Биомаркеры для диагностики, прогноза, оценки и стратификации терапии обмороков

Биомаркеры для диагностики, прогноза, оценки и стратификации терапии обмороков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к области клинической диагностики. В частности, настоящее изобретение относится к диагностике, и/или прогнозу, и/или оценке и/или стратификации терапии обмороков.

Предпосылки изобретения

[0002] Оценка кратковременной потери сознания (TLOC) в отсутствие явной и определенной этиологии является сложной задачей. TLOC разделяют на травматические и нетравматические формы, и нетравматические TLOC классифицируют на приступы эпилепсии, психогенный псевдообморок, редкие различные случаи и обморок. Для большинства случаев с неясным диагнозом лежащей в основе причиной является временное нарушение кровообращения, приводящее к гипоперфузии головного мозга, традиционно классифицируемое как синкопальный эпизод (Blanc et al., 2002. Eur Heart J. 23:815-820; Bartoletti et al., 2006. Eur Heart J 27:83-88).

[0003] Обморок представляет собой TLOC, характеризующуюся быстрым началом, короткой продолжительностью и спонтанным полным восстановлением, которая часто возникает внезапно. В частности, обморок можно разделить на нейроопосредованный рефлекторный обморок (NMS), ортостатическую гипотензию (OH) и кардиогенный обморок (аритмический или структурный), хотя могут возникать менее частые состояния (Moya et al., 2009. Heart J. 30:2631-2671).

[0004] NMS обычно классифицируют на основании наиболее затронутого эфферентного пути, т.е. симпатический или парасимпатический: если преобладает гипотензия, обусловленная потерей сосудосуживающего тонуса в вертикальном положении, используют термин обморок вазодепрессорного типа; если преобладает брадикардия или асистолия, используют термин кардиоингибирующий обморок; и смешанную форму диагностируют, если присутствуют оба механизма. Более того, NMS можно также классифицировать на основании запускающего его механизма (т.е. афферентного пути) на вазовагальный обморок (VVS), ситуационный обморок (NMS, ассоциированный с некоторыми конкретными условиями), гиперчувствительность сонного синуса (CSH) и атипичная форма (при которой NMS возникает с неясным или даже очевидно отсутствующим запускающим механизмом).

[0005] В отличие от NMS, при ортостатической гипотензии симпатическая эфферентная активность хронически нарушена, так что сужение сосудов является недостаточным. При стоянии кровяное давление (BP) падает, и возникает обморок или предобморочное состояние. OH определяют как аномальное снижение BP при стоянии. Строго с патофизиологической точки зрения не существует перекрывания между NMS и OH, но клинические проявления двух состояний часто перекрываются, иногда делая дифференциальную диагностику сложной (Moya et al., 2009. Heart J. 30:2631-2671). OH можно разделить на классическую OH (определенную как снижение систолического BP≥20 мм рт.ст. (2666 Па) и диастолического BP≥10 мм рт.ст. (1333 Па) в течение 3 мин стояния (J Neurol Sci 1996; 144: 218-219)), начальную OH (характеризующуюся снижением BP немедленно при вставании >40 мм рт.ст. (5333 Па) и спонтанным и быстрым возвращением BP к нормальному, приводящему в результате к короткому периоду гипотензии и симптомов (Wieling et al., 2007. Clin. Sci (Lond) 112:157-165)), отсроченную (прогрессирующую) OH (характеризующуюся медленно прогрессирующим снижением систолического BP при принятии вертикальной позы (Gibbons and Freeman 2006. Neurology 67:28-32)), и синдром постуральной ортостатической тахикардии (POTS) (характеризующийся очень заметным увеличением частоты сердечных сокращений на >30 ударов в мин или до >120 ударов в мин и нестабильностью BP (Grubb et al., 1997. Pacing Clin. Electrophysiol 20: 2205-2212)).

[0006] Кардиогенный обморок может быть вызван аритмией (брадикардией, тахикардией) или структурным заболеванием (например, заболеванием сердечного клапана, острым инфарктом миокарда/ишемией, врожденными аномалиями коронарных артерий, легочной гипертензией и другие).

Обзор классификации обмороков показан на фиг.1.

