Инсектицидные белки

Инсектицидные белки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Данное изобретение относится к областям белковой инженерии, молекулярной биологии растений и борьбы с вредителями. Более конкретно, данное изобретение относится к новым сконструированным белкам Cry1Ba и последовательностям нуклеиновых кислот, чья экспрессия дает в результате сконструированные Cry1Ba белки, и способам получения, и способам применения сконструированных Cry1Ba белков и соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот для борьбы с насекомыми.

ПРЕДПОСЫЛКИ

[0002] Bacillus thuringiensis (Bt) белки Cry (также именуемые δ-эндотоксинами или Cry-токсинами) представляют собой белки, которые образуют кристаллический матрикс в Bacillus, которые, как известно, обладают инсектицидной активностью, когда поглощаются определенными насекомыми. Более 180 белков голотипа Cry в 58 семействах были определены и получили название. Различные белки Cry были классифицированы на основании их спектра активности и гомологии последовательности. До 1990 года, основные классы были определены с помощью их спектра активности (Hofte and Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255), но совсем недавно была разработана новая номенклатура, которая систематически классифицирует белки Cry на основе гомологии аминокислотной последовательности, а не целевых специфичностей по отношению к насекомым (Crickmore et al. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813).

[0003] Большинство Cry белков, активных против чешуекрылых насекомых, формируются в кристаллическом матриксе как 130-140 кДа протоксина. У чешуекрылых насекомых щелочной рН кишки солюбилизирует кристалл и затем кишечные протеазы обрабатывают протоксин до токсичных белков приблизительно 60-70 кДа. Процессинг протоксина до токсина, как сообщалось, происходит путем удаления как N-, так и C-концевых аминокислот, причем точное положение процессинга зависит от специфического Cry белка и соответствующих специфических кишечных соков насекомого (Ogiwara et al., 1992, J. Invert. Pathol. 60:121-126). Протеолитическая активация Cry протоксина может играть существенную роль в определении его специфичности.

[0004] Была установлена трехмерная структура для некоторых Cry белков. Cry3A белок, который активен по отношению к жесткокрылым насекомым, имеет три структурных домена: N-концевой домен I из остатков 58-290 состоит из 7 альфа-спиралей, домен II из остатков 291-500 содержит три складчатых бета-слоя в так называемой конформации греческого ключа, и C-концевой домен III из остатков 501-644 является бета-сэндвичем в так называемой конформации типа "jelly roll". Была также установлена трехмерная структура для активного Cry1Aa токсина чешуекрылых (Grochulski et al., 1995, J. Mol. Biol. 254:447-464). Cry1Aa токсин также имеет три домена: N-концевой домен I из остатков 33-253, домен II из остатков 265-461 и домен III из остатков 463-609 с дополнительной внешней цепью в одном из β-листов, сформированной остатками 254-264. Если Cry3A и Cry1Aa структуры спроецировать на другие Cry1 последовательности, то домен I начинается с приблизительно аминокислотного остатка 28 до 260, домен II с приблизительно 260 до 460 и домен III с приблизительно 460 до 600. См. Nakamura et al., Agric. Biol. Chem. 54(3):715-724 (1990); Li et al., Nature 353:815-821 (1991); Ge et al., J. Biol. Chem. 266(27):17954-17958 (1991); и Honee et al., Mol. Microbiol. 5(11):2799-2806 (1991); каждая из которых включена в данный документ ссылкой. Таким образом, на данный момент известно, что на основе гомологии аминокислотной последовательности все Bt белки Cry имеют подобную трехмерную структуру, содержащую три домена.

[0005] На основе структуры была сформулирована гипотеза, касающаяся взаимосвязи структуры/функции Cry белков. В целом, считается, что домен I, наибольший N-концевой домен, в первую очередь отвечает за образование пор в кишечной мембране насекомого (Gazit & Shai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816-2820), домен II в первую очередь отвечает за взаимодействие с кишечным рецептором, таким образом, определяя специфичность токсина (Ge et al., 1991, J. Biol. Chem. 32:3429-3436) и домен III, наибольший C-концевой домен, наиболее вероятно связан с белковой стабильностью (Li et al. 1991, выше), а также оказывает регуляторное влияние на активность ионного канала (Chen et al., 1993, PNAS 90:9041-9045). Домен III также был вовлечен в определение специфичности (Патент США №6204246, включенный в данный документ ссылкой). Обмен доменом III между активными против чешуекрылых токсинами, например, с помощью in vivo рекомбинации между кодирующими участками, может привести к изменениям в специфической активности. Эксперименты по связыванию с использованием таких гибридов показали, что домен III участвует в связывании с предполагаемыми рецепторами целевых насекомых, подтверждая, что домен III может иметь некоторое влияние на специфичность, играя роль в распознавании рецептора.

