Жидкие композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа

Жидкие композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа, включающей фармацевтически эффективное количество конъюгата интерферона альфа, и стабилизатор без альбумина, содержащий буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерферон был открыт Isaacs и Lindenmann, которые обнаружили фактор, влияющий на вирус гриппа A, при инфицировании вирусом цыпленка, в 1957 (Isaacs, K. and Lindenmann, J., Proc. R. Soc. Lond., B147, 258-267 (1957)). Человеческие интерфероны представляют собой белки, известные как цитокины, которые осуществляют коммуникацию между клетками, посредством чего могут запускаться защитные силы иммунной системы, которая убивает патогенные микроорганизмы, такие как вирусы. В зависимости от типов клеток, которые их высвобождают, интерфероны классифицируют на интерферон альфа, интерферон бета и интерферон гамма (Kirchner, H., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 89-93(1981): Stanton, G. J., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 84-88(1981)). То есть интерферон альфа высвобождается из B лимфоцитов, интерферон бета из обычных лимфоцитов и макрофагов и интерферон гамма из T лимфоцитов с помощью макрофагов.

Сообщалось, что интерфероны проявляют противовирусную активность, противораковую активность, активируют клетки NK (натуральные киллеры), и синергически ингибируют рост миелоцитов (Klimpel, et al., J. Immunol., 129, 76-78(1982); Fleischmann, W. R., et al., J. Natl. Cancer Inst., 65, 863-966(1980); Weigent., et al., Infec. Immun., 40, 35-38(1980)). С того времени в большом количестве исследований было обнаружено, что в добавление к проявлению противовирусных эффектов, интерфероны действуют как регуляторные факторы экспрессии, структуры и функции генов в клетках, особенно с непосредственным антипролиферативным действием. Кроме того, функцией интерферонов является борьба с различными заболеваниями, вызываемыми инфекциями, и различными опухолями.

Интерферон альфа образуется в клетках лейкоцитах после воздействия митогенов, вирусов или опухолевых клеток. К сегодняшнему дню обнаружено мультигенное семейство из, по меньшей мере, 20 генов интерферона альфа и известно, что они кодируют полипептиды, большинство из которых состоит из 165 или 166 аминокислот.

Клинические исследования продемонстрировали, что рекомбинантный человеческий интерферон альфа является эффективным в лечении различных солидных раков. В частности, известно, что интерферон альфа обладает эффективным терапевтическим эффектом при раке мочевого пузыря, раке почки и ассоциированной с ВИЧ саркоме Капоши (Torti, F.M., J. Clin. Oncol., 6, 476-483(1988); Vugrin, D., et al., Cancer Treat. Rep., 69, 817-820(1985); Rios, A., et al., J. Clin. Oncol., 3, 506-512(1985)). Кроме того в недавних отчетах сообщают, что интерферон альфа является терапевтически применимым в лечении гепатита типа С (Davis, G. G., et al., N. Engl. J. Med., 321, 1501-1506(1989)). На основании таких новых открытий, терапевтическая область интерферона альфа становится шире.

Полипептиды, такие как интерферон альфа, имеют тенденцию к легкой денатурации из-за их низкой стабильности, разлагаются протеолитическими ферментами в крови и легко проходят через почки или печень. Следовательно, белковые лекарственные средства, включая полипептиды, в качестве фармацевтически эффективных компонентов, необходимо часто вводить пациентам для поддержания желаемого уровня концентрации и титров в крови. Однако такое частое введение белковых лекарственных средств, большинство из которых представлены в инъекционной форме, вызывает у пациентов боль.

Для решения вышеуказанных проблем было предпринято множество попыток для улучшения стабильности белковых лекарственных средств в сыворотке и сохранения уровня лекарственных средств в крови на высоком уровне в течение длительного периода времени для максимального увеличения фармацевтической эффективности лекарственных средств. Для применения в качестве длительно действующих препаратов, белковые лекарственные средства необходимо рецептировать с высокой стабильностью и титрами, поддерживаемыми на достаточно высоком уровне, без развития иммунных ответов у пациентов.