[0007] Согласно современным руководствам по контролю обмороков, рекомендованы две основных линии исследований, углубленное кардиологическое обследование, основанное на долговременном мониторировании ЭКГ и автономные тесты, где ортостатическая проба (HUTT) играет центральную роль (Moya et al., 2009. Heart J. 30:2631-2671). Выбор линии часто зависит от анамнеза пациента и протекания обморока.

[0008] Мониторирование ЭКГ представляет собой способ для диагностики перемежающихся бради- и тахиаритмий. Золотым стандартом для диагностики обморока является регистрация корреляции между симптомами и документированной аритмией. По общему правилу, мониторирование ЭКГ показано только когда присутствует высокая предсказуемость идентификации аритмии, ассоциированной с обмороком.

[0009] В автономных тестах ортостатический тест (изменение от положения лежа на спине до положения стоя) вызывает перемещение крови от грудной клетки к нижним конечностям, приводящее к снижению венозного оттока и сердечного выброса. В отсутствие компенсаторных механизмов, падение BP может приводить к обмороку. В настоящее время существует два различных способа оценки ответа на изменение позы от положения лежа на спине до положения стоя: тест активного вставания, в котором пациенты активно встают от положения лежа на спине до выпрямленного положения стоя, и другой представляет собой наклонное положение тела головой вверх при 60 или 70°. Тест активного вставания используют для диагностики различных типов ортостатической неустойчивости с использованием сфигмоманометра. Наклонное тестирование позволяет воспроизвести нейроопосредованный рефлекс в лабораторных условиях. Депонирование крови и уменьшение венозного возврата из-за ортостатического стресса и иммобилизации запускают рефлекс. Однако, процесс диагностики является длительным и не всегда успешным (Croci et al., 2002. Europace 4:351-355).

[0010] Уровни циркулирующих вазоактивных гормонов исследовали у пациентов с различными типами обморока с гетерогенными результатами. У пациентов с VVS никаких различий в исходной точке (перед тестом HUT) не обнаружено для аргинина-вазопрессина (AVP) (Kaufmann et al., 1991. Lancet 338:8782-8783; Kaufmann et al., 1992. Neurology 42:590-593; Jardine et al., 1997. Am J Cardiol 79:1302-1306; Roul et al., 1999. Pacing Clin. Electrophysiol 22:1020-1030; Theopistou et al., 2001. Am J Cardiol. 88:376-381). Показано, что увеличение зрелого AVP являлось более явным в группе с положительным результатом теста HUT (классифицированной как пациенты с VVS) по сравнению с группой с отрицательным тестом HUT (Jardine et al., 1997. Am J Cardiol 79:1302-1306; Roul et al., 1999. Pacing Clin Electrophysiol 22:1020-1030; Kaufmann et al., 1991. Lancet 338:8782-8783; Kaufmann et al., 1992. Neurology 42:590-593; Theopistou et al., 2001. Am J Cardiol. 88:376-381). Более того, уровни копептина, стабильного фрагмента-предшественника проAVP, также известного как C-концевой проAVP (CT-проAVP), не отличались между пациентами с кардиоингибирующим и вазодепрессорным рефлекторным обмороком (Holmegard et al., 2012. Scand J Clin. Lab Invest, in press). Сходным образом, не обнаружено различий у пациентов с VVS для предсердного или мозгового натрийуретических пептидов (ANP или BNP) (Jardine et al., 1997. Am J Cardiol. 79:1302-1306; Roul et al., 1999. Pacing Clin. Electrophysiol 22:1020-1030; Magerkurth et al., 2005. Clin. Autonom Res 15:299-301). Напротив, Holmegard et al. опубликовали более высокие уровни среднерегионарного предсердного натрийуретического пропептида (MR-проANP), стабильного фрагмента-предшественника проANP, у пациентов с кардиоингибирующим обмороком по сравнению с пациентами с вазодепрессорным рефлекторным обмороком, в то время как уровни BNP не различались между группами (Holmegard et al., 2012. Scand J Clin. Lab Invest, in press). Сходным образом, Jardine et al. показали снижение ANP в ходе наклона у нормальных субъектов и при VVS, которое являлось более выраженным в нормальной популяции (Jardine et al., 1997. Am J Cardiol. 79:1302-1306). В отличие от этих результатов, Freitas et al. опубликовали, что уровни BNP в положении лежа на спине явно ниже у пациентов с нейроопосредованным обмороком по сравнению с пациентами с нейрогенной OH, в то время как уровни ANP были неизменными (Freitas et al., 2007. Int J Cardiol. 116:242-248). Более того, различие (Δ наклон/исходное) как ANP, так и BNP не отличалось у пациентов с нейроопосредованным обмороком по сравнению с пациентами с нейрогенной OH. Gajek et al. опубликовали, что не присутствовало различий исходных концентраций адреномедуллина между пациентами с кардиоингибирующим рефлекторным обмороком, пациентами со спонтанным обмороком и пациентами с индуцированным лекарственным средством обмороком (Gajek et al., 2004. Pol Merkur Lekarski 17: 267-270).