[0006] Части токсина Bt Cry белков также характеризуются наличием пяти консервативных блоков в их аминокислотной последовательности (Hofte & Whiteley, выше). Консервативный блок 1 (СВ1) содержит приблизительно 29 аминокислот. Консервативный блок 2 (СВ2) содержит приблизительно 67 аминокислот. Консервативный блок 3 (СВ3) содержит приблизительно 48 аминокислот. Консервативный блок 4 (СВ4) содержит приблизительно 10 аминокислот. Консервативный блок 5 (СВ5) содержит приблизительно 12 аминокислот. Последовательности до и после этих пяти консервативных блоков являются высоко вариабельными и, таким образом, обозначаются как "вариабельные области" V1-V6. Домен I Bt Cry белка типично содержит C-концевую часть вариабельной области 1, полный консервативный блок 1, целую вариабельную область 2, и 52 N-концевых аминокислоты консервативного блока 2. Домен II типично содержит приблизительно 15 C-концевых аминокислот консервативного блока 2, вариабельную область 3 и приблизительно 10 N-концевых аминокислот консервативного блока 3. Домен III типично содержит приблизительно 38 C-концевых аминокислот консервативного блока 3, вариабельную область 4, консервативный блок 4, вариабельную область 5 и консервативный блок 5. Активные в отношении чешуекрылых токсины Cry1, среди прочих белков Cry, имеют вариабельную область 6 с приблизительно 1-3 аминокислотами, лежащими в домене III.

[0007] Некоторые белки Cry, например Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry2Ba были экспрессированы в трансгенных сельскохозяйственных растениях и коммерчески использованы для борьбы с определенными вредителями-чешуекрылыми насекомыми. Например, трансгенные гибриды кукурузы, экспрессирующие белок Cry1Ab, были коммерчески доступны в течение 10 лет. Белок Cry1Ab в этих гибридах кукурузы нацелен в первую очередь на кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), основного чешуекрылого вредителя в Кукурузном поясе США.

[0008] Один вопрос, возникший относительно широкого использования трансгенных сельскохозяйственных культур, экспрессирующих белок Cry, состоит в том, будут ли насекомые-вредители становиться устойчивыми к белку Cry. Насекомые, как было доказано, способны к развитию устойчивости к продуктам, содержащим белок Cry. Устойчивость у моли капустной (Plutella xylostella) и других вредителей овощей к коммерческим Bt-микробным опрыскиваниям, широко используемым в органическом земледелии, развилась в нескольких областях мира. Один недавний случай полевой устойчивости в популяции совки травяной (Spodoptera frugiperda), подвергнутой действию трансгенной кукурузы, экспрессирующей белок Cry1F, был зафиксирован документально на острове Пуэрто-Рико (Storer et al. 2010. J. Econ. Entomol. 103:1031-1038). Однако в Соединенных Штатах не было случаев неудач, связанных с устойчивыми полевыми популяциями кукурузных или хлопковых вредителей, подвергнутых действию трансгенных сельскохозяйственных культур с 1996, когда были впервые внедрены трансгенные сельскохозяйственные культуры, экспрессирующие белки Cry.

