Событие das-40278-9 aad-1, родственные линии трансгенной кукурузы и их событие-специфическая идентификация

Событие das-40278-9 aad-1, родственные линии трансгенной кукурузы и их событие-специфическая идентификация

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Ген aad-1 (первоначально выделенный из Sphingobium gerbicidovorans) кодирует белок арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD-1). Данный признак сообщает устойчивость к гербицидам на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и арилоксифеноксипропионата (обычно определяемым как ”фоп” гербициды, такие как физалофоп) и может быть использован в качестве селектируемого маркера в процессе трансформации растений и в селекционных питомниках. Ген aad-1 в качестве гена, сообщающего растениям устойчивость к гербицидам, был впервые раскрыт в публикации WO 2005/107437 (см. также US 2009-0093366).

Экспрессия гетерологичных или чужеродных генов в растениях зависит от места инсерции чужеродного гена в хромосому. Данное явление может быть связано, например, со структурой хроматина (например, гетерохроматина) или с близостью расположения элементов, регулирующих транскрипцию (например, энхансеров), от сайта интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Один и тот же ген в трансгенном растении (или другом организме) одинакового типа может характеризоваться большой изменчивостью уровня экспрессии по сравнению с другими генами. Кроме того, могут иметь место различия в пространственных или временных паттернах экспрессии. Например, различия в относительной экспрессии трансгена в разных тканях растения могут не соответствовать паттернам, ожидаемым от регулирующих транскрипцию элементов во введенной генной конструкции.

Таким образом, часто приходится создавать и исследовать большое число вариантов, чтобы идентифицировать вариант, экспрессирующий введенный для определенной цели ген на удовлетворительном уровне. Для достижения коммерческих целей обычно продуцируют сотни и тысячи разных вариантов, чтобы обнаружить единственный вариант, характеризующийся требуемыми уровнями и паттернами экспрессии трансгена. Вариант, характеризующийся требуемыми уровнями и/или паттернами экспрессии трансгена, имеет важное значение для интрогрессии трансгена в другие генетические среды путем полового ауткроссинга стандартными методами селекции. Потомство таких гибридов сохраняет характеристики экспрессии трансгена первичного трансформанта. Такой метод используют для достижения надежной экспрессии гена в ряде сортов, хорошо адаптированных к локальным условиям выращивания.

Заявки на патент США 20020120964 А1 и 20040009504 А1 относятся к варианту PV-GHGT07(1445) хлопчатника, способам его обнаружения и композициям для осуществления указанных способов. Заявка WO 02/100163 относится к варианту MONI5985 хлопчатника, способам его обнаружения и композициям для осуществления указанных способов. Заявка WO 2004/011601 относится к варианту MON863 кукурузы, способам его обнаружения и композициям для осуществления указанных способов. Заявка WO 2004/072235 относится к варианту MON88913 хлопчатника, способам его обнаружения и композициям для осуществления указанных способов.

Заявка WO 2006/098952 относится к варианту 3272 кукурузы. Заявка WO 2007/142840 относится к варианту MIR162 кукурузы.

Патент США № 7179965 относится к хлопчатнику, включающему вариант cry1F и вариант cry1Ac.

Настоящее изобретение относится к кукурузе AAD-1, включающей специфический вариант, ранее не описанный в научных публикациях.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к варианту кукурузы AAD-1, получившему название DAS-40278-9, семена которой депонированы в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-10244, и к потомству указанной кукурузы. Другими объектами настоящего изобретения являются последующие поколения растений, семена и зерна или регенерируемые части растений и семян и потомство кукурузы, включающей вариант DAS-40278-9, а также изготовленные из них пищевые или кормовые продукты. В объем настоящего изобретения также входят части растений кукурузы, содержащей вариант DAS-40278-9, которые включают, не ограничиваясь ими, пыльцу, семяпочки, цветки, побеги, корни и листья, ядра вегетативных клеток, клетки пыльцы и яйцеклетки. Настоящее изобретение далее относится к растениям кукурузы, обладающим устойчивостью к гербицидам на основе феноксиуксусной кислоты и/или арилоксиалканоата, к новым генетическим композициям варианта DAS-40278-9 кукурузы и некоторым аспектам агрономической продуктивности растений кукурузы, включающих вариант DAS-40278-9.

