Способ определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии

Способ определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, более точно к космической медицине, и может быть использовано для контроля за состоянием гипоксии скелетных мышц и миокарда лиц, находящихся длительное время в условиях гиподинамии.

Снижение нагрузки на скелетные мышцы и миокард при гиподинамии сопровождается развитием метаболических перестроек в организме человека и прежде всего изменениями энергетического и пластического обеспечения работы мышечной ткани. Ограничение периодов напряжения и распада макроэргов в мышечной ткани и миокарде при гиподинамии сопровождается нарушением нейроэндокринной регуляции энергетических процессов биологического окисления (снижение скорости синтеза аденозинтрифосфата (АТФ)), вследствие уменьшения степени сопряжения окислительного фосфорилирования, структурных нарушений, а также снижением активности ферментов, регулирующих синтетические процессы в органах [1, 2]. Исследованиями газообмена в покое и при выполнении обследованными физической нагрузки при длительном (520 суток в программе «МАРС-500») ограничении двигательной активности показано, что вентиляция и эффективность газообмена, в течение всего периода воздействия, были в пределах физиологической нормы здорового человека [3]. По-видимому, при длительном ограничении двигательной активности покрытие энерготрат в организме происходит, в основном, за счет катаболических процессов в тканях, вследствие нарушения микроциркуляции [1, 2]. Так, в работах [4, 5] показано снижение интенсивности клеточного дыхания при гравитационной разгрузке (до 14 суток) с нарушением процессов в дыхательной цепи митохондрий и снижением активности цитохромоксидазы в камбаловидной мышце [4], а также интенсивности клеточного дыхания в кардиомиоцитах левого желудочка сердца крыс на 3 сутки реабилитации [5]. Уменьшение мышечной массы при длительном ограничении двигательной активности человека в модельных экспериментах (370 суток) и у космонавтов при различной длительности полетов сопровождалось развитием отрицательного азотистого баланса, замедлением нуклеинового обмена, увеличением экскреции мочевины, мочевой кислоты с мочой, вследствие замедления синтеза богатых энергией фосфорных соединений и тканевого дыхания [1, 2, 6].

При этом уменьшение квоты мышечной массы у человека при длительной (370 суток) гиподинамии происходило преимущественно в наиболее функционально активных группах скелетных мышц и в миокарде [1, 2]. Метаболизм углеводов при моделировании длительной гиподинамии характеризовался угнетением аэробных процессов гликолиза со снижением продукции АТФ и накоплением молочной и пировиноградной кислот. Подтверждением преобладания анаэробной фазы гликолиза является увеличение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и превращение пировиноградной кислоты в лактат для реокисления восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида НАД⁺ со снижением активности НАД-зависимых ферментов в тканях крыс (скелетные мышцы, миокард, печень) при гиподинамии [1, 2]. Процесс стрессорной мобилизации организма в период адаптации к длительной (370 суток) гиподинамии сопровождался снижением функции ферментативных систем, ослаблением процессов гликолиза и ферментативного катализа в клетках и равномерным снижением активности ферментов энергетического гомеостаза [1]. Динамика креатинфосфокиназы (КФК) отражала снижение активности мышечной креатинфосфокиназы (КФК-ММ) и в меньшей степени миокардиальной креатинфосфокиназы (КФК MB) [1]. В то же время исследованием ферментного спектра в ходе длительной (370 суток) гиподинамии было показано, что по мере увеличения длительности воздействия наблюдается нарастание изменений и в энергообмене миокарда [1]. Основываясь на данные литературы, характеризующие метаболические проявления при длительной гиподинамии [1, 2, 6], для верификации информативности ацетола, как биомаркера гипоксии в скелетных мышцах и миокарде, были прослежены следующие биохимические показатели: активность фермента энергетического гомеостаза (КФК) и его изоферментов: мышечного ММ-КФК и миокардиального МВ-КФК, активность дегидрогеназы гликолиза лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозы и показателя снижения функциональной нагрузки на скелетные мышцы - креатинина [1, 7, 8]. При выборе летучих органических соединений (ЛОС) для анализа в качестве биомаркеров гипоксии использовали данные, изложенные в работах [9, 10, 11, 12, 13].