Обычным подходом для стабилизации белков и предотвращения ферментативного разложения и расщепления почками является химическая модификация поверхности белкового лекарственного средства с помощью полимера, имеющего высокую растворимость, такого как полиэтиленгликоль (PEG). При связывании со специфическими или различными участками целевого белка, PEG стабилизирует белок и предотвращает гидролиз, не вызывая серьезных побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139). Однако, несмотря на его способность усиливать стабильность белка, PEGилирование имеет проблемы, такие как значительное снижение титров физиологически активных белков. Кроме того, существует снижение выхода при увеличении молекулярной массы PEG из-за сниженной реакционной способности белков.

Другой альтернативной стратегией улучшения стабильности физиологически активных белков in vivo является связь гена физиологически активного белка с геном, кодирующим белок, имеющий высокую стабильность в сыворотке, с помощью генетической рекомбинантной технологии, и культивирование клеток, трансфицированных рекомбинантным геном для получения сшитого белка. Например, сшитый белок может быть получен путем конъюгации альбумина, белка, известного как наиболее эффективный в усилении стабильности белка, или его фрагмента, с физиологически активным интересующим белком путем генетической рекомбинации (PCT публикации №№ WO 93/15199 и WO 93/15200, Европейская патентная публикация № 413622).

Другим методом является использование иммуноглобулина, как описано в патенте США № 5045312, где человеческий гормон роста конъюгирован с бычьим альбумином сыворотки или мышиным иммуноглобулином с использованием сшивающего агента. Конъюгаты имеют усиленную активность по сравнению с немодифицированным гормоном роста. Карбодиимид или глютаральдегид используются в качестве сшивающего вещества. Неспецифическое связывание таких низкомолекулярных сшивающих агентов с пептидами, однако, не обещает образования гомогенных конъюгатов, и in vivo они являются даже токсичными. Кроме того, усиление активности, к которому относится этот патент, имеет место только из-за химического связывания с фактором роста. Способ по этому патенту не может гарантировать усиленной активности для различных типов полипептидных лекарственных средств, поскольку в патенте не представлены даже факторы, связанные со стабильностью белка, такие как длительность, период полужизни в крови и др.

По существу, требуются длительно действующие композиции белковых лекарственных средств с улучшенной продолжительностью действия и стабильностью in vivo. Для применения в длительно действующей лекарственной композиции, конъюгаты белков, в которых физиологически активный полипептид ковалентно связан с неполипептидным полимером и Fc фрагментом иммуноглобулина, недавно были предложены в Корейских патентах №№ 10-0567902 (Physiologically active polypeptide conjugate having improved in vivo durability) и 10-0725315 (Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof).

Для применения длительно действующих конъюгатов интерферона альфа в лекарственных продуктах необходимо поддерживать их фармацевтическую эффективность in vivo при ограничении физико-химических изменений, таких как разложение, индуцированное светом, теплом или добавками, агрегация, адсорбция или гидролиз во время хранения и транспортировки. Длительно действующие конъюгаты интерферона альфа труднее стабилизировать, чем полипептид интерферона альфа как таковой, так как они имеют больший объем и молекулярную массу.

В целом, белки имеют очень короткий период полужизни и, при воздействии неподходящих температур, границ раздела вода-воздух, высокого давления, физического/механического стресса, органических растворителей, микробной контаминации и др. они подвергаются разложению в форме агрегации мономеров, осаждения из-за агрегации и адсорбции на поверхности контейнеров. При разложении белки теряют их присущие физико-химические свойства и физиологическую активность. После разложения белки практически не могут восстановить свои оригинальные свойства, так как дегенерация является необратимой. Особенно в случае белков, вводимых в дозе, настолько низкой, как сотни микрограмм на инъекцию, например, интерферон альфа, когда они теряют стабильность и, следовательно, абсорбируются на поверхности контейнера, возникает относительно высокая степень нарушения. Кроме того, абсорбированные белки легко агрегируют во время процесса дегенерации и агрегаты дегенерированных белков при введении в организм действуют как антигены, а не как белки, синтезируемые in vivo. Следовательно, белки необходимо вводить в достаточно стабильной форме.

Множество методов исследовали для предотвращения дегенерации белков в растворах (John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., October, 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelle et. al., Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995).

Для достижения целевой стабильности некоторые белковые лекарственные средства подвергают лиофилизации. Однако лиофилизированные продукты являются неудобными, так как для применения их необходимо заново растворять в воде для инъекций. Кроме того, они требуют крупных капиталовложений в большегрузные сублимационные установки, так как лиофилизация включается в процесс их получения. Также предполагают сжатие белков при использовании лиофилизатора. Однако указанный метод является экономически неблагоприятным из-за низкого выхода продукта. Кроме того, процесс сублимационной сушки подвергает белки высокой температуре, таким образом оказывая негативное влияние на стабильность белков.