[0009] Промышленное семеноводство, университетские исследователи и Управление охраны окружающей среды США работали вместе над разработкой планов управления, чтобы помочь уменьшить возникновение устойчивости насекомых. Они основываются, в первую очередь, на стратегии высокой дозы и стратегии заказников. Стратегия высокой дозы для кукурузного мотылька у кукурузы, например, состоит в применении гибридов кукурузы, которые экспрессируют достаточно высокие уровни белка Cry, чтобы уничтожить даже частично устойчивых мотыльков кукурузных. Гипотеза, лежащая в основе этого, состоит в том, что уничтожение частично устойчивых ЕСВ (мотыльков кукурузных) и предупреждение их спаривания значительно замедляет развитие устойчивости. Успех стратегии высокой дозы зависит частично от специфической активности Cry-токсина в отношении кукурузного мотылька и того, как много этого Cry-токсина может быть экспрессировано в трансгенном растении кукурузы. Например, чем более высокая специфическая активность Cry-токсина в отношении вредителя, тем меньшее количество Cry-токсина должно экспрессироваться в трансгенном растении для достижения стратегии высокой дозы. Благодаря тому, что Cry1Ab является очень токсичным для личинок кукурузного мотылька (т.е. высокая специфическая активность), уровни экспрессии Cry1Ab, которые достигаются в трансгенных растениях, легко помещают такие гибриды кукурузы в категорию высокой дозы.

[0010] Другие возможные пути снизить развитие устойчивости включают постепенное увеличение содержания различных белков Cry в одном и том же трансгенном сельскохозяйственном растении или замещение существующих готовых продуктов новыми продуктами, которые продуцируют различные белки Cry. Например, как только устаревает рынок существующих кукурузных гибридов Cry1Ab, могут быть введены новые продукты, которые имеют белки Cry, отличные от Cry1Ab или другие белки Cry в дополнение к Cry1Ab. Предпочтительно, если белки, которые замещают Cry1Ab, будут иметь такую же или сходную специфическую активность против кукурузного мотылька, как и Cry1Ab.

[0011] Одним возможным Cry-токсином для замещения Cry1Ab может быть Cry1Ba-токсин. Голотипический Cry1Ba-токсин был впервые описан Brizzard et al. в 1988 (Nuc. Acids Res. 16:2723-2724). Впоследствии, были определены пять других Cry1Ba-токсинов, причем каждый имеет около 99% идентичность с голотипическим токсином. Cry1Ba-токсины, как сообщалось, обладают активностью в отношении определенных чешуекрылых вредителей, таких как белянка капустная (Pieris brassicae), моль капустная (Plutella xylostella), египетская совка (Spodoptera littoralis), совка малая (Spodoptera exigua) и кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis). Однако Cry1Ba, как сообщалось, является более чем в 2 раза менее активным в отношении кукурузного мотылька, чем Cry1Ab (См., например, патент США №5628995) и сообщалось, что он не имеет активности в отношении других основных кукурузных вредителей, например, гусеницы хлопковой совки (Helicoverpa zea) (См., например, Karim et al. 2000. Pestic. Biochem. Physiol. 67:198-216) и NAFTA-популяций совки травяной (Spodoptera frugiperda) (см., например, Monnerat et al. 2006. Appl. Environ. Microbiol. 72:7029-7035). Одной из причин того, что Cry1Ba является не таким активным как Cry1Ab в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька, может быть его более низкая растворимость. Таким образом, существует необходимость улучшить специфическую активность Cry1Ba в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька и, по возможности, расширить спектр его активности для повышения его потенциала в качестве заместителя Cry1Ab в трансгенной кукурузе.

[0012] Спектр инсектицидной активности отдельного Cry-токсина из Bt может быть достаточно узким, при этом данный Cry-токсин является активным только в отношении некоторых видов в пределах порядка. Например, белок Cry3A известен как очень токсичный для колорадского жука, Leptinotarsa decemlineata, но имеет очень низкую или вообще не токсичен для родственных жуков в роду Diabrotica (Johnson et al., 1993, J. Econ. Entomol. 86:330-333). К тому же небольшие изменения в аминокислотной последовательности в пределах класса белков Cry могут повлиять на инсектицидную активность. Например, von Tersch et al. (1991, Appl. Environ. Microbiol. 57:349-358) показал, что белки Cry1Ac, варьирующие по семи аминокислотам, показали существенные отличия в их спектре инсектицидной активности. Хотя рассматриваются в первую очередь активные в отношении чешуекрылых токсины, Cry1Ba-токсины, как было также показано, являются активными в отношении определенных жесткокрылых насекомых-вредителей, включая колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), листоеда тополевого (Chrysomela scripta) и жука кофейного (Hypothenemus hampei).