Настоящее изобретение частично относится к селекции растений и к растениям, устойчивым к гербицидам. Настоящее изобретение относится к новому варианту трансформации гена aad-1 в растениях кукурузы, включающему полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, которая введена в определенный сайт генома клетки кукурузы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный вариант/полинуклеотидная последовательность могут быть объединены с другими признаками, включающими, например, другие гены устойчивости к гербицидам и/или инсектицидные белки. Однако настоящее изобретение относится к растениям, включающим один вариант, рассмотренный в настоящем описании изобретения.

Дополнительные признаки могут быть введены в геном растения в результате селекции растений, повторной трансформации трансгенного растения, содержащего вариант DAS-40278-9 кукурузы, или добавления новых признаков путем направленной интеграции методом гомологичной рекомбинации.

Другие варианты осуществления изобретения относятся к удалению полинуклеотидных последовательностей, включающих вариант DAS-40278-9 кукурузы, в том числе, например, кассету экспрессии гена pat. В результате удаления полинуклеотидной последовательности модифицированный вариант может быть перенацелен в определенный сайт хромосомы, в котором дополнительные полинуклеотидные последовательности объединены с вариантом DAS-40278-9 кукурузы.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к хромосомному сайту-мишени кукурузы, расположенному на хромосоме 2 на расстоянии примерно 20 сМ между маркером UMC1265 (см. SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:31) и маркером ММС0111 (см. SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33) простых повторов последовательности (SSR), на расстоянии примерно 20 сМ на карте сцепления генов кукурузы DAS 2008, где сайт-мишень включает гетерологичную нуклеиновую кислоту. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к сайту-мишени хромосомного набора кукурузы, локализованному в SEQ ID NO:29, и к остаткам указанного сайта, рассмотренным в настоящем описании изобретения и известным специалисту в данной области.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу создания трансгенного растения кукурузы, который включает введение гетерологичной нуклеиновой кислоты в определенное положение хромосомы 2 на расстоянии примерно 20 сМ между маркером UMC1265 (см. SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:31) и маркером ММС0111 (см. SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33) SSR, на расстоянии примерно 20 сМ на карте сцепления генов кукурузы DAS 2008. В другом варианте осуществления изобретения инсертированная гетерологичная нуклеиновая кислота фланкирована у 5'-конца всей или частью 5'-концевой фланкирующей последовательности, определяемой в настоящем описании изобретения со ссылкой на SEQ ID NO:29, и фланкирована у 3'-конца всей или частью 5'-концевой фланкирующей последовательности, определяемой в настоящем описании изобретения со ссылкой на SEQ ID NO:29.

Кроме того, настоящее изобретение относится к анализам, предназначенным для обнаружения данного варианта в образце (например, в зерне кукурузы). Указанные анализы могут быть выполнены на основе последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, инсертированной в геном кукурузы, и на основе геномных последовательностей, фланкирующих сайт инсерции. В объем настоящего изобретения также входят наборы для выполнения указанных анализов и условия их использования.

Таким образом, настоящее изобретение частично относится к клонированию и анализу последовательностей ДНК полноразмерной вставки AAD-1 и ее краевых областей (в линиях трансгенной кукурузы). Указанные последовательности являются уникальными. На основании указанной вставки и краевых последовательностей были созданы вариант-специфические праймеры. Анализ методом ПЦР показал, что указанные варианты могут быть идентифицированы в результате анализа ампликонов ПЦР, созданных с использованием наборов вариант-специфических праймеров. Таким образом, указанные и другие методы могут быть использованы для идентификации линий кукурузы, включающих вариант по настоящему изобретению.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана карта плазмиды pDAS1740.

На фигуре 2 показаны компоненты вставки для DAS-40278-9 (pDAS1740).