В качестве альтернативы для преодоления ограничений появились стабилизаторы, которые, при добавлении к белкам в растворе, могут восстанавливать фихикохимические изменения белковых лекарственных препаратов и поддерживать фармацевтическую эффективность in vivo даже при хранении в течение длительного периода времени. Среди них можно отметить углеводы, аминокислоты, белки, поверхностно-активные вещества, полимеры и соли. Между прочим, человеческий альбумин сыворотки широко используют для стабилизации различных белковых лекарственных средств, и его применение в таком отношении доказано (Edward Tarelli et al., Biologicals, 26: 331-346).

Типичный процесс очистки человеческого альбумина сыворотки включает инактивацию биологических загрязнителей, таких как микоплазмы, прионы, бактерии и вирусы, или скрининг или оценку наличия одного или более биологических загрязнителей или патогенов. Однако всегда существует риск воздействия на пациентов биологических загрязнителей, так как их полностью не удалили или не инактивировали. Например, человеческую кровь от доноров скринируют для оценки, не содержит ли она определенные вирусы. Однако, этот процесс не всегда надежный. В частности, определенные вирусы, существующие в очень небольшом количестве, невозможно определить.

Кроме того, различные белки могут постепенно инактивироваться из-за химических различий, тогда как их подвергают различным соотношениям и условиям во время хранения. Эффект стабилизатора на срок хранения белков отличается от одного белка к другому. То есть различные стабилизаторы могут быть использованы в различных соотношениях в зависимости от физико-химических свойств интересующих белков. При одновременном использовании различные стабилизаторы могут давать побочные эффекты из-за конкуренции и некорректной обработки. Комбинация различных стабилизаторов также проявляет различные эффекты, так как они вызывают изменения характеристик или концентрации белков во время хранения. Так как пригодность стабилизирующей активности каждого стабилизатора связана с заданным диапазоном концентраций, необходимо аккуратно производить комбинацию различных видов и концентраций различных стабилизаторов.

В частности, что касается длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, которые имеют улучшенную длительность и стабильность in vivo, их молекулярные массы и объемы существенно отличаются от таковых обычного интерферона альфа, так как они состоят из физиологически активного пептида интерферона альфа, непептидных полимеров и Fc фрагмента иммуноглобулина. Более того, физиологически активный пептид интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина должны быть стабилизированы одновременно, так как оба они являются пептидами или белками.

Как указано выше, различные белки могут постепенно инактивироваться из-за химических различий, когда их подвергают различным соотношениям и условиям во время хранения. Кроме того, различные стабилизаторы, подходящие для соответствующих пептидов или белков, при одновременном использовании, скорее могут вызывать нежелательные эффекты, чем желательные эффекты, из-за конкуренции и ошибочной обработки.

Соответственно, трудно установить композиции стабилизатора для длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, которые созданы для одновременной стабилизации и интерферона альфа и Fc фрагмента иммуноглобулина.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Приводя к настоящему изобретению, обширные и тщательные исследования для разработки стабильной жидкой композиции длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, способной сохранять фармацевтическую эффективность в течение длительного периода времени без вирусной инфекции, способствовали открытию, что композиция стабилизатора без альбумина, включающая буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство, дает длительно действующие конъюгаты интерферона альфа с улучшенной стабильностью.

Решение задачи

Следовательно, задачей настоящего изобретения является получение жидкой композиции, включающей фармацевтически эффективное количество длительно действующего конъюгата интерферона альфа, в которой интерферон альфа ковалентно связан с Fc фрагментом иммуноглобулина, и стабилизатор без альбумина, состоящий из буфера, сахарного спирта, неионного поверхностно-активного вещества и изотонического средства.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа получения жидкой композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа, включающего a) создание длительно действующего конъюгата интерферона альфа; и b) смешивание длительно действующего конъюгата интерферона альфа стадии a) со стабилизатором без альбумина, содержащим буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является получение стабилизатора для длительно действующего конъюгата интерферона альфа с интерфероном альфа, конъюгированным с участком иммуноглобулина Fc, где стабилизатор включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество, изотоническое средство и не содержит альбумин.

Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка способа стабилизации длительно действующего конъюгата интерферона альфа с помощью стабилизатора, где стабилизатор включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство и не содержит альбумин, и длительно действующий конъюгат интерферона альфа включает интерферон альфа, ковалентно связанный с Fc фрагментом иммуноглобулина.

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Не содержащая человеческого альбумина сыворотки и других потенциальных факторов, вредных для организма, жидкая композиция длительно действующих конъюгатов интерферона альфа в соответствии с настоящим изобретением не имеет проблем вирусных инфекций. Также жидкая композиция гарантирует превосходную стабильность при хранении длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, в которых связаны интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина, и которые имеют большую молекулярную массу и более длительную продолжительность действия, чем натуральные формы интерферона альфа, таким образом, являясь более экономически полезными, чем другие стабилизаторы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа в жидкой композиции, pH 5,5, представленной в примере 6, когда ее анализировали с использованием ОФ-ВЭЖХ в отношении длительности хранения при 4°С в течение 6 месяцев.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с его аспектами, настоящее изобретение относится к жидкой композиции, включающей фармацевтически эффективное количество длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, в которой интерферон альфа ковалентно связан с Fc фрагментом иммуноглобулина, и стабилизатор без альбумина, состоящий из буфера, сахарного спирта, неионного поверхностно-активного вещества и изотонического средства.

В соответствии с другими аспектами, настоящее изобретение относится к стабилизатору для длительно действующего конъюгата интерферона альфа с интерфероном альфа, конъюгированным с Fc фрагментом иммуноглобулина, который включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство и не содержит альбумина.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу стабилизации длительно действующего конъюгата интерферона альфа с помощью стабилизатора, где стабилизатор включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство, и не содержит альбумина, и длительно действующий конъюгат интерферона альфа включает интерферон альфа, ковалентно связанный с Fc фрагментом иммуноглобулина.

Термин “длительно действующий конъюгат интерферона альфа”, как используется в настоящем описании, может быть предназначен для обозначения белкового конструкта, включающего физиологически активный олигопептид, такой как интерферон альфа (IFNα), по меньшей мере один непептидный полимер с функциональной группой на обоих концах, и по меньшей мере один Fc фрагмент иммуноглобулина, в котором составляющие ковалентно связаны друг с другом посредством ковалентных связей.

Следовательно, термин “длительно действующий”, в рамках настоящего описания, относится к пролонгированному периоду действия по сравнению с интерфероном альфа натуральной формы. Термин “конъюгат” относится к конструкту, в котором интерферон альфа ковалентно связан с Fc фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера.

Длительно действующий конъюгат интерферона альфа представляет собой модифицированное белковое лекарственное средство, которое создано для минимизации потери присущей физиологической активности и для максимального увеличения продолжительности действия in vivo. Для использования в настоящем изобретении интерферон альфа ассоциирован с Fc фрагментом иммуноглобулина.

Интерфероном альфа, пригодным для использования в настоящем изобретении, предпочтительно может быть человеческий интерферон альфа. Также, интерфероном альфа может быть нативный IFNα, производное нативного IFNα или полипептид, имеющий активность, сходную с таковой нативного IFNα. То есть интерферон альфа по настоящему изобретению может включать последовательность аминокислот интерферона альфа дикого типа или последовательность аминокислот его мутанта. Термин “мутантная последовательность аминокислот”, как используется в настоящем описании, относится к последовательности аминокислот, которая отличается от дикого типа в результате делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены одного или более остатков аминокислот или их комбинации.

Интерфероном альфа может быть нативный интерферон альфа от людей или животных или может быть рекомбинантный интерферон альфа из трансформированных клеток. Предпочтительным является рекомбинантный человеческий интерферон альфа (HuIFNα), полученный с использованием трансформированных E. coli. Если их биологическая активность существенно не отличается от дикого типа, мутантов, образованных путем замены, делеции или вставки аминокислот, также включают в рамки интерферона альфа.

В рамках настоящего описания термин “Fc фрагмент иммуноглобулина” относится к фрагменту иммуноглобулина, который лишен вариабельных участков легких и тяжелых цепей, постоянного участка 1 тяжелой цепи (C_H1), и постоянного участка легкой цепи (C_L1), то есть фрагмент, состоящий из постоянных участков 2 и 3 тяжелой цепи (C_H2 и C_H3). Необязательно Fc фрагмент иммуноглобулина может дополнительно включать петлевой участок. Также, Fc фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может быть удлиненным Fc фрагментом, который включает часть или весь постоянный участок 1 тяжелой цепи (C_H1) и/или постоянный участок 1 легкой цепи (C_L1) в добавление к постоянным участкам 2 и 3 тяжелой цепи (C_H2 и C_H3), пока он обладает эффектами, по существу идентичными или превышающими таковые классического Fc фрагмента. Кроме того, Fc фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может состоять из C_H2 и/или C_H3, которые не содержат значительной части последовательности аминокислот.