В качестве прототипа заявленному способу определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда у человека при гиподинамии был выбран способ, описанный в [1], в котором определение тканевой гипоксии проводилось при моделировании длительной (370 суток) гиподинамии в наземных модельных экспериментах и у космонавтов в условиях невесомости. В прототипе определение гипоксии в скелетных мышцах и миокарде проводилось по динамике биохимических показателей, характеризующих аэробное окисление углеводов, активности энергетических ферментов специфичных для анализа аэробного типа энергетического обмена и активности ферментов энергетического гомеостаза: общей креатинкиназы (КФК) и ее мышечного (ММ КК) и миокардиального (MB КК) изоферментов, снижение активности которых наблюдается при уменьшении мышечной массы у человека и малоподвижном образе жизни (гиподинамии).

Недостатком выбранного прототипа является необходимость отбора венозной крови у обследуемых для проведения анализа, т.е. необходимость осуществления инвазивного вмешательства.

Техническим результатом заявленного способа является то, что предлагаемый способ исключает инвазивное вмешательство, что позволяет осуществлять способ в самых разных условиях, в динамике неограниченно, с частотой, необходимой для оценки неблагоприятного воздействия гиподинамии и эффективности профилактических мероприятий.

Этот технический результат достигается тем, что в известном способе определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии, включающем анализ у испытуемого молекулярных метаболитов тканевой гипоксии, в качестве молекулярного метаболита в воздухе, выдыхаемом испытуемым, методом хромато-масс-спектрометрии определяют ацетол (гидрооксиацетон C3H6O2 GAS116-09-6), до начала гиподинами и в процессе ее воздействия и при достоверном уменьшении ацетола в выдыхаемом воздухе диагностируют тканевую гипоксию скелетных мышц и миокарда при гиподинамии.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Отбор проб

Пробы выдыхаемого воздуха у обследуемых отбирали в мешки из нейтрального полимерного материала, объемом 5 л под контролем CO₂ «straw» method. Контроль СО₂ проводили на комплексе Oxycon Pro фирмы Jaeger-VITASYS (Германия), имеющем быстродействующий инфракрасный анализатор на СО₂ [4]. Выдыхаемый воздух отбирали без вдоха с удлиненным выдохом, следовательно, полученные пробы воздуха содержали в основном альвеолярный газ, соответствующий FET_CO2 - содержание СО₂ (%) в конечной порции выдыхаемого воздуха. Концентрирование проб проводили в сорбционных трубках, содержащих 180 мг сорбента «Тепах ТА», прокачивая 1 литр выдыхаемого воздуха через сорбент с помощью насоса «Supelco». Ввод образцов в газовый хроматограф-масс-спектрометр (ГХ-МС) проводили через термодесорбер TDS3 (Gerstel, Germany). Во время десорбции поток газа-носителя составлял 50 мл/мин, температура поднималась с начальной температуры 25°С до 250°С со скоростью 60°С/мин (конечная температура держалась 4 минуты в режиме без деления потока). Десорбированные вещества концентрировались криофокусировкой при -30°С жидким азотом в инжекторе CIS-4, содержащем лайнер, наполненный Tenax ТА. Введение образца непосредственно в колонку начиналось нагревом инжектора CIS-4 со скоростью 12°С/секунду до 250°С (конечная температура задерживалась на 3 минуты в режиме без деления потока). ГХ-МС анализ проводился на газовом хроматографе 6890N с масс-селективным детектором 5973N (фирмы Agilent Technologies), работающим при энергии ионизации 70 эВ. Хроматографическое разделение проводилось на капиллярной колонке DB-VRX 60 m × 0,25 mm × 1,4 μm (Agilent Technologies) при температурной программе: начальная температура 45°С выдерживалась 15 минут, затем проводили нагрев до 190°С со скоростью 8°С/мин, с выдержкой 2 минуты, затем нагрев до 250°С со скоростью 8°С/мин и выдержкой 1 мин при конечной температуре. Поток газа-носителя гелия был постоянным и составлял 1,0 мл/мин. Масс-спектрометр работал в режиме TIC с диапазоном m/z от 20 до 350. Хроматографические данные обрабатывались через the Agilent Chemstation Software.