На фигуре 3 показана рестрикционная карта и компоненты вставки для DAS-40278-9 (pDAS1740).

На фигуре 4 показаны ампликоны, праймеры и метод клонирования ДНК-вставки и краевых последовательностей для DAS-40278-9.

На фигуре 5 показаны местоположения праймеров по отношению к вставке и краевым последовательностям для DAS-40278-9.

На фигуре 6 показаны соединительные области и инсерция для DAS-40278-9.

На фигуре 7 показана схема селекции, описанная в примере 7.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1-28 представляют собой праймеры по настоящему изобретению.

SEQ ID NO:29 представляет собой вставку и фланкирующие последовательности для варианта DAS-40278-9.

SEQ ID NO:30-33 представляют собой праймеры для фланкирующих маркерных последовательностей, описанных в примере 4.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение частично относится к селекции растений и к растениям, устойчивым к гербицидам. Настоящее изобретение относится к новым вариантам трансформации растений кукурузы (маиса), включающим полинуклеотидные последовательности гена aad-1 по настоящему изобретению, инсертированные в определенный сайт генома клетки кукурузы. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная полинуклеотидная последовательность, например, может быть объединена с другими признаками (такими как другие гены устойчивости к гербицидам и/или гены, кодирующие инсектицидные белки). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные полинуклеотидные последовательности могут быть удалены и затем направленно связаны с дополнительными полинуклеотидными последовательностями. Однако настоящее изобретение относится к растениям, включающим один вариант по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к анализам, предназначенным для обнаружения в образце варианта по настоящему изобретению. В объем настоящего изобретения входят способы создания и/или продуцирования любых диагностических молекул нуклеиновых кислот, представленных или предложенных в настоящем описании изобретения, в основе которых, в частности, лежит полное или частичное использование фланкирующих последовательностей по настоящему изобретению.

В частности, настоящее изобретение частично относится к варианту DAS-40278-9 трансгенной кукурузы (известному также как pDAS1740-278), линиям растений, включающим указанные варианты, клонированию и анализу последовательностей ДНК указанной вставки и/или ее краевых областей. Линии растений по настоящему изобретению могут быть обнаружены при помощи последовательностей, рассмотренных и предложенных в настоящем описании изобретения.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к линиям кукурузы, устойчивой к гербицидам, и способам их идентификации. Настоящее изобретение частично относится к обнаружению варианта по настоящему изобретению с целью определения наличия представляющего интерес варианта в потомстве гибрида. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит способ обнаружения данного варианта, выполнение которого необходимо, например, для соответствия положениям, требующим предпродажного утверждения и маркировки продуктов, полученных, например, из растений рекомбинантной кукурузы. Вариант по настоящему изобретению можно обнаружить любым хорошо известным методом обнаружения нуклеиновой кислоты, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или гибридизация ДНК с помощью зондов нуклеиновой кислоты. Вариант-специфический анализ методом ПЦР описан, например, в публикации Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999). В данной публикации описана идентификация варианта устойчивости к глифосату 40-3-2 сои методом ПЦР с использованием набора праймеров, заполняющих соединение между вставкой и фланкирующей ДНК. В частности, один праймер включал последовательность из вставки и второй праймер включал последовательность из фланкирующей ДНК.

Кукуруза была модифицирована путем введения гена aad-1 из Sphingobium herbicidovorans, кодирующего белок арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD-1). Данный признак сообщает устойчивость к гербицидам на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и арилоксифеноксипропионата (обычно определяемых как ”фоп” гербициды, такие как хизалофоп) и может быть использован в качестве селектируемого маркера в процессе трансформации растения и в селекционных питомниках. Трансформация кукурузы при помощи фрагмента ДНК из плазмиды pDAS1740 была выполнена путем селекции с целью создания варианта DAS-40278-9.