Следовательно, Fc фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может состоять из 1) C_H1 домена, C_H2 домена, C_H3 домена и C_H4 домена, 2) CH1 домена и C_H2 домена, 3) C_H1 домена и C_H3 домена, 4) C_H2 домена и CH3 домена, 5) комбинации одного или более постоянных участков и петлевого участка иммуноглобулина (или частично петлевого участка), или 6) димера каждого постоянного домена тяжелой цепи и постоянного участка легкой цепи.

Кроме того, мутантная последовательность аминокислот Fc дикого типа может быть включена в рамки Fc фрагмента иммуноглобулина по настоящему изобретению. Термин “мутантная последовательность аминокислот” в настоящем описании, относится к последовательности аминокислот, которая отличается от дикого типа в результате делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены одного или более остатков аминокислот, или их комбинации. Например, остатки аминокислот в положениях 214-238, 297-299, 318-322, или 327-331 в IgG Fc, известные как важные для связи, могут быть использованы в участках, подходящих для модификации.

Различные производные, такие как полученные путем удаления участков дисульфидных связей, удаления нескольких N-концевых аминокислот из нативного Fc, или добавления метионина к N-концу нативного Fc, могут быть использованы в настоящем изобретении. Кроме того, участки фиксации комплемента, например, участки фиксации C1q, или участки ADCC, могут быть удалены для устранения эффекторной функции нативного Fc фрагмента. Методики получения мутантных последовательностей аминокислот Fc фрагмента иммуноглобулина описаны в Международной патентной заявке №№ WO 97/34631 и WO 96/32478.

Замены аминокислот в молекуле белка или пептида, которые не влияют на активность молекулы, хорошо известны в области техники (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее частые замены формируются между остатками аминокислот Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, и Asp/Gly. Необязательно, аминокислоты могут быть модифицированы посредством фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования и амидирования.

Вышеописанные производные Fc проявляют такую же биологическую активность, как таковая дикого типа, но улучшенную структурную стабильность относительно тепла и рН.

Fc фрагмент иммуноглобулина, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть гликозилирован в такой же степени или в большей или меньшей степени, чем нативная форма, или может быть дегликозилирован или агликозилирован. Повышенное или сниженное гликозилирование или дегликозилирование участка иммуноглобулина может быть достигнуто обычными способами, например, с использованием химического метода, ферментативного метода или генно-инженерного метода. В настоящем описании при дегликозилировании Fc фрагмент иммуноглобулина имеет достоверно сниженную силу связывания комплемента (C1q) и сниженную или отсутствующую цитотоксичность или комплемент-зависимую цитотоксичность, не вызывая нежелательного иммунного ответа in vivo. В таком контексте, дегликозилированные или агликозилированные Fc фрагменты иммуноглобулина в большей степени соответствуют цели носителей лекарственных средств.

Термин “дегликозилирование” в настоящем описании обозначает ферментативное удаление сахаров из Fc фрагмента. Термин “агликозилирование”, при использовании в сочетании с Fc фрагментом, обозначает Fc фрагмент без сахаров, экспрессируемый эукариотами, предпочтительно E. coli.

Для использования в настоящем изобретении Fc фрагмент иммуноглобулина имеет последовательность аминокислот Fc фрагмента человеческого иммуноглобулина или его тесно связанных аналогов. Fc фрагменты могут быть получены из нативных форм, выделенных от животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок. Кроме того, Fc фрагментом иммуноглобулина может быть Fc фрагмент, который получают из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или таковой, полученный путем комбинации их или их гибридов. Предпочтительно, их получают из IgG или IgM, которые являются белками, наиболее обильно встречающимися в человеческой крови, и наиболее предпочтительно из IgG, который известен как увеличивающий период полужизни лиганд-связывающих белков в сыворотке. В настоящем описании, Fc иммуноглобулина может быть получен из нативного иммуноглобулина путем выделения целого иммуноглобулина из организма человека или животных и его обработки протеолитическими ферментами, или он может быть рекомбинантом или их производным, полученным из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. Предпочтительно им является рекомбинантный человеческий Fc, продуцируемый трансформированными E. coli.