2. Идентификация детектированных соединений

Идентификацию детектируемых соединений проводили с использованием библиотеки масс-спектров NIST. В дополнение к этому, для идентификации были использованы времена удерживания, полученные при анализе калибровочных смесей. Стандартные газовые смеси готовились методом испарения жидких веществ в тефлоновом мешке объемом 5 л. Мешок предварительно продувался чистым азотом (99,999%) с последующим вакуумированием с повторением операции 10 раз. Затем мешок заполнялся 3 литрами азота. Жидкие стандарты (несколько микролитров в зависимости от желаемой концентрации) вводились в мешок с помощью шприца для жидкостной хроматографии (Agilent Technologies). После испарения стандартов мешок дополнительно заполнялся 2 литрами азота. Стандартные пробы отбирались и анализировались в соответствии с процедурой, описанной выше.

3. Детектируемые соединения

Биохимические исследования включали: определение активности ферментов энергетического гомеостаза (КФК) и его изоферментов: мышечного КФК ММ и миокардиального КФК MB, активность гликолиза оценивали по динамике активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), а также концентрации глюкозы. Функциональную активность скелетной мускулатуры оценивали по динамике концентрации креатинина в крови. Биохимические исследования проводились с использованием коммерческих наборов реагентов производства фирм "DiaSys", ФРГ. Измерения проводились на биохимическом анализаторе "Targa 3000", фирмы "Biotecnica Instruments SPA", Италия. Взятие венозной крови производилось утром, натощак за 7 суток до начала испытаний, при изоляции волонтеров в герметичном помещении и на 7 сутки в период восстановления (ВП). При воздействии «сухой» иммерсии пробы крови отбирали до воздействия на 3 и 7 сутки воздействия, и 7 сутки RP.

4. Статистическую обработку данных проводили в пакете Statistica 8.0 (StatSoft, Inc). Ввиду малого числа обследуемых динамику ЛОС в выдыхаемом воздухе (ВВ) и биохимических показателей крови в ходе эксперимента исследовали с помощью непараметрических методов. Сравнения между сериями измерений проводили с помощью критерия Уилкоксона. Статистически значимыми считали различия при р<0.05. [14, 15].

Результаты исследований

На проведение исследований с длительной изоляцией человека в герметичных помещениях было получено разрешение биоэтической комиссии Института медико-биологических проблем Российской академии наук.

В исследованиях приняли участие 11 практически здоровых мужчин в возрасте 21-38 лет, прошедших клиническое обследование и допущенных к исследованиям медицинской комиссией. Исследования проводились на экспериментальной базе Института медико-биологических проблем Российской академии наук. Моделирование гиподинамии включало 2 серии исследований: 1-я серия (11 человек, длительность - 105 суток) и 2-я серия 520-суточная («Марс-500»). Изоляция обследованных проводилась в герметичном помещении объемом 550 м, оснащенном системами автономного жизнеобеспечения. Распорядок дня в ходе длительной гиподинамии включал 8-часовой ночной сон, трехразовое питание (стандартный рацион калорийностью 2600-2800 ккал), медицинский контроль и контролируемые оптимальные условиях окружающей среды (О₂ - 20-22,5%, CO₂ - 0,03%, температура - 21-23°С, влажность 60-70%).