Образцы геномной ДНК, выделенные из двадцати растений кукурузы, полученных из пяти поколений и четырех растений в каждом поколении варианта DAS-40278-9, были отобраны для молекулярного исследования варианта DAS-40278-9 кукурузы AAD-1. Экспрессию белка AAD-1 исследовали при помощи специального набора для экспресс-анализа AAD-1. Для последующего молекулярного исследования были отобраны только растения с положительной экспрессией белка AAD-1. Анализ гибридизации методом саузерн-блоттинга подтвердил наличие гена aad-1 в растениях кукурузы с положительной экспрессией белка AAD-1, который был инсертирован в виде одной интактной копии в указанные растения в процессе гибридизации с зондом гена aad-1.

В настоящем описании изобретения также рассмотрено молекулярное исследование ДНК, инсертированной в вариант DAS-40278-9 кукурузы AAD-1. Указанный вариант был получен методом точечной трансформации с использованием фрагмента FspI плазмиды pDAS1740. Анализ методом саузерн-блоттинга был выполнен для определения паттерна интеграции инсертированного фрагмента ДНК и выявления числа вставок/копий гена aad-1 в варианте DAS-40278-9. Были получены данные, свидетельствующие об интеграции и целостности трансгена aad-1, инсертированного в геном кукурузы. Была исследована интеграция некодирующих областей (предназначенных для регуляции кодирующих областей), таких как промоторы и терминаторы, области присоединения матрицы, RB7 Mar v3 и RB7 Mar v4, а также устойчивость вставки трансгена в нескольких поколениях. Устойчивость инсертированной ДНК была продемонстрирована в пяти поколениях растений. Кроме того, с помощью зондов, охватывающих почти всю область остова, фланкирующую сайты рестрикции (FspI) плазмиды pDAS1740, было продемонстрировано отсутствие последовательности области остова трансформирующей плазмиды, включающей ген устойчивости к ампициллину (Ap'). Подробная физическая карта инсерции была создана на основании анализов варианта DAS-40278-9, выполненных методом саузерн-блоттинга.

В тканях кукурузы определяли уровни белка AAD-1. Кроме того, был выполнен анализ состава стеблей и зерен кукурузы для исследования соответствия между линией изогенной нетрансформированной кукурузы и линией трансформированной кукурузы, включающей вариант DAS-40278-9 (неопрысканная кукуруза, кукуруза, опрысканная 2,4-D, опрысканная хизалофопом и опрысканная 2,4-D и хизалофопом). Агрономические характеристики линии изогенной нетрансформированной кукурузы также сравнивали с кукурузой, включающей вариант DAS-40278-9.

Экспрессию, состав питательных веществ и агрономические показатели нетрансгенной контрольной кукурузы и линии гибридной кукурузы, содержащей арилоксиалканоатдиоксигеназу-1 (AAD-1), исследовали в полевых условиях в один и тот же год на шести участках, расположенных в штатах Айова, Иллинойс (2 участка), Индиана, Небраска и в провинции Онтарио, Канада. В настоящем описании изобретения суммированы уровни экспрессии белка AAD-1 в листьях, пыльце, корнях, стеблях, целом растении и зерне и представлены результаты определения агрономических показателей и анализа состава образцов стеблей и зерна контрольной кукурузы и кукурузы AAD-1, включающей вариант DAS-40278-9.

Растворимый экстрагируемый белок AAD-1 измеряли при помощи количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) в листьях, пыльце, корнях, стеблях, целом растении и зерне кукурузы. Хорошие средние значения экспрессии были получены в тканях корней и пыльцы, которые более подробно рассмотрены в настоящем описании изобретения. Значения экспрессии были аналогичны для всех обработок опрыскиванием, а также для участков, которые не опрыскивали и опрыскивали гербицидом 2,4-D и хизалофопом.

Анализы состава, в том числе общих показателей, минеральных веществ, аминокислот, жирных кислот, витаминов, вредных веществ и вторичных метаболитов выполняли для исследования соответствия между кукурузой AAD-1, включающей вариант DAS-40278-9, (обработанной и необработанной гербицидами) и контрольной кукурузой. Результаты, полученные для состава всех образцов кукурузы AAD-1, включающей вариант DAS-40278-9, соответствовали или превосходили (в биологическом и агрономическом отношении) результаты, полученные для контрольных линий и/или обычной кукурузы, при выполнении анализа агрономических данных для участков, на которых произрастала контрольная кукуруза и кукуруза AAD-1, включающая вариант DAS-40278-9.