Термин “комбинация” в настоящем описании, обозначает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc фрагменты иммуноглобулина одного происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с формированием димера или мультимера. То есть, димер или мультимер могут быть образованы из двух или более фрагментов, выбираемых из группы, состоящей из Fc фрагментов IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, и IgE.

Термин “гибрид” в настоящем описании обозначает, что последовательности, кодирующие два или более Fc фрагмента иммуноглобулина различного происхождения, присутствуют в одноцепочечном Fc фрагменте иммуноглобулина. В настоящем изобретении возможны любые гибриды. То есть, домены гибридов могут состоять из одного-четырех доменов, выбираемых из группы, состоящей из C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4 IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc и IgD Fc, и могут включать петлевой участок.

С другой стороны, IgG подразделяют на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительным является Fc фрагмент IgG4, редко имеющий эффекторную функцию, такую как CDC (комплемент-зависимая цитотоксичность). В качестве носителя лекарственного средства по настоящему изобретению наиболее предпочтительным Fc фрагментом является негликозилированный Fc фрагмент человеческого IgG4.

Человеческий Fc фрагмент является более предпочтительным, чем нечеловеческий Fc фрагмент, который может действовать как антиген в человеческом организме и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как продукция новых антител к антигену.

Длительно действующий конъюгат интерферона альфа, который может быть использован в настоящем изобретении, получают путем связывания интерферона альфа и Fc фрагмента вместе. В этом отношении интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина могут быть сшиты посредством непептидного полимера или могут быть преобразованы в сшитый белок с использованием рекомбинантной методики.

Длительно действующий конъюгат интерферона альфа, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть получен с использованием генно-инженерной методики, как описано в корейской патентной заявке No. 10-0725315.

Непептидный полимер для применения в сшивке может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, таких как PLA (полимолочная кислота) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций. Наиболее предпочтительным является полиэтиленгликоль. Также их производные хорошо известны в области техники и могут быть легко получены в рамках области техники, включенных в рамки настоящего изобретения.

Жидкая композиция длительно действующего конъюгата интерферона альфа по настоящему изобретению включает длительно действующий конъюгат интерферона альфа в фармацевтически приемлемом количестве.

Термин “фармацевтически эффективное количество” в настоящем описании предназначен для обозначения достаточного количества фармацевтической композиции для лечения заболевания, в приемлемом соотношении польза/риск, применимом к любому медицинскому лечению. Эффективное количество может варьировать в зависимости от различных факторов, включая тяжесть и тип заболевания, подвергаемого лечению, возраст и пол пациента, активность лекарственного средства, чувствительность к лекарственным средствам, время введения, путь введения, скорость экскреции, продолжительность периода лечения, совместное введение с другими лекарственными средствами и другие параметры, хорошо известные в области медицины и фармацевтики. Обычно фармацевтически эффективное количество интерферона альфа варьируется от приблизительно 30 до 200 мкг на флакон для разового применения. Концентрация длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, используемых в настоящем изобретении, имеет порядок 0,1-50 мг/мл и предпочтительно порядок от 0,1 до 5,0 мг/мл.

В частности молекулярные массы и объемы длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, которые имеют улучшенную продолжительность действия и стабильность in vivo, существенно отличаются от таковых обычного интерферона альфа, так как они состоят из интерферона альфа и Fc фрагмента иммуноглобулина. Более того, физиологически активный пептид интерферона альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина должны быть стабилизированы одновременно, так как оба являются пептидами или белками.

Для соответствия таким требованиям в соответствии с настоящим изобретением используют стабилизатор. В настоящем описании термин “стабилизатор” обозначает вещество, которое допускает безопасное хранение длительно действующего конъюгата интерферона альфа. Термин “стабилизация” обозначает потерю активного ингредиента до заранее определенной степени, обычно до 10%, в течение определенного периода времени в условиях хранения. Когда длительно действующий конъюгат интерферона альфа сохраняет 90% или более его исходной активности и предпочтительно 95% или больше исходной активности после хранения при 5±3°С в течение 2 лет, при 25±2°С в течение 6 месяцев или при 40±2°С в течение одной-двух недель, понимают, что он стабилен.