Отбор проб выдыхаемого воздуха (1 серия) проводили за 1-3 сутки до посадки в термокамеру, в период изоляции ежемесячно (1 раз) и на 3 сутки после выхода обследованных из термокамеры - реабилитационный период (RP). Отбор проб выдыхаемого воздуха проводили до нагрузки (в покое), сразу по окончании физической нагрузки и спустя 1 час после дозированной работы на велоэргометре в RP. При физической нагрузке обследованные производили педалирование в среднем темпе (60±5 об/мин), увеличивая каждую минуту мощность нагрузки на 15 Вт (начальная нагрузка - 30 Вт). Мощность нагрузки последней ступени для каждого испытателя подбиралась индивидуально в соответствии с тренированностью и составляла от 150 до 210 Вт. Одновременно проводили отбор проб воздуха в гермообъекте и комнате (иммерсионный стенд) и их анализ согласно ISO 16000-6: 2004. В выдыхаемом воздухе практически здоровых обследованных было идентифицировано до 120 летучих органических соединений, включающих насыщенные нормальные и разветвленные углеводороды, их кислородсодержащие производные (спирты, кетоны, альдегиды, кислоты), ненасыщенные углеводороды (в основном изопрен), ароматические углеводороды.

Из перечня детектируемых соединений были выбраны ЛОС, в концентрации которых определялась динамика по мере увеличении длительности гиподинамии (табл. 1).

В качестве потенциальных биомаркеров гипоксии были выбраны ацетол, изопрен и ацетон. Основанием для выбора ЛОС являлось их образование как промежуточных метаболитов липидного и углеводного обмена, обеспечивающих энергопотребление скелетных мышц и миокарда в покое и при других физиологических условиях [8]. Было обнаружено, что изменение концентрации изопрена и ацетона является неинформативным. Снижение же содержания ацетола в выдыхаемом воздухе обследованных было значимым (Р=0,0002) во все сроки воздействия гиподинамии с максимальным эффектом к 500 суткам воздействия (фиг. 1). При этом важно отметить, что в отличие от динамики изопрена и ацетона, концентрации выдыхаемого ацетола в RP оставалась значительно ниже (Р=0,002) величины, наблюдаемой до воздействия гиподинамии. Это значимое снижение содержания выдыхаемого ацетола по мере увеличения длительности гиподинамии позволили выбрать ацетол, как наиболее вероятный биомаркер тканевой гипоксии и провести сравнительный анализ с изменениями в биохимических показателях энергетического обмена.

Ацетол как метаболит метилглиоксаля в альтернативном пути метаболизма углеводов является субстратом для синтеза лактата и позволяет миновать стадии гликолиза, которые идут с малым выходом АТФ.

При возникновении гипоксии различного генеза, в том числе и при интенсивной физической работе пул восстановленного НАД в организме истощается, кофактор расходуется только в митохондриях и поток электронов в трансгидразные реакции тормозится. Соответственно ингибируется образование ацетола из метилглиоксаля в метилглиоксалевом метаболическом пути [7, 16].

Результаты биохимических показателей крови обследованных при длительном ограничении двигательной активности представлены в табл. 2.

Так, интенсификация катаболических процессов при «недогрузке» скелетных мышц сопровождалось снижением активности ферментов энергетического гомеостаза (КФК), более выраженная в скелетных мышцах (КФК ММ), начиная со 168 суток воздействия, (табл. 2). Снижение ацетола (Р=0,0002) в выдыхаемом воздухе обследованных наблюдалось с 44 суток гиподинамии и к 500 суткам, содержание маркера, по сравнению с величиной до воздействия фактора, значительно уменьшилось (фиг. 1). Активность миокардиальной креатинфосфокиназы (КФК MB) изменялась волнообразно с чередованием периодов увеличения и снижения активности фермента (табл. 2). Увеличение активности миокардиального фермента КФК MB в период адаптационного напряжения организма к гиподинамии (до 60 суток) может быть обусловлена как биологической активацией адаптационных процессов в миокарде (стабилизация или возрастание клеточного дыхания), так и с процессами энергообразования в скелетных мышцах, т.к. в мышечной ткани примерно 10% креатинфосфокиназной активности представлено КФК MB (7, 8). Подтверждением информативности ацетола как биомаркера интенсивности процесса окислительного фосфорилирования при снижении функциональной нагрузки на скелетные мышцы и миокард является однонаправленность изменений ацетола и креатинина в крови по мере увеличения длительности воздействия гиподинамии (фиг. 2).