Как было указано выше в разделе ”Уровень техники”, введение и интеграция трансгена в геном растения вызывает появление некоторых случайных вариантов (отсюда название ”вариант” для данной экспрессируемой инсерции). То есть при использовании многих методов трансформации, таких как трансформация Agrobacterium, ”генное ружье” и точечная трансформация, невозможно предсказать, будет ли введен трансген в геном. Таким образом, идентификация фланкирующей геномной ДНК растения с обеих сторон вставки может иметь важное значение для выявления растения, имеющего данный вариант инсерции. Например, можно создать праймеры для ПЦР, позволяющие получить ампликон ПЦР в области соединения вставки и генома-хозяина. Указанный ампликон ПЦР может быть использован для идентификации уникального или отличающегося типа варианта инсерции.

Так как ”варианты” первоначально являются случайными вариантами, то в качестве части настоящего описания изобретения по меньшей мере 2500 семян линии кукурузы, включающей данный вариант, были депонированы, став достоянием общественности без каких-либо ограничений (но в соответствии с патентными правами), в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) по адресу 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Указанному депозиту был присвоен номер АТСС РТА-10244 (семена гибрида кукурузы Yellow Dent (Zea Mays L.): DAS-40278-9; депонированные компанией Dow AgroScience LLC; дата поступления семян/штамма в АТСС: 10 июля 2009; жизнеспособность семян подтверждена 17 августа 2009). Данный депозит был сделан и будет храниться в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования семян для целей патентной процедуры. Данный депозит будет храниться без каких-либо ограничений в депозитарии АТСС, который является общедоступным депозитарием, в течение 30 лет или в течение пяти лет после самого последнего запроса, или в течение эффективного времени действия патента в зависимости от того, какой из указанных периодов времени является наиболее продолжительным, и будет заменен, если станет нежизнеспособным в течение указанного срока.

Депонированные семена являются частью настоящего изобретения. Совершенно ясно, что из указанных семян могут быть выращены растения кукурузы, и такие растения также являются частью настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК в указанных растениях кукурузы, которые пригодны для обнаружения таких растений и их потомства. Методы обнаружения и наборы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации любого одного, двух или даже всех трех указанных вариантов в зависимости от конечной цели исследования.

Приведенные в настоящем описании изобретения определения терминов и примеры помогают более подробно описать настоящее изобретение и предоставляют специалистам в данной области необходимые указания для осуществления изобретения. За исключением особо оговоренных случаев термины имеют общепринятые значения, известные специалистам в данной области. Номенклатура оснований ДНК использована в соответствии с разделом 37 Свода федеральных правил, §1.822.

В использованном здесь значении термин ”потомство” означает потомство любого поколения родительского растения, включающее вариант DAS-40278-9 кукурузы AAD-1.

Трансгенный ”вариант” получают путем трансформации растительных клеток гетерологичной ДНК, то есть конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей представляющий интерес трансген, регенерации популяции растений, полученной в результате инсерции указанного трансгена в геном растения, и отбора конкретного растения, характеризующегося наличием инсерции в определенном положении в геноме. Термин ”вариант” относится к первичному трансформанту и потомству указанного трансформанта, включающему гетерологичную ДНК. Термин ”вариант” также относится к потомству, полученному в результате ауткроссинга трансформанта с другим сортом, включающим геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного обратного скрещивания с родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь, введенная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) из трансформированной родительской формы присутствует в потомстве гибрида в том же положении в хромосоме. Термин ”вариант” также относится к ДНК первичного трансформанта и его потомства, включающего введенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность рядом с введенной ДНК, которые должны быть переданы потомству, включая представляющий интерес трансген, в результате скрещивания одной родительской формы, включающей введенную ДНК (например, первичный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), с родительской формой, не содержащей введенную ДНК.

