осуществления CDR3 первого полипептида не включает последовательность, происходящую от D-сегмента.

В одном варианте осуществления V-сегментом является генный сегмент V человека. В конкретном варианте осуществления V-сегментом является генный сегмент Vκ человека.

В одном варианте осуществления первый и/или второй CDR3 содержат по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть соматических гипермутаций. В одном варианте осуществления первый CDR3 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более N-добавлений.

В одном варианте осуществления первый CDR3 по существу состоит из аминокислот, происходящих от генного сегмента V_L человека и генного сегмента J_L человека, и второй CDR3 по существу состоит из аминокислот, происходящих от генного сегмента V_L человека и генного сегмента J_L человека. В одном варианте осуществления первый CDR3 происходит от последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более N-добавлений. В одном варианте осуществления первый CDR3 происходит от не более чем двух генных сегментов, причем не более чем двумя генными сегментами являются генный сегмент Vκ человека и генный сегмент Jκ; и второй CDR3 происходит от не более чем двух генных сегментов, причем не более чем двумя генными сегментами являются генный сегмент Vκ человека и генный сегмент J, выбираемый из Jκ-сегмента человека, Jλ-сегмента человека и J_H-сегмента человека. В одном варианте осуществления первый CDR3 происходит от не более чем двух генных сегментов, причем не более чем двумя генными сегментами являются Vλ-сегмент человека и J-сегмент, выбираемый из Jκ-сегмента человека, Jλ-сегмента человека и J_H-сегмента человека.

В одном аспекте предоставляется мышь, у которой вырабатывается IgG, который не содержит аминокислотную последовательность, происходящую от генного сегмента D_H, причем IgG включает первый полипептид, содержащий первый V_L-домен, слитый с мышиной C_L-областью, и второй полипептид, содержащий второй V_L-домен, слитый с мышиной C_H-областью, при этом первый V_L-домен и второй V_L-домен не являются идентичными. В одном варианте осуществления первый и второй V_L-домены происходят от различных V-сегментов. В другом варианте осуществления первый и второй V_L-домены происходят от различных J-сегментов. В одном варианте осуществления первый и второй V_L-домены происходят от идентичных V- и J-сегментов, причем второй V_L-домен включает большее число соматических гипермутаций, чем первый V_L-домен.

В одном варианте осуществления первый и второй V_L-домены независимо выбирают из V_L-доменов человека и мыши. В одном варианте осуществления первый и второй V_L-домены независимо выбирают из Vκ- и Vλ-доменов. В конкретном варианте осуществления первый V_L-домен выбирают из Vκ-домена и Vλ-домена, а вторым V_L-доменом является Vκ-домен. В другом конкретном варианте осуществления Vκ-доменом является Vκ-домен человека.

В одном аспекте предоставляется мышь, у которой все или по существу все IgG, вырабатываемые ею, по существу состоят из легкой цепи, содержащей первый V_L-домен человека, слитый с мышиным C_L-доменом, и тяжелой цепи, содержащей второй V_L-домен человека, слитый с мышиным C_H-доменом.

В одном варианте осуществления V_L-доменом человека, слитым с мышиным C_H-доменом, является Vκ-домен человека.

В одном варианте осуществления первый и второй V_L-домены человека не являются идентичными.

В одном аспекте предоставляется мышь, у которой по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или приблизительно 100% иммуноглобулинов G, вырабатываемые у нее, по существу состоят из димера (a) первого полипептида, который по существу состоит из V_L-домена иммуноглобулина и C_L-области иммуноглобулина, и (b) второго полипептида длиной не более чем 535 аминокислот, причем второй полипептид по существу состоит из C_H-области и V-домена, в котором отсутствует последовательность, происходящая от генного сегмента D_H.

В одном варианте осуществления длина второго полипептида составляет приблизительно 435-535 аминокислот. В конкретном варианте осуществления длина второго полипептида составляет приблизительно 435-530 аминокислот. В конкретном варианте осуществления длина второго полипептида составляет приблизительно 435-525 аминокислот. В конкретном варианте осуществления длина второго полипептида составляет приблизительно 435-520 аминокислот. В конкретном варианте осуществления длина второго полипептида составляет приблизительно 435-515 аминокислот.

В одном варианте осуществления в приблизительно 90% или более IgG, вырабатываемых у мыши, второй полипептид имеет длину, составляющую не более чем приблизительно 535 аминокислот.

В одном варианте осуществления в приблизительно 50% или более IgG, вырабатываемых у мыши, второй полипептид имеет длину, составляющую не более чем приблизительно 535 аминокислот. В одном варианте осуществления в приблизительно 50% или более IgG, вырабатываемых у мыши, второй полипептид имеет длину, составляющую не более чем приблизительно 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455 или 450 аминокислот. В одном варианте осуществления приблизительно 60%, 70%, 80%, 90% и 95% или более IgG, вырабатываемых у мыши, имеют указанную длину. В конкретном варианте осуществления все или по существу все IgG, вырабатываемых у мыши, имеют указанную длину.

В одном варианте осуществления V-доменом второго полипептида является V_L-домен. В конкретном варианте осуществления V-домен второго полипептида выбирают из Vκ- и Vλ-домена. В конкретном варианте осуществления V-доменом второго полипептида является Vκ- или Vλ-домен человека.

В одном аспекте предоставляется мышь, которая экспрессирует с нуклеотидной последовательности в ее зародышевых клетках полипептид, который включает вариабельную последовательность легкой цепи (например, V- и/или J-последовательность), D_H-последовательность и константную область тяжелой цепи.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует полипептид с эндогенного мышиного локуса, кодирующего тяжелые цепи, который включает замену всех или по существу всех функциональных эндогенных мышиных генных сегментов, используемых при образовании генов вариабельных областей тяжелых цепей, множеством генных сегментов человека в эндогенном мышином локусе, кодирующем тяжелые цепи.

В одном варианте осуществления полипептид включает последовательность V_L, происходящую от генного сегмента Vλ или Vκ, полипептид включает CDR3, происходящий от генного сегмента D_H, и полипептид включает последовательность, происходящую от генного сегмента J_H, или Jλ, или Jκ.

В одном варианте осуществления мышь включает эндогенный мышиный локус, кодирующий тяжелые цепи иммуноглобулинов, включающий замену всех функциональных генных сегментов V_H одним или более генных сегментов Vλ человека, причем с каждым из одного или более Vλ-сегментов человека соседствует с 3’-конца имеющая спейсер из 23 п.о. сигнальная последовательность, по которой происходит рекомбинация, (RSS), причем сегменты Vλ функционально связаны с D_H-сегментом человека и мыши, с которым соседствует 5’ и 3’ имеющая спейсер из 12 п.о. RSS; сегмент D_H функционально связан с J-сегментом, который соседствует 5’ с имеющей спейсер из 23 п.о. RSS, которая является подходящей для рекомбинирования с имеющей спейсер из 12 п.о. RSS, с которой соседствует D_H-сегмент; причем сегменты V, D_H и J функционально