[0013] Специфичность белков Cry является результатом эффективности различных этапов, вовлеченных в производство активного белка токсина и его последующего взаимодействия с эпителиальными клетками в средней кишке насекомого. Чтобы быть инсектицидными, большинство известных белков Cry должны сначала быть поглощенными насекомым и протеолитически активироваться для образования активного токсина. Активация инсектицидных кристаллических белков является многоэтапным процессом. После попадания внутрь кристаллы должны вначале быть солюбилизированы в кишке насекомого. После их солюбилизации белки Cry активируются специфическими протеолитическими отщеплениями. Протеазы в кишке насекомого могут играть роль в специфичности с помощью определения, где процессируется белок Cry. Как только Cry белок был солюбилизирован и процессирован, он связывается со специфическими рецепторами на поверхности эпителия средней кишки насекомого и впоследствии интегрируется в липидный бислой мембраны щеточной каймы. Затем образуются ионные каналы, нарушая нормальную функцию средней кишки, в конечном счете приводя к смерти насекомого. Существует явные различия в свойствах растворимости частей токсина белков Cry.

[0014] Определенные белки Cry, активные в отношении чешуекрылых, были сконструированы с целью улучшить специфическую активность или расширить спектр инсектицидной активности. Например, домен специфичности к шелкопряду тутовому (Bombyx mori) из Cry1Aa помещали на Cry1Ac, таким образом, наделяя полученный химерный белок новой инсектицидной активностью (Ge et al. 1989, PNAS 86:4037-4041). Также, Bosch et al. 1998 (патент США №5736131) создал новый активный в отношении чешуекрылых токсин путем замещения домена III Cry1E доменом III Cry1C, таким образом, получая Cry1E-Cry1C гибридный токсин с более широким спектром активности в отношении чешуекрылых.

[0015] Остается необходимость в разработке новых и эффективных средств борьбы с вредителями, которые обеспечивают экономическую пользу фермерам и которые приемлемы для окружающей среды. Необходимы белки с существенно измененными свойствами, такие как сконструированные белки Cry1Ba данного изобретения, которые имеют большую специфическую активность, чем нативные Cry1Ba белки в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька, основного вредителя кукурузы в Соединенных Штатах, который может стать устойчивым к существующим средствам борьбы с насекомыми. Кроме того, сконструированные белки Cry1Ba, чье применение минимизирует вред на окружающую среду, посредством трансгенных растений, являются желательными.

[0016] При увеличении специфической активности Cry1Ba по меньшей мере к мотыльку кукурузному, будет необходимо, чтобы в растении маиса экспрессировалось меньше белка Cry1Ba, таким образом, снижая возможные негативные воздействия Cry1Ba на растение. К тому же, увеличенная специфическая активность позволяет применять сконструированный Cry1Ba в стратегии высокой дозы для ЕСВ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0017] В виду этих потребностей, целью данного изобретения является обеспечить новые сконструированные белки Cry1Ba (eCry1Ba), имеющие по существу измененные свойства, которые являются улучшенными по сравнению с и отличаются от нативных Cry1Ba белков, в особенности, биохимические свойства, связанные с инсектицидной активностью к чешуекрылым вредителям кукурузы, включая без ограничения, таких вредителей как кукурузный мотылек (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), хлопковая совка (CEW; Helicoverpa zea), кукурузная юго-западная огневка (SWCB; Diatraea grandiosella), тростниковая огневка (SCB; Diatraea saccharalis), соевая совка (SBL; Pseudoplusia includens), гусеница совки рода Anticarsia (VBC; Anticarsia gemmatalis) и т.п. Путем замещения аминокислот в ключевых определенных положениях в нативной Cry1Ba белковой последовательности или Cry1Ba белке дикого типа, как определено в данном документе, в соответствии с данным изобретением, разрабатывают белок eCry1Ba, имеющий по существу измененные свойства растворимости и/или инсектицидные свойства по сравнению с нативным Cry1Ba. Данное изобретение дополнительно относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим белки eCry1Ba, и к композициям, и составам, содержащим белки eCry1Ba, которые способны ингибировать способность насекомых-вредителей выживать, расти и размножаться, или ограничивать связанное с насекомыми повреждение или гибель сельскохозяйственных растений. Данное изобретение дополнительно относится к способу получения белков eCry1Ba и способам применения белков eCry1Ba, например, в трансгенных растениях для обеспечения защиты от повреждения насекомыми. Существенно измененные свойства белков eCry1Ba данного изобретения обеспечивают их применение в стратегии высокой дозы в отношении по меньшей мере ЕСВ, нуждаясь при этом в уровнях экспрессии в растениях кукурузы, которые являются легко достижимыми.