[0011] Не обнаружено различий исходных уровней AVP у пациентов с CSH по сравнению со здоровыми контрольными субъектами или пациентами с необъяснимым обмороком, в то время как для AVP у пациентов с CSH и пациентов с необъяснимым обмороком показано значительное увеличение в ходе наклона, которое являлось не явным у здоровых субъектов (Kenny et al., 1987. Cardiovasc Res 21:545-550).

[0012] У здоровых добровольцев без VVS в анамнезе, но с некоторой ортостатической неустойчивостью, уровни эндотелина в сыворотке были значительно выше в исходной точке у субъектов, испытывающих обморок в ходе HUTT, по сравнению с субъектами без обморока (Magerkurth et al., 2005. Clin. Autonom Res 15:299-301). Более того, авторы указали, что эти результаты указывают на постоянно усиливающееся высвобождение эндотелина у субъектов с тенденцией к вазовагальному обмороку, и что будущие исследования должны изучать, могут ли уровни эндотелина в сыворотке увеличивать специфичность и чувствительность диагностики вазовагального обморока. ET-1 увеличивался в ходе HUT как у пациентов с VVS, так и у нормальных субъектов, в то время как это увеличение являлось более выраженным у пациентов с VVS (Kaufmann et al., 1991. Lancet 338:8782-8783). В отличие от этого, Mehta et al. опубликовали, что исходные уровни эндотелина были значительно выше у пациентов с обмороком в анамнезе и отрицательным результатом HUTT по сравнению с пациентами с положительным результатом HUTT (Mehta et al., 1995. Am J Cardiol. 76:86-88). Однако не присутствовало различий между обмороками подтипов кардиоингибирующего, вазодепрессорного и смешанного типа, и отсутствовали различия между временными выборками.

[0013] Адреномедуллин (ADM) исследовали у здоровых добровольцев, и субъектов разделяли на высокую (без обмороков) и низкую устойчивость (синкопальные симптомы) к ортостатическому тесту согласно тесту с отрицательным давлением в нижней части тела (LBNP) (Gasiorowska et al., 2005. J Physiol. Pharmacol. 56:179-193). Исходные уровни ADM были значительно выше у субъектов с низкой устойчивостью по сравнению с субъектами с высокой устойчивостью к ортостатическому тесту, в то время как уровень ADM увеличивался сходным образом в обеих группах в ходе теста.

[0014] Однако для всех этих исследований является важным отметить, что до публикации руководства ESC в 2009 г. (Moya et al., 2009. Heart J. 30:2631-2671) не существовало золотого стандарта диагностики для пациентов с обмороком и, следовательно, не было доступно согласования относительно различных форм ортостатической неустойчивости и их связи с приступами обморока. Более того, вышеописанные исследования биомаркеров проводили на небольших избранных сериях пациентов, главным образом, по сравнению со здоровыми индивидуумами, и они не включали полный спектр лежащих в основе механизмов. Таким образом, диагностика конкретного типа обморока являлась затруднительной и не слишком надежной.

[0015] Более того, надежный диагноз является важным необходимым условием для выбора подходящей терапии. Целью терапии является в первую очередь предотвращение рецидивов и сопутствующих повреждений, и улучшение качества жизни. Вариантами терапии для нейроопосредованного обморока являются, например, приемы физической компенсации (например, изометрические PCM для рук или ног, подобные скрещиванию ног или кистевому жиму и напряжению рук) и наклонная тренировка, так же как фармакологическая терапия (например, мидодрином, α-антагонистом) и кардиостимуляция. Brignole опубликовал, что активная кардиостимулирующая терапия значительно уменьшает рецидивы обморока у пациентов с тяжелым нейроопосредованным обмороком, особенно при CSH с кардиоингибированием (устная презентация, American College of Cardiology, Chicago USA, 24-27 of March 2012). Фактически, кардиостимуляция противопоказана в отсутствие тяжелого кардиоингибирования. Таким образом, точная диагностика и оценка тяжести обморока является обязательной.