Относительно белков, таких как длительно действующий конъюгат интерферона альфа, их стабильность при хранении является важной в отношении потенциального образования интерферон альфа-подобных антигенных веществ, а также гарантии введения точного количества. Во время хранения, около 10% потери активности интерферона альфа можно понимать как допускаемые для введения, если только длительно действующий конъюгат интерферона альфа в композиции не агрегирует и не фрагментируется, образуя антигенные материалы.

Стабилизатор, подходящий для наделения длительно действующего конъюгата интерферона альфа стабильностью, включает буфер, сахарный спирт, изотоническое средство и неионное поверхностно-активное вещество и необязательно дополнительно метионин.

Буфер в стабилизаторе играет роль поддержания pH жидкой композиции постоянным для предотвращения колебаний pH, таким образом стабилизируя длительно действующий конъюгат интерферона альфа. Буфер, применимый в настоящем изобретении, может включать фармацевтически приемлемые рН-буферные средства, включая щелочные соли (фосфат натрия или калия, их кислые или дикислые соли), цитрат натрия/лимонную кислоту, ацетат натрия/уксусную кислоту и их комбинации.

Со ссылками на раздел Примеров, стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа, варьируется в зависимости от значений pH буфера. Наибольшую стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа определяли при pH 5,5 в цитратном буфере (Пример 2).

Подходящим для использования в настоящем изобретении является фосфатный буфер или цитратный буфер, последний является существенно более предпочтительным.

Фосфат в цитратном буфере варьирует в концентрации предпочтительно от 5 до 100 мМ и более предпочтительно от 10 до 50 мМ.

Буфер имеет предпочтительно pH от 4,0 до 7,0, более предпочтительно pH от 5,0 до 7,0, еще более предпочтительно pH от 5,2 до 7,0, и наиболее предпочтительно pH от 5,2 до 6,0.

Сахарный спирт является производной формой углевода, чья карбонильная группа (=CO) была восстановлена до гидроксильной группы (-OH). В настоящем изобретении сахарный спирт участвует в стабильности длительно действующего конъюгата интерферона альфа.

В жидкой композиции сахарный спирт используют предпочтительно в концентрации от 1 до 10% (масс/об), и более предпочтительно в концентрации 5% (масс/об).

Сахарный спирт может быть выбран из группы, состоящей из эритрита, галактита, арабита, ксилита, сорбита, рибита, мальтита, сорбита, лактита и маннита, с предпочтением для маннита, сорбита или их комбинации.

Со ссылками на раздел Примеры, было обнаружено, что маннит в большей степени участвует в стабильности длительно действующего конъюгата интерферона альфа в условиях обычного буферного раствора (Пример 1).

Изотоническое средство действует не только поддерживая подходящее осмотическое давление, когда длительно действующему конъюгату интерферона альфа позволяют поступать в организм, но дополнительно стабилизирует длительно действующий конъюгат интерферона альфа в жидкой композиции. Примеры изотонического средства включают водорастворимые неорганические соли. Предпочтительно характерным среди них является хлорид натрия.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения использование хлорида натрия в качестве изотонического средства увеличивает стабильность при хранении длительно действующего конъюгата интерферона альфа в присутствии буфера, сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества. Из указанных данных понимают, что хлорид натрия в качестве изотонического средства обладает синергическим эффектом вместе с буфером, сахарным спиртом и неионным поверхностно-активным веществом на стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа.

Предпочтительно концентрация изотонического средства имеет порядок от 5 до 200 мМ и более предпочтительно порядок 150 мМ. В таком диапазоне концентрация изотонического средства может быть отрегулирована в соответствии с видами и количествами компонентов, так чтобы жидкая композиция была изотоничной.

Далее возвращаясь к неионному поверхностно-активному веществу, оно понижает поверхностное натяжение раствора белка для предотвращения адсорбции белка или агрегации на гидрофобных поверхностях. Неионные поверхностно-активные вещества типа полисорбата и полоксамера являются особо предпочтительными для применения в настоящем изобретении. Их можно использовать отдельно или в комбинации. Более предпочтительными являются неионные поверхностно-активные вещества типа полисорбата. Среди них полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80, с более предпочтительным полисорбатом 80.

Со ссылками на раздел Примеров, наблюдали, что жидкая композиция длительно действующего конъюгата интерферона альфа, содержащая полисорбат 80,