[0018] Новые белки eCry1Ba, описанные в данном документе, являются высоко активными в отношении насекомых. Например, белки eCry1Ba данного изобретения могут использоваться для улучшения борьбы с экономически важными насекомыми-вредителями, такими как ЕСВ или CEW, без негативного влияния на активность в отношении других важных вредителей кукурузы, таких как SWCB и SCB. Белки eCry1Ba данного изобретения могут использоваться отдельно или в комбинации с другими стратегиями борьбы с насекомыми для обеспечения максимальной эффективности борьбы с вредителями с минимальным воздействием на окружающую среду. Трансгенные растения, экспрессирующие белки eCry1Ba данного изобретения, обеспечивают средство, с помощью которого растениеводы могут бороться с основными чешуекрылыми вредителями сельскохозяйственных культур, например, без ограничения, кукурузы и сахарного тростника.

[0019] Согласно одному аспекту данное изобретение включает сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba), содержащий мутацию в одном или нескольких положениях аминокислот в домене I, посредством чего сконструированный белок Cry1Ba имеет повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis) по сравнению с нативным или белком Cry1Ba дикого типа.

[0020] В другом аспекте мутация в одном или нескольких положениях аминокислот расположена в альфа-спирали 4 или альфа-спирали 5 домена I.

[0021] В дополнительном аспекте мутация имеет место в положении аминокислоты, соответствующем положению 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:2.

[0022] В еще одном аспекте мутация имеет место в положении 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:5.

[0023] В другом аспекте мутация имеет место в положении, соответствующем аминокислотам 2 и 150; или аминокислотам 2,150 и 178; или аминокислотам 2, 150 и 189; или аминокислотам 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5.

[0024] В еще одном аспекте мутация имеет место по аминокислотам 2 и 150; или аминокислотам 2, 150 и 178; или аминокислотам 2, 150 и 189; или аминокислотам 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5.

[0025] В одном аспекте данное изобретение включает сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, где X в положении 2 представляет собой любую аминокислоту и а) Х в положении 150 представляет собой Pro, Phe, Trp или Lys, и X в положении 189 представляет собой Leu и в положении 199 представляет собой Ser; или b) X в положении 189 представляет собой Ser, когда Х в положении 150 представляет собой Lys; или с) Х в положении 199 представляет собой Lys, когда Х в положении 150 представляет собой Lys.

[0026] В другом аспекте белок eCry1Ba данного изобретения содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10.

[0027] В еще одном аспекте белок eCry1Ba данного изобретения обладает активностью в отношении чешуекрылых или жесткокрылых насекомых, в частности чешуекрылых насекомых. Примеры таких чешуекрылых насекомых включают, но не ограничиваясь ими, следующие: кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia.

[0028] Данное изобретение также включает другие вариантные белки Cry1Ba (vCry1Ba), где тирозин (Tyr) или гистидин (His) в положении 150 (Y150 или Н150) замещен на аминокислоту, отличную от Tyr или His. В одном аспекте аминокислота, которая замещена на Y150 или Н150, представляет собой Lys, Phe, Trp, Pro, Thr, Leu, Ala, Val, Ser, Arg, Gly или Asp.

[0029] В другом аспекте данное изобретение включает белок vCry1Ba, который содержит SEQ ID NO:3.

[0030] В еще одном аспекте данное изобретение включает белок vCry1Ba, где Tyr или His в положении 150 замещен на аминокислоту, отличную от Tyr или His и также имеет валин (Val) в положении 81 (V81), замещенный на аминокислоту, отличную от Val; или аланин (Ala) в положении 155 (А155) и метионин (Met) в положении 178 (M178), замещенные на аминокислоты, отличные от Ala или Met, соответственно. В другом аспекте Val в положении 81 (V81) замещен на триптофан (Trp) (V81W). В еще одном аспекте вариантный белок Cry1Ba данного изобретения содержит SEQ ID NO:11.

[0031] В одном аспекте данное изобретение включает белок vCry1Ba с Y150, замещенным на другую аминокислоту и, где Ala в положении 155 (А155) замещен на аспарагиновую кислоту (Asp) (A155D) и Met в положении 178 (Met178) замещен на серии (Ser) (M178S). В другом аспекте вариантный белок Cry1Ba данного изобретения содержит SEQ ID NO:12.