Увеличение активности биоэнерегетических процессов в скелетных мышцах и в миокарде, в период реабилитации (табл. 2), не сопровождалось значимым увеличением ацетола в выдыхаемом воздухе обследованных, свидетельствуя о сохранении пониженного энергообразования в мышечной ткани, что согласуется с отсутствием динамики креатинина в крови (фиг. 2).

Для уточнения информативности ацетола, как маркера тканевой гипоксии, были проведены пробы с физической нагрузкой, модифицирующей обмен углеводов в условиях гиподинамии. Анализ данных показал, что физическая работа, восстанавливая процессы энергообмена, снижает проявления тканевой гипоксии, увеличивая содержание ацетола в выдыхаемом воздухе. Однако общая направленность снижения выдыхаемого ацетола по мере увеличения длительности гиподинамии как в покое, так и при физической работе принципиально не меняется. Так, по мере нарастания эффекта мышечной «недогрузки» увеличение содержания ацетола, в ответ на физическую работу, постепенно нивелируется и к 500 суткам значимо уменьшается по сравнению с величиной до воздействия. Активация углеводного обмена и увеличение энергообразования в скелетных мышцах и миокарде на 3 сутки после окончания воздействия гиподинамии (табл. 2) сопровождалось тенденцией к увеличению концентрации выдыхаемого ацетола в покое и при выполнении физической нагрузки в выдыхаемом воздухе обследованных до, после и при выполнении физической нагрузки в условиях длительного ограничения двигательной активности). Однако увеличение содержания маркера в выдыхаемом воздухе обследованных при физической нагрузке в PR не достигало значений, наблюдаемых до воздействия гиподинамии.

По-видимому, альтернативный путь энергообразования не способен длительное время компенсировать недостаточность аэробного и анаэробного окисления в энергообеспечении тканей при длительном ограничении двигательной активности человека.

Таким образом, результаты исследований показали, что динамика содержания ацетола в выдыхаемом воздухе при длительной гиподинамии согласуется с изменением активности ферментов энергетического обмена и может рассматриваться как показатель тканевой гипоксии. Однонаправленное увеличение ацетола в выдыхаемом воздухе и активности КФК MB и ММ в крови после завершения воздействия гиподинамии в RP дает возможность предположить, что динамика ацетола может быть отражением метаболических сдвигов как в скелетных мышцах, так и в миокарде.

Краткое описание таблиц и чертежей

Табл. 1. Основные метаболиты ЛОС, идентифицированные в выдыхаемом воздухе здорового человека при длительном ограничении двигательной активности.

Табл. 2. Изменение ферментного спектра сыворотки крови при ограничении двигательной активности характеризовалось периодами увеличения и снижения активности энергетических ферментов и показателя функциональной нагрузки на скелетные мышцы - креатинина.

В табл. 2 использованы следующие обозначения

- *Background - до воздействия гиподинамии;

- ** с 274 суток - профилактика (физические нагрузки на велоэргометре по индивидуальной для волонтеров схеме)

- RP - реабилитационный период

Фиг. 1. Динамика биомаркера ацетола в выдыхаемом воздухе обследованных при длительном ограничении двигательной активности.

Фиг. 2. Изменения ацетола и креатинина в крови по мере увеличения длительности воздействия гиподинамии.

На фиг. 2 пунктиром обозначен ацетол, сплошной линией - креатинин.

Литература

1. Ushakov A.S., Popova I.A. Metabolism // Space biology and medicine. Human in Spaceflight. 1996. Vol. III. Book I. AIAA. Reston, VA. P. 195-211.