[0016] Что касается прогноза (т.е. стратификации риска), ассоциированного с обмороком, два важных элемента следует принимать во внимание: (i) риск смерти и опасных для жизни событий; и (ii) риск рецидива обморока и физического повреждения.

[0017] Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление способа, позволяющего диагностику и/или прогноз и/или оценку, и/или стратификацию терапии обморока.

Краткое изложение сущности изобретения

[0018] Объектом изобретения является способ диагностики и/или прогноза, и/или оценки, и/или стратификации терапии обморока у пациента, где способ включает:

- определение уровня по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из группы, состоящей из проADM, проANP, проBNP, проAVP, проET-1 и PCT или фрагмента по меньшей мере из их 12 аминокислот, в образце физиологической жидкости указанного пациента,

- корреляцию указанного уровня по меньшей мере одного биомаркера с диагнозом и/или прогнозом, и/или оценкой, и/или стратификацией терапии обморока.

Предпочтительные варианты способа описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.

Описание чертежей

[0019] Фиг. 1: Классификация подтипов обморока.

[0020] Фиг. 2: Диаграмма вида «ящик с усами» значений для MR-проANP для диагностики обморока.

[0021] Фиг. 3: Диаграмма вида «ящик с усами» значений для MR-проADM для диагностики обморока.

[0022] Фиг. 4: Диаграмма вида «ящик с усами» значений для CT-проET-1 для диагностики обморока.

[0023] Фиг. 5: Диаграмма вида «ящик с усами» значений для CT-проAVP для диагностики обморока.

[0024] Фиг. 6: Диаграмма вида «ящик с усами» значений для PCT для диагностики обморока.

[0025] Фиг. 7: Линейная взаимосвязь между MR-проANP и VVS.

[0026] Фиг. 8: Линейная взаимосвязь между CT-проET-1 и VVS.

[0027] Фиг. 9: Линейная взаимосвязь между CT-проET-1 и OH.

[0028] Фиг. 10: Линейная взаимосвязь и подобные пороговым эффекты между MR-проANP и CSH.

[0029] Фиг. 11: Линейная взаимосвязь между CT-проET-1 и кардиоингибирующим рефлексом.

[0030] Фиг. 12: Пороговый эффект между CT-проAVP и начальной OH.

Подробное описание изобретения

[0031] Объектом изобретения является способ диагностики и/или прогноза, и/или оценки, и/или стратификации терапии обморока у пациента, где способ включает:

[0032] определение уровня по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из группы, состоящей из проADM, проANP, проBNP, проAVP, проET-1 и PCT или фрагмента по меньшей мере из их 12 аминокислот, в образце физиологической жидкости указанного пациента,

[0033] корреляцию указанного уровня по меньшей мере одного биомаркера с диагнозом и/или прогнозом, и/или оценкой, и/или стратификацией терапии обморока.

[0034] Обморок определяют как кратковременную потерю сознания из-за временной глобальной гипоперфузии головного мозга, характеризующейся быстрым началом, короткой продолжительностью, и самопроизвольным полным восстановлением (Moya et al., 2009. Heart J. 30:2631-2671).

[0035] VVS определяют как воспроизведение обморока, ассоциированное с характерной картиной выраженной гипотензии и/или брадикардии/асистолии.

[0036] CSH определяют как падение SBP ≥50 мм рт.ст. (6666 Па) и/или асистолию >3 с.

[0037] OH определяют как значительное снижение систолического BP (SBP) ≥20 мм рт.ст. (2666 Па) и/или снижение диастолического BP (DBP) ≥10 мм рт.ст. (1333 Па), или систолическое BP <90 мм рт.ст. (11997 Па) (классическая OH, в пределах 3 мин фазы наклона; и отсроченная OH, между 3 и 20 мин), в то время как POTS имеет характерные симптомы ортостатической неустойчивости с увеличением частоты сердечных сокращений на >30/мин или тахикардией >120/мин в положении стоя. Начальная OH присутствует, когда возникли временное снижение BP в течение 15 с после вставания, >40 мм рт.ст. (5333 Па) SBP и/или >20 мм рт.ст. (2666 Па) DBP с симптомами гипоперфузии головного мозга, и пациент сообщил о типичном протекании обморока (Wieling et al., 2007. Clin Sci (Lond). 112:157-165).