[0032] Белки vCry1Ba данного изобретения обладают инсектицидной активностью в отношении чешуекрылых или жесткокрылых насекомых, в частности чешуекрылых насекомых. К таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia. Однако такие белки vCry1Ba могут не обладать повышенной активностью по сравнению с белком Cry1Ba дикого типа в отношении таких вредителей.

[0033] В другом аспекте данное изобретение включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba) данного изобретения или вариантный белок Cry1Ba (vCry1Ba) данного изобретения.

[0034] Данное изобретение также включает химерный ген, содержащий гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок eCry1Ba или белок vCry1Ba. Данное изобретение также включает рекомбинантный вектор, содержащий такой химерный ген. Дополнительно, данное изобретение включает трансгенную не принадлежащую человеку клетку хозяина, содержащую такой химерный ген. Трансгенная клетка-хозяин согласно этому аспекту данного изобретения включает без ограничения бактериальную клетку или растительную клетку. Такая трансгенная растительная клетка может быть клеткой маиса или клеткой сахарного тростника.

[0035] Данное изобретение дополнительно обеспечивает трансгенное растение, содержащее такую растительную клетку. Белки eCry1Ba или белки vCry1Ba являются пригодными для экспрессии в любом трансгенном растении, где чувствительные насекомые-вредители являются проблемой. Другой аспект данного изобретения включает потомство растения, содержащее нуклеиновую кислоту данного изобретения, от любого поколения трансгенного растения и часть растения для размножения, содержащую нуклеиновую кислоту данного изобретения, от любого поколения трансгенного растения. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой растение маиса или растение сахарного тростника. В еще одном аспекте часть растения для размножения представляет собой семя, орган вегетативного размножения или черенок.

[0036] Данное изобретение также включает инсектицидную композицию, содержащую эффективное для борьбы с насекомыми количество белка eCry1Ba или белка vCry1Ba по данному изобретению и дополнительно приемлемый сельскохозяйственный носитель. Такие сельскохозяйственные носители могут быть, например, пригодными для разбрызгивания составом или трансгенным растением.

[0037] В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения белка eCry1Ba или белка vCry1Ba, который активен в отношении насекомых, включающий: (а) получение клетки-хозяина, содержащей химерный ген, который сам по себе содержит гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с нуклеиновой кислотой данного изобретения; и (b) экспрессию нуклеиновой кислоты в трансгенной клетке-хозяине, что дает в результате по меньшей мере один белок, который активен в отношении насекомых.

[0038] В дополнительном аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения устойчивого к насекомым трансгенного растения, содержащий введение нуклеиновой кислоты данного изобретения в растение, таким образом производя трансгенное растение, где нуклеиновая кислота вызывает экспрессию белка eCry1Ba или белка vCry1Ba в трансгенном растении в эффективном количестве для борьбы с насекомыми. В еще одном аспекте насекомые являются чешуекрылыми или жесткокрылыми насекомыми. К таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia.

[0039] В другом аспекте данное изобретение включает способ получения сконструированного белка Cry1Ba (eCry1Ba), включающий а) определение белка Cry1Ba, имеющего домен I; b) замещение по меньшей мере одной нативной аминокислоты на участке в домене I на по меньшей мере одну другую аминокислоту; и с) получение белка eCry1Ba, полученного таким образом, где eCry1Ba имеет повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька по сравнению с нативным белком Cry1Ba или Cry1Ba дикого типа. В еще одном аспекте нативная аминокислота расположена в альфа-спирали 4 или альфа-спирали 5 домена I.

[0040] В еще одном аспекте данное изобретение включает способ борьбы с чешуекрылым насекомым, включающий приведение в контакт насекомого с эффективным количеством белка eCry1Ba или белка vCry1Ba данного изобретения. Согласно другому аспекту к таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia.

[0041] Предпочтительно, белок eCry1Ba или белок vCry1Ba доставляется насекомым перорально. В одном аспекте белки доставляются перорально посредством трансгенного растения, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует белок eCry1Ba или vCry1Ba данного изобретения.