“Соединительная последовательность” заполняет участок, на котором ДНК, введенная в геном, связывается с ДНК нативного генома кукурузы, фланкирующей участок инсерции, при этом для диагностики варианта достаточно идентифицировать или обнаружить одну или несколько соединительных последовательностей в генетическом материале растения. К таким последовательностям относятся последовательности ДНК, заполняющие места вставки вариантов кукурузы по настоящему изобретению, и фланкирующие ДНК одинаковой длины. В настоящем описании изобретения приведены конкретные примеры таких диагностических последовательностей; однако, другие последовательности, которые перекрывают места соединения инсерций или места соединения инсерций и геномной последовательности, также являются диагностическими и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение относится к идентификации таких фланкирующих, соединительных последовательностей и последовательностей вставок. В объем настоящего изобретения входят соответствующие праймеры и ампликоны ПЦР. В соответствии с настоящим изобретением для обнаружения или идентификации промышленных сортов трансгенной кукурузы или линий, выделенных из линий трансгенной кукурузы, являющихся частной собственностью, могут быть использованы методы ПЦР с применением ампликонов, расположенных рядом с введенной ДНК и ее краевыми последовательностями.

Полные последовательности всех указанных вставок наряду с частями соответствующих фланкирующих последовательностей представлены в настоящем описании изобретения в виде SEQ ID NO:29. Ниже приведены координаты вставки и фланкирующих последовательностей каждого варианта, относящегося в SEQ ID NO:29 (всего 8557 пар оснований). Данный вопрос более подробно рассмотрен в примере 3.8.

	5'-концевая фланкирующая последовательность	Вставка	3'-концевая фланкирующая последовательность
Номера остатков (SEQ ID NO:29)	1-1873	1874-6689	6690-8557
Длина (п.о.)	1873 п.о.	4816 п.о.	1868 п.о.

Данный инсерционный вариант и его компоненты далее проиллюстрированы на фигурах 1 и 2. Указанные последовательности (в частности, фланкирующие последовательности) являются уникальными. На основании указанной вставки и краевых последовательностей были созданы вариант-специфические праймеры. Анализ методом ПЦР показал, что указанные линии кукурузы могут быть идентифицированы в разных генотипах кукурузы путем анализа ампликонов ПЦР, созданных при помощи наборов вариант-специфических праймеров. Таким образом, для идентификации указанных линий кукурузы могут быть использованы вышеуказанные и другие родственные методы. Последовательности, идентифицированные указанными методами, являются уникальными. Например, поиск с помощью программы BLAST в базах данных GENBANK, не выявил какой-либо значительной гомологии между клонированными краевыми последовательностями и последовательностями в базе данных.

Методы обнаружения по настоящему изобретению особенно полезны в сочетании с селекцией растений для определения потомства растений, включающего данный вариант, который был получен после скрещивания родительского растения, включающий представляющий интерес вариант, с другой линией растений с целью сообщения указанному потомству одного или нескольких дополнительных признаков. Указанные методы ПЦР позволяют эффективно разрабатывать программы селекции кукурузы и контролировать качество, в частности, промышленных семян трансгенной кукурузы. В настоящее время также могут быть созданы и использованы наборы для обнаружения методом ПЦР указанных линий трансгенной кукурузы. Указанные методы также позволяют регистрировать и хранить продукты.

Кроме того, фланкирующие/геномные последовательности кукурузы могут быть использованы для специфической идентификации локализации каждой вставки в геноме. Такая информация может быть использована для создания систем молекулярных маркеров, специфичных к каждому варианту. Указанные последовательности могут быть использованы для ускоренной селекции и получения данных о сцеплении генов.

Информация о фланкирующих последовательностях может быть далее использованы для изучения и исследования процессов интеграции трансгенов, определения сайтов для интеграции трансгенов в геноме, сортировки вариантов, определения устойчивости трансгенов и их фланкирующих последовательностей и экспрессии генов (особенно в отношении сайленсинга генов, паттернов метилирования трансгенов, влияния положения и возможных элементов, определяющих экспрессию, таких как MAR [области присоединения матрицы] и тому подобных).