[0038] Кардиоингибирующий обморок определяют как падение частоты сердечных сокращений до желудочкового ритма менее 40 ударов в минуту в течение более 10 с, или асистолию >3 с, в то время как вазодепрессорный рефлекс определяют как падение частоты сердечных сокращений ≤10% от ее пика на время обморока (Brignole et al., 2000. Europace 2:66-76).

[0039] Как упомянуто в настоящем документе, «анализ» или «диагностический анализ» может относиться к любому типу, применяемому в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании аналита, подлежащего детекции, с одним или несколькими связывающими зондами с определенной аффинностью. Что касается взаимодействия между связывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами, константа аффинности предпочтительно выше 10⁸ M^-1.

[0040] В контексте настоящего изобретения, «связывающие молекулы» представляют собой молекулы, которые можно использовать для связывания молекул-мишеней или интересующих молекул, т.е. аналитов (т.е. в контексте настоящего изобретения пептида(пептидов)), из образца. Связывающие молекулы должны, таким образом, иметь адекватную форму, как в пространстве, так и в отношении свойств поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, присутствие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, чтобы специфически связывать молекулы-мишени или представляющие интерес молекулы. Таким образом, связывание может быть опосредовано, например, ионными взаимодействиями, взаимодействиями Ван-дер-Ваальса, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными взаимодействиями или взаимодействиями водородных связей, или комбинацией двух или более из вышеупомянутых взаимодействий между связывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения, связывающие молекулы могут, например, являться выбранными из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу PNA, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно, связывающие молекулы представляют собой антитела, включая их фрагменты с достаточной аффинностью к мишени или представляющей интерес молекуле, и включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, так же как химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученные из варианта цепи длиной по меньшей мере их 12 аминокислот.

[0041] Предпочтительные способы детекции включают иммуноанализы в различных форматах, например, таких как радиоиммунный анализ (RIA), хемилюминесцентные и флуоресцентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), массивы на бусинах на основе Люминекса, анализы белка на микромассивах, и форматы экспресс-анализов, например, такие как иммунохроматографические анализы на полосках.

[0042] Анализы могут представлять собой гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные и неконкурентные анализы. В особенно предпочтительном варианте осуществления анализ присутствует в форме сэндвич-анализа, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, где молекула, подлежащая детекции и/или количественной оценке, связана с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, бусиной, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или полоской, и второе антитело представляет собой антитело, которое является меченым, например, красителем, радиоактивным изотопом, или реакционноспособной или каталитически активной группой. Количество меченого антитела, связанного с аналитом, затем измеряют подходящим способом. Общая композиция и способы, включенные в «сэндвич-анализы», хорошо разработаны и известны специалисту в данной области (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3^rd ed. (May 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C. et al., Curr Opin. Chem. Biol. 2006 Feb; 10(1):4-10. PMID: 16376134, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки).

[0043] В особенно предпочтительном варианте осуществления анализ включает две связывающие молекулы, предпочтительно, антитела, которые оба присутствуют как распределенные в жидкой реакционной смеси, где первый компонент для мечения присоединен к первой связывающей молекуле, где указанный первый компонент для мечения является частью системы для мечения, основанной на флуоресценции- или хемилюминесценции-тушении или амплификации, и второй компонент для мечения указанной системы для мечения присоединен ко второй связывающей молекуле, так что при связывании обеих связывающих молекул с аналитом образуется поддающийся измерению сигнал, позволяющий детекцию сформированных сэндвич-комплексов в растворе, содержащем образец.

[0044] Даже более предпочтительно, указанная система для мечения содержит криптаты редкоземельных элементов или хелаты редкоземельных элементов в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа.

[0045] Даже более предпочтительно, указанная система для мечения содержит криптаты редкоземельных элементов или хелаты редкоземельных элементов в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа. В контексте настоящего изобретения, анализы на основе флуоресценции включают использование красителей, которые могут, например, являться выбранными из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, CY7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4’,5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6 G5), 6-Карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, орегон зеленый, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как техас красный, якима желтый, Alexa Fluor, PET, бромид этидия, акридиновые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.