[0042] Данное изобретение дополнительно обеспечивает способ борьбы с насекомыми, где трансгенное растение, содержащее нуклеиновую кислоту, кодирующую белок eCry1Ba или белок vCry1Ba, дополнительно содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты или множественные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере одно другое пестицидное действующее вещество. В одном аспекте вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок Cry отличный от белков eCry1Ba или vCry1Ba данного изобретения, такие, которые кодируют вегетативный инсектицидный белок, такие как те, которые раскрыты в патентах США №№5849870 и 5877012, которые включены в данный документ ссылкой, или те, которые кодируют путь для продукции небелкового пестицидного действующего вещества. В другом аспекте данного изобретения второе инсектицидное действующее вещество представляет собой белок Vip3.

[0043] Еще один аспект данного изобретения представляет собой обеспечение способа, обеспечивающего растениевода улучшенным средством борьбы с кукурузным мотыльком, кукурузной юго-западной огневкой, тростниковой огневкой, хлопковой совкой, соевой совкой и гусеницей совки рода Anticarsia, включающего поставку или продажу растениеводу трансгенных сеянцев, содержащих нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок eCry1Ba, имеющий мутацию в одном или нескольких положениях аминокислот в домене I, где белок eCry1Ba имеет повышенную растворимость или инсектицидную активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька по сравнению с нативным белком Cry1Ba. В другом аспекте трансгенные сеянцы представляют собой семена, органы вегетативного размножения или черенки.

[0044] Другие аспекты и преимущества данного изобретения станут очевидными специалистам данной области техники после изучения следующего описания данного изобретения и неограничивающих примеров.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0045] Фиг.1 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей известных нативных белков Cry1Ba. Аминокислоты в положении 150 выделены жирным шрифтом.

[0046] Фиг.2 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей нативного полноразмерного Cry1Ab и Cry1Ba. Домены I и II и альфа-спирали 4 и 5 домена I показаны стрелками.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0047] SEQ ID NO:1 представляет собой кодирующую последовательность нативного полноразмерного cry1Ba.

[0048] SEQ ID NO:2 представляет собой аминокислотную последовательность нативного полноразмерного белка Cry1Ba.

[0049] SEQ ID NO:3 представляет собой мутированный полноразмерный Cry1Ba.

[0050] SEQ ID NO:4 представляет собой cry1Ba-Т25 кодирующую последовательность.

[0051] SEQ ID NO:5 представляет собой белок Cry1Ba-Т25 дикого типа.

[0052] SEQ ID NO:6 представляет собой белок eCry1Ba-Х150.

[0053] SEQ ID NO:7 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150K.

[0054] SEQ ID NO:8 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150KM178S.

[0055] SEQ ID NO:9 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150KL189S.

[0056] SEQ ID NO:10 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150KS199K.

[0057] SEQ ID NO:11 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ21.

[0058] SEQ ID NO:12 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ90.

[0059] SEQ ID NO:13 представляет собой оптимизированную для маиса последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок eCry1Ba-T2AY150KL189S.

[0060] SEQ ID NOs:14-41 представляют собой праймеры, пригодные в данном изобретении.

[0061] SEQ ID NO:42 представляет собой процессированный нативный Cry1Ba.

[0062] SEQ ID NO:43 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ69.

[0063] SEQ ID NO:44 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ61.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0064] Для ясности некоторым выражениям, используемым в описании, даны определения, которые представлены ниже:

[0065] "Активность" белка eCry1Ba данного изобретения означает, что белки eCry1Ba функционируют как перорально активные средства борьбы с насекомыми, имеют токсический эффект или способны нарушать или ограничивать питание насекомого, что может вызывать или не вызывать смерть насекомого. Когда белок eCry1Ba данного изобретения доставляется насекомому, то это приводит, как правило, к смерти насекомого, или насекомое не питается от источника, который делает белок eCry1Ba доступным для насекомого.

[0066] "Связанный с/функционально связанный" относится к двум последовательностям нуклеиновых кислот, которые связаны физически или функционально. Например, указано, что промотор или регуляторная ДНК-последовательность является "связанной с" ДНК-последовательностью, которая кодирует РНК или белок, если две последовательности функционально связаны или расположены так, что регуляторная ДНК-последовательность будет влиять на уровень экспрессии кодирующей или структурной ДНК-последовательности.