2. Lane H., W. Metabolic energy requirement for space flight. // Life support and habitability 1996. Vol. II. Life support systems. AIAA. Reston, VA. P. 167-174.

3. Suvorov A.V., Dyachenko A.I., et all. All-round evaluation of the human cardiorespiratory system. // In Abstracts book. Internatinal symposium on the results of the experimens, simulating manned mission to Mars (Mars-500) Moscow 2012. P. 62.

4. Oishi Y., Ogata T., Yamamoto K.I., et al. Cellular adaptations in soleus muscle during recovery after hindlimb unloading // Acta Physiol. 2008. V. 192(3). P. 381-395.

5. Ogneva L.V., Mirzoev T.M. et al. Stukture and functional characteristics of rats left ventricule cardiomyocytes under antiortostatic suspension of various duration and subsequent reeeeloading // J. of Biomed. and Biotech. V. 2012. Article ID 659869. P. 11.

6. Leach C.S., Leopard J.I., Rambaut P.C. Dynamics of weight loss during prolonged space flight // Physiologist. 1979. Vol. 22. P. 61-62.

7. Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry // 2005. Publisher W.H. Freeman. P. 1119.

8. Dixon M., Webb E.C. Enzymes // 1979. Prentice Hall Press. P. 1156.

9. Amann A., Smith D. // Breath analysis for clinical diagnosis and therapeutic monitoring, World Scientific, 2005.

10. B. de Lacy Costello, A. Amann, H. Al-Kateb, C. Flynn,. Filipiak. A rewiew of the volatiles from the healithy human body / J. of Breath Research / 8 2014 014001. 29pp.

11. M. Corradi, A. Mutti Exhaled breath analysis in occupational medicine. In Volatile Biomarcers. Non-invasive diagnosis in physiology and mtdicine / Edited by A. Amann, D. Smith. 2013. Charter 7. P. 117-125.

12. Brindle, J.T., Antti, H., Holmes, E., et al., Rapid and NonnInvasive Diagnosis of the Presence and Severity of Coronary Heart Disease Using 1H NMRRBased Metabolomics, Nature Med., 2002, vol. 8, no. 12, p. 1439. – 1444.

13. O'Hara, M.E., CluttonnBrock, T.H, Green, S., and Mayhew, C.E., Endogenous Volatile Organic Compounds in Breath and Blood of Healthy Volunteers: Examining Breath Analysis as a Surrogate for Blood Measurements, J. Breath Res., 2009, vol. 3, p. 27005.

14. P. Sprent, Nigel C. Smeeton Applied Nonparametric Statistical Methods, Fourth Edition (Chapman & Hall/CRC Texts in Statistical Science) 2007.

15. Hill, Т. & Lewicki, P. STATISTICS: Methods and Applications. StatSoft, Tulsa, 2007.

16. Gottshalk G. Bacterial Metabolism. // 1979. Prentice Hall Press; P. 1156.

17. Barmin V., Kreidich Yu., Repin A., Kozlovsaya I.. The effects of real and simulated microgravity on vestibule-oculomotor interaction // Physiol. l985. V. 19. №6. P. 27-32.

18. Booth F.W., Criswell D.S. Molecular event underlying skeletal muscle atrophy and development of effective countermeasure // J. Sports. Med. 1997. №18. P. 265-268.

19. Buravkova LB, Larina I.M, Popova I A Specific features of metabolism in humanperforming a physical exercise test after 7-day dry immersion // Human Physiology, 2003, v. 29, N5, pp. 588-594.

Способ определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии, включающий анализ у обследуемого молекулярных метаболитов тканевой гипоксии, отличающийся тем, что в качестве молекулярного метаболита в воздухе, выдыхаемом обследуемым, методом хромато-масс-спектрометрии определяют ацетол (гидрооксиацетон С3H6O2 GAS116-09-6), до начала гиподинами и в процессе ее воздействия и при достоверном уменьшении ацетола в выдыхаемом воздухе диагностируют тканевую гипоксию скелетных мышц и миокарда при гиподинамии.