В свете настоящего описания изобретения должно быть ясно, что в объем настоящего изобретения входят семена, депонированные в АТСС под номером РТА-10244. Настоящее изобретение также относится к растению кукурузы, устойчивому к гербицидам, выращенному из семени, депонированного в АТСС под номером доступа РТА-10244. Настоящее изобретение далее относится к частям указанного растения, таким как листья, образцы тканей, семена, произведенные указанным растением, пыльца и тому подобные.

Настоящее изобретение далее относится к происхождению и/или потомству растений, выращенных из депонированных семян, предпочтительно к растению кукурузы, устойчивому к гербицидам, геном которого включает обнаруживаемую последовательность, соединяющую геномную ДНК дикого типа/вставочную ДНК, по настоящему изобретению. В использованном здесь значении термин ”кукуруза” означает маис (Zea mays), и в определение данного термина входят все сорта, которые могут быть получены в результате селекции кукурузы.

Настоящее изобретение далее относится к способам получения гибридов при использовании растения по настоящему изобретению в качестве по меньшей мере одной родительской формы. Например, настоящее изобретение относится к гибридному растению F₁, имеющему в качестве одной или обеих родительских форм любые растения по настоящему изобретению. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит семя, произведенное такими гибридами F₁ по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способу получения семени гибрида F₁ путем скрещивания указанного растения с другим (например, инбредной родительской линией) растением и получения гибридного семени. Настоящее изобретение относится к указанному растению, которое является материнской или отцовской родительской формой. Характеристики полученных растений могут быть улучшены в результате тщательного отбора родительских растений.

Растение кукурузы, устойчивой к гербицидам, может быть получено в результате первоначального скрещивания первого родительского растения кукурузы, выращенного из семени любой линии по настоящему изобретению, и второго родительского растения кукурузы, что позволяет получить множество растений первого потомства; и затем отбора растения первого потомства, устойчивого к гербицидам (или содержащего по меньшей мере один из вариантов по настоящему изобретению); и самоопыления растения первого потомства, что позволяет получить множество растений второго потомства; и затем отбора из растений второго потомства одного растения, устойчивого к гербицидам (или содержащего по меньшей мере один из вариантов по настоящему изобретению). Указанные стадии могут далее включать обратное скрещивание растения первого потомства или растения второго потомства со вторым родительским растением кукурузы или третьим родительским растением кукурузы. Затем могут быть посеяны семена кукурузы по настоящему изобретению или их потомство.

Следует также отметить, что могут быть скрещены два разных трансгенных растения с целью получения потомства, содержащего два независимо добавленных экзогенных гена. В результате самоопыления соответствующего потомства могут быть получены растения, которые являются гомозиготными для обоих добавленных экзогенных генов. В объем настоящего изобретения также входит обратное скрещивание родительского растения и ауткроссинг с нетрансгенным растением в качестве вегетативного размножения. В данной области известны другие методы селекции, обычно используемые для сообщения растениям разных признаков и получения сельскохозяйственных культур. Селекцию методом обратного скрещивания используют для переноса генов с целью создания наследственного и хорошо наследуемого признака в требуемом гомозиготном культиваре или инбредной линии, являющейся родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь. Источник передаваемого признака именуется родителем-донором. Предполагается, что полученное растение должно иметь признаки родительской формы, с которой гибрид скрещивается вновь, (то есть культивара) и требуемый признак, перенесенный от родителя-донора. После первичного скрещивания отбирают растения, обладающие фенотипом родителя-донора, и повторно скрещивают (обратное скрещивание) с родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь. Предполагается, что полученная родительская форма должна иметь признаки родительской формы, с которой гибрид скрещивается вновь, (например, культивара) и требуемый признак, перенесенный от родителя-донора.

Молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров при осуществлении метода селекции с использованием маркеров (МАВ). Молекулы ДНК по настоящему изобретению (такие как маркеры AFLP, маркеры RFLP, маркеры RAPD, SNP и SSR) могут быть использованы в методах, позволяющих идентифицировать генетически связанные агрономически полезные признаки, известные в данной области. Признак устойчивости к гербицидам может быть прослежен в потомстве гибрида растения кукурузы по настоящему изобретению (или в его потомстве и в любом другом культиваре или сорте кукурузы) с помощью методов МАВ. Молекулы ДНК являются маркерами данного признака, и методы МАВ, хорошо известные в данной области, могут быть использованы для отслеживания признака устойчивости к гербицидам в растениях кукурузы, если по меньшей мере одна линия кукурузы по настоящему изобретению или ее потомство было родителем или предком. Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации любого сорта кукурузы, имеющего вариант по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают получение растения кукурузы, устойчивого к гербицидам, путем селекции растения по настоящему изобретению. В частности, указанные способы могут включать скрещивание двух растений по настоящему изобретению или одного растения по настоящему изобретению и любого другого растения. Предпочтительные способы далее включают отбор потомства указанного гибрида путем исследования потомства в отношении наличия варианта, обнаруживаемого методами по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение может быть использовано для отслеживания варианта по настоящему изобретению на протяжении нескольких циклов селекции растений, включающих другие требуемые признаки, в частности, агрономические признаки, анализируемые в разных примерах, приведенных в настоящем описании изобретения. Растения, включающие вариант по настоящему изобретению и требуемый признак, например, могут быть обнаружены, идентифицированы, отобраны и быстро использованы в последующих циклах селекции. Вариант по настоящему изобретению/признак могут быть также объединены в процессе селекции и отслежены в соответствии с настоящим изобретением наряду с признаком устойчивости к воздействию насекомых и/или другими признаками устойчивости к гербицидам. Один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к растению, выключающему вариант по настоящему изобретению, объединенный с геном, кодирующим устойчивость к гербициду дикамба.

Таким образом, настоящее изобретение может быть, например, объединено с признаками, кодирующими устойчивость к глифосату (например, растения, устойчивые к бактериальным генам EPSPS, GOX, GAT), устойчивость к глюфозинату (например, Pat, bar), устойчивость к гербициду, ингибирующему ацетолактат-синтазу (ALS) (например, имидазолиноны [такие как имазетапир], сульфонилмочевины, триазолопиримидинсульфонанилид, пиримидинилтиобензоат и другие химические вещества [Csr1, SurA и т.д.]), устойчивость к бромоксинилу (например, Bxn), устойчивость к ингибиторам фермента HPPD (4-гидроксифенилпируватдиоксигеназа), устойчивость к ингибиторам фитоендезатуразы (PDS), устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосистему II (например, psbA), устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосистему I, устойчивость к гербицидам, ингибирующим протопорфириногеноксидазу IX (РРО) (например, РРО-1), устойчивость к гербицидам на основе фенилмочевины (например, CYP76B1), ферменты, расщепляющие гербицид дикамба (см., например, заявку на патент США 20030135879), и другими, которые могут быть использованы отдельно или в разных комбинациях, обеспечивая эффективное уничтожение или предотвращение распространения сорняков и/или устойчивость к любому гербициду вышеуказанных классов.

Что касается дополнительных гербицидов, то в качестве некоторых дополнительных предпочтительных ингибиторов ALS (известных также как AHAS) можно указать триазолопиримидинсульфонанилиды (такие как клоранзулам-метил, диклозулам, флоразулам, флуметзулам, метозулам и пеноксзулам), пиримидинилтиобензоаты (такие как биспирибак и пиритиобак) и флукарбазон. Некоторые предпочтительные ингибиторы HPPD включают мезотрион, изоксафлутол и сулкотрион. Некоторые предпочтительные ингибиторы РРО включают флумиклорак, флумиоксазин, флуфенпир, пирафлуфен, флутиацет, бутафенацил, карфентразон, сулфентразон и простые дифениловые эфиры (такие как ацифлуорфен, фомесафен, лактофен и оксифлуо