[0046] В контексте настоящего изобретения, анализы на основе флуоресценции включают использование красителей, основанных на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных веществ в Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4^th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, pp.518-562, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки, включая цитаты на страницах 551-562. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.

[0047] «Диагностика» в контексте настоящего изобретения относится к распознаванию и (ранней) детекции заболевания или клинического состояния у субъекта и может также включать дифференциальную диагностику.

[0048] Термин «оценка» относится к оценке тяжести заболевания у пациента.

[0049] По настоящему изобретению, термин «прогноз» обозначает предсказание того, как медицинское состояние субъекта (например, пациента) будет прогрессировать. Он может включать оценку шанса восстановления или шанса неблагоприятного исхода для указанного субъекта (например, рецидива приступа обморока или смерти).

[0050] Термин «пациент», как применяют в настоящем документе, относится к живому, относящемуся или не относящемуся к человеку организму, который получает медицинскую помощь или должен получать медицинскую помощь из-за заболевания. Он включает лиц без определенного заболевания, у которых исследуют признаки патологии. Таким образом, способы и анализы, описанные в настоящем документе, являются применимыми как для заболеваний человека, так и для ветеринарных заболеваний.

[0051] Термин «образец», как применяют в настоящем документе, относится к образцу физиологической жидкости, полученному с целью диагностики, прогноза или оценки представляющего интерес субъекта, такого как пациент. Предпочтительные тестовые образцы включают кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, мокроту и плевральные выпоты. Кроме того, специалисту в данной области понятно, что некоторые тестовые образцы можно более легко анализировать после процедуры фракционирования или очистки, например, разделения цельной крови на компоненты сыворотки или плазмы.

[0052] Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения образец выбран из группы, включающей образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинномозговой жидкости, образец слюны и образец мочи или экстракт любого из вышеупомянутых образцов. Предпочтительно, образец представляет собой образец крови, наиболее предпочтительно, образец сыворотки или образец плазмы.

[0053] Термин «коррелирующий», как применяют в настоящем документе по отношению к использованию диагностического и прогностического маркера(маркеров), относится к сравнению присутствия или уровня маркера(маркеров) у пациента с его присутствием или количеством у лиц, как известно, страдающих от, или, как известно, подверженных риску данного состояния. Уровень маркера в образце от пациента можно сравнивать с уровнем, как известно, ассоциированным с конкретным диагнозом. Говорят, что уровень маркера в образце коррелирует с диагнозом; значит, специалист в данной области может использовать уровень маркера для определения того, страдает ли пациент от конкретного типа заболевания, и реагировать соответствующим образом. Альтернативно, уровень маркера в образце можно сравнивать с уровнем маркера, как известно, ассоциированным с хорошим исходом (например, отсутствием заболевания и т.д.). В предпочтительных вариантах осуществления, уровни панели маркеров коррелируют с общей вероятностью или конкретным исходом.

[0054] Чувствительность и специфичность диагностического и/или прогностического теста зависят от большего, чем просто аналитическое «качество» теста, они также зависят от определения того, что составляет аномальный результат. На практике, рабочие характеристические кривые (кривые ROC), как правило, рассчитывают посредством нанесения на график значения переменной по сравнению с его относительной частотой в «нормальной» (т.е. практически здоровой) популяции и популяциях «с заболеванием» (т.е. у пациентов, страдающих диабетом, устойчивостью к инсулину и/или метаболическим синдромом). Для любого конкретного маркера распределение уровней маркера у субъектов с заболеванием и без, вероятно, может перекрываться. В таких условиях тест не отличает абсолютно норму от заболевания со 100% точностью, и площадь перекрывания показывает, где тест не может отличать норму от заболевания. Выбирают порог, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, как маркер изменяется при заболевании) результат теста рассматривают как аномальный, и ниже которого результат теста рассматривают как нормальный. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что выявленное измерение может позволять корректную идентификацию состояния. Кривые ROC можно использовать, даже когда результаты теста не обязательно дают точное количество. При условии, что можно ранжировать результаты, можно получать кривую ROC. Например, результаты теста в образцах «с заболеванием» можно ранжировать по степени (например, 1=низкий, 2=нормальный, и 3=низкий). Это ранжирование можно коррелировать с результатами в «нормальной» популяции, и получать кривую ROC. Эти способы хорошо известны в данной области (см., например, Hanley et al., 1982. Radiology 143: 29-36). Предпочтительно, из кривых ROC получают в результате AUC более, чем приблизительно 0,5, более предпочтительно, более, чем приблизительно 0,7, еще более предпочтительно, более, чем приблизительно 0,8, даже более предпочтительно, более, чем приблизительно 0,85, и наиболее предпочтительно, более, чем приблизительно 0,9. Термин «приблизительно» в этом контексте относится к +/- 5% от данного измерения.