[0067] "Химерный ген" или "химерный конструкт" представляет собой рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, в которой промотор или регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана или ассоциирована с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует мРНК или которая экспрессируется как белок, так что регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты способна регулировать транскрипцию или экспрессию ассоциированной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность. Регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты химерного гена в норме не является функционально связанной с ассоциированной последовательностью нуклеиновой кислоты, обнаруживаемой в природе.

[0068] "Кодирующая последовательность" представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в РНК, такую как мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно РНК затем транслируется в организме с продуцированием белка.

[0069] "Бороться" с насекомыми означает ингибировать, посредством токсического эффекта, способность насекомых-вредителей выживать, расти, питаться и/или размножаться, или ограничивать связанное с насекомыми повреждение или гибель сельскохозяйственных растений. "Бороться" с насекомыми может означать или не означать уничтожение насекомых, хотя предпочтительно означает уничтожение насекомых.

[0070] Как используется в данном документе, выражение "кукуруза" означает Zea mays или маис и включает все сорта растений, которые можно вывести с кукурузой, включая вид дикого маиса.

[0071] "Соответствующий" в контексте данного изобретения означает, что когда аминокислотные последовательности белков Cry1B выравнивают друг с другом, аминокислоты, которые "соответствуют" определенным пронумерованным положениям в данном изобретении, являются теми, которые совпадают с этими положениями в нативном Cry1Ba-токсине (SEQ ID NO:2), но которые не обязательно находятся в тех же нумерационных положениях относительно конкретной аминокислотной последовательности Cry1Ba данного изобретения. Например, метионин в положении 1 процессированного белка Cry1Ba (SEQ ID NO:42) будет совпадать с метионином в положении 22 полноразмерного Cry1Ba (SEQ ID NO:2). Следовательно, по данному изобретению, аминокислота 129 SEQ ID NO:42 "соответствует" номеру аминокислоты 150 SEQ ID NO:2.

[0072] "Доставлять" токсин означает, что токсин приходит в контакт с насекомым, давая в результате токсический эффект и борьбу с насекомыми. Токсин может быть доставлен многими общепринятыми способами, например, перорально путем приема вовнутрь насекомым или путем контакта с насекомым посредством экспрессии в трансгенном растении, составленной белковой композиции(ями), пригодной для разбрызгивания белковой композицией(ями), основа с приманкой или любая другая признанная в области техники система доставки токсина.

[0073] "Эффективное для борьбы с насекомыми количество" означает, что концентрация токсина, которая ингибирует посредством токсического эффекта способность насекомых выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничивает связанное с насекомыми повреждение или гибель сельскохозяйственных растений. "Эффективное для борьбы с насекомыми количество" может уничтожать или не уничтожать насекомых, хотя предпочтительно означает уничтожение насекомых.

[0074] "Сконструированный белок Cry1Ba" (eCry1Ba) данного изобретения относится к полученному из белка Cry1Ba, имеющему по меньшей мере одну мутацию в домене I, которая, как известно, не встречается в природе в Cry1Ba белке, белок eCry1Ba не встречается в природе и, путем вмешательства человека, содержит аминокислотную последовательность, которая не является идентичной белку, для которого известно, что он существует в Bacillus thuringiensis. Белки Cry1Ba, которые были сконструированы по данному изобретению, имеют существенно измененные и улучшенные свойства по сравнению с нативными белками Cry1Ba. В частности, белки eCry1Ba данного изобретения имеют повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька по сравнению с нативным Cry1Ba, Cry1Ba дикого типа или вариантными белками Cry1Ba данного изобретения.

[0075] "Сконструированный ген cry1Ba" (ecry1Ba) согласно данному изобретению относится к нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность белка eCry1B. Сконструированный ген cry1Ba может быть получен из нативного гена cry1Ba или из синтетического гена cry1Ba.

[0076] "Кассета экспрессии", как используется в данном документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в приемлемой клетке-хозяине, содержащей промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты интереса, которая функционально связана с сигналами терминации. Она также типично содержит последовательности, необходимые для правильной трансляции последовательности нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты интереса, может быть химерной, означая, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере к одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии может также быть такой, которая встречается в природе, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е., конкретная последовательность нуклеиновой кислоты кассеты экспрессии не встречается в природе в клетке-хозяине и должна была быть введена в клетку хозяина или пр