[0055] Горизонтальная ось кривой ROC представляет собой (1-специфичность), которая увеличивается с долей ложноположительных результатов. Вертикальная ось кривой представляет собой чувствительность, которая увеличивается с долей истинно-положительных результатов. Таким образом, для конкретного выбранного порога можно определять значение (1-специфичность) и можно получать соответствующую чувствительность. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что уровень измеряемого маркера может позволять корректную идентификацию заболевания или состояния. Таким образом, площадь под кривой ROC можно использовать для определения эффективности теста.

[0056] В конкретных вариантах осуществления, выбирают маркеры и/или панели маркеров, чтобы они обладали по меньшей мере приблизительно 70% чувствительностью, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 80% чувствительностью, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 85% чувствительностью, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% чувствительностью, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95% чувствительностью, в комбинации с по меньшей мере приблизительно 70% специфичностью, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 80% специфичностью, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 85% специфичностью, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% специфичностью, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95% специфичностью. В особенно предпочтительных вариантах осуществления, как чувствительность, так и специфичность составляют по меньшей мере приблизительно 75%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95%. Термин «приблизительно» в этом контексте относится к +/- 5% данного измерения.

[0057] Пороговые уровни можно получать, например, анализом по Каплану-Мейер, где возникновение заболевания коррелирует с квартилями маркеров сердечно-сосудистых заболеваний в популяции. Согласно этому анализу, субъекты с уровнями маркеров сердечно-сосудистых заболеваний выше 75-го процентиля обладают значимо увеличенным риском приобретения заболеваний согласно изобретению. Этот результат дополнительно поддержан регрессионным анализом Кокса с полной поправкой на классические факторы риска: наивысший квартиль по сравнению со всеми другими субъектами с высокой значимостью ассоциирован с увеличенным риском приобретения заболеваний согласно изобретению.

[0058] Другими предпочтительными пороговыми значениями являются, например, 90-й, 95-й или 99-й процентиль нормальной популяции. При использовании более высокого процентиля, чем 75-й процентиль, снижают количество идентифицированных ложноположительных субъектов, но можно пропустить идентификацию субъектов, подверженных умеренному, тем не менее все еще увеличенному риску. Таким образом, можно принимать пороговое значение в зависимости от того, считают ли более приемлемым идентификацию большинства субъектов, подверженных риску, ценой идентификации также «ложноположительных», или считают ли более приемлемым идентификацию в основном субъектов, подверженных высокому риску, ценой пропуска нескольких субъектов, подверженных умеренному риску.

[0059] Другими математическими возможностями расчета риска индивидуума с использованием значения уровня маркера сердечно-сосудистых заболеваний у индивидуума и других прогностических лабораторных и клинических параметров являются, например, NRI (остаточный индекс реклассификации) или IDI (интегрированный индекс дискриминации). Индексы можно рассчитывать согласно Pencina (Pencina M.J., et al.: Evaluating the added predictive ability of a new marker: from area under the ROC curve to reclassification и beyond. Stat Med. 2008; 27:157-172).

[0060] Термин «уровень» в контексте настоящего изобретения относится к концентрации (предпочтительно, выраженной как масса/объем; масс./об.) маркерных пептидов, полученных из образца от пациента.

[0061] Как упомянуто в настоящем документе в контексте белков и других пептидов, термин «фрагмент» относится к более мелким белкам или пептидам, которые можно получать из более крупных белков или пептидов, которые, таким образом, содержат частичную последовательность более крупного белка или пептида. Указанные фрагменты можно получать из более крупных белков или пептидов посредством сапонификации одной или нескольких из его пептидных связей. «Фрагменты» маркеров PCT, проANP, проBNP, проET-1, проADM и проAVP предпочтительно относятся к фрагментам длиной по меньшей мере 6 аминокислот, наиболее предпочтительно, длиной по меньшей мере 12 аминокислотных остатков. Такие фрагменты предпочтительно поддаются детекции с помощью иммунологических анализов, как описано в настоящем документе.

[0062] Натрийуретические пропептиды являются выбранными из группы, состоящей из предсердного натрийуретического пропептида (проANP) и мозгового натрийуретического пропептида (проBNP) или их фрагменты длиной по меньшей мере 12 аминокислот.

[0063] Последовательность из 153 аминокислот пре-проANP показана на SEQ ID NO:1. После отщепления N-концевого сигнального пептида (25 аминокислоты) и двух C-концевых аминокислот высвобождается проANP (SEQ ID NO:2). Этот прогормон расщепляется на зрелый пептид ANP из 28 аминокислот, известный также как ANP (1-28) или α-ANP, и амино концевой фрагмент проANP (1-98) (NT-проANP, SEQ ID NO:3). Среднерегионарный проANP (MR-проANP) определяют как NT-проANP или любые его фрагменты, содержащие по меньшей мере аминокислотные остатки 53-90 (SEQ ID NO:4) проANP.

[0064] В предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению определяют уровень фрагмента предшественника проANP, MR-проANP.

[0065] Аминокислотная последовательность пептида-предшественника адреномедуллина (препроадреномедуллин) приведена на SEQ ID NO:5. Проадреномедуллин относится к аминокислотным остаткам 22-185 последовательности препроадреномедуллина. Аминокислотная последовательность проадреномедуллина (проADM) приведена на SEQ ID NO:6. MR-проадреномедуллин (MR-проADM) относится к аминокислотным остаткам 45-92 препроADM. Аминокислотная последовательность MR-проADM представлена на SEQ ID NO:7.

[0066] В другом предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению определяют уровень фрагмента-предшественника проADM, MR-проADM.

[0067] Последовательность 164 аминокислот пептида-предшественника вазопрессина (препровазопрессина) приведена на SEQ ID NO:8. Провазопрессин относится к аминокислотным остаткам 19-164 последовательности препровазопрессина. Аминокислотная последовательность провазопрессина приведена на SEQ ID NO:9. Провазопрессин расщепляется на зрелый вазопрессин, нейрофизин II и C-концевой провазопрессин (CT-проAVP или копептин). Копептин относится к аминокислотным остаткам 126-164 препровазопрессина. Аминокислотная последовательность копептина представлена на SEQ ID NO:10. Нейрофизин II содержит аминокислотные остатки 32-124 препровазопрессина, и его последовательность представлена на SEQ ID NO:11.

[0068] В другом предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению определяют уровень фрагмента-предшественника проAVP, копептина.

[0069] Прокальцитонин является предшественником кальцитонина и катакальцина. Аминокислотная последовательность PCT 1-116 приведена на SEQ ID NO:12.

[0070] Последовательность 134 аминокислот пептида-предшественника мозгового натрийуретического пептида (препро-BNP) показана на SEQ ID NO:13. Про-BNP относится к аминокислотным остаткам 27-134 препро-BNP. Последовательность про-BNP показана на SEQ ID NO:14. Про-BNP расщепляется на N-концевой про-BNP (NT-про-BNP) и зрелый BNP. NT-про-BNP содержит аминокислотные остатки 27-102, и его последовательность показана на SEQ ID NO:15. На SEQ ID NO:16 показана последовательность BNP, содержащая аминокислотные остатки 103-134 пептида препро-BNP.

[0071] Последовательность 212 аминокислот пептида-предшественника эндотелина-1 (препроэндотелина-1) приведена на SEQ ID NO:17. Про-ET-1 относится к аминокислотным остаткам 18-212 последовательности препро-ET-1. Аминокислотная последовательность про-ET-1 приведена на SEQ ID NO:18. Про-ET-1 расщепляется на зрелый ET-1, big-ET-1 и C-концевой проET-1 (CT-проET-1). ET-1 относится к аминокислотным остаткам 53-73 препро-ET-1. Аминокислотная последовательность ET-1 показана на SEQ ID NO:19. CT-проET-1 относится к аминокислотным остаткам 168-212 препро-ET-1. Аминокислотная последовательность CT-проET-1 представлена на SEQ ID NO:20. Big-ET-1 содержит аминокислотные остатки 53-90 препро-ET-1, и его последовательность показана на SEQ ID NO:21.

[0072] В предпочтительном варианте осуществления способа по из