Способ получения концентрата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа a/california/07/2009(h1n1)

Способ получения концентрата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа a/california/07/2009(h1n1)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству иммунобиологических препаратов. Предложенный способ получения рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) или A/California/07/2009(H1N1)-подобного позволяет использовать компонент в качестве действующего вещества высокоиммуногенных противогриппозных вакцин.

Предшествующий уровень техники

В мире каждый год регистрируются сезонные подъемы заболеваемости гриппом (эпидемии), вызванные вирусами типа А и В, приводящие к увеличению смертности и значительному экономическому ущербу. Как правило, заболевания вызывают вирусы гриппа типа А и В. В этой связи оправдано, руководствуясь рекомендациями ВОЗ, использовать поливалентные вакцины против гриппа, способные предотвратить заболевание различными сезонными подтипами вируса гриппа. Следовательно, большой интерес представляет масштабное получение высокоиммуногенных антигенов эпидемиологически актуальных штаммов для включения в состав таких противогриппозных вакцин.

Среди многих подтипов вирусов типа А в последние годы среди людей значительную долю в структуре сезонной заболеваемости занимают подтипы вируса гриппа A(H1N1). В 2009 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о возникновении пандемии гриппа у людей. Причиной явился новый вирус A/California/07/2009(H1N1), вызываемый им грипп условно был назван «свиным (калифорнийским) гриппом». В результате мутаций вирус гриппа свиней приобрел способность передаваться от человека к человеку, чем стал очень опасен и несмотря на отмену статуса «пандемия» в 2010 году, новый вирус был включен в состав сезонных вакцин как имеющий эпидемическое значение.

Разработки новых вакцин все чаще основаны на применении в качестве действующего компонента не классического антигена, а вектора на основе рекомбинантных вирусов, который способен экспрессировать ген целевого антигена. В частности, к таким препаратам относят противогриппозные вакцины содержащие в качестве вектора аденовирусы.

Рекомбинанатные псевдоаденовирусные наночастицы (РПАН) известны и являются генетической конструкцией, созданной на основе аденовируса человека пятого серотипа. Экспрессия генов гемагглютининов РПАНами происходит в организме после введения вакцины.

Однако специалисты, занимающиеся производством вакцин, содержащих в качестве антигена гемагглютинин вируса гриппа давно столкнулись с проблемой агрегации выращиваемых культур. В случае с рекомбинантными псевдоаденовирусными наночастицами такая проблема также присутствует, после заражения суспензионной культуры клеток РПАНами в процессе выращивания происходит продукция гемагглютининов с их локализацией на мембране клеток и дальнейшей агрегацией. Данный процесс негативно отражается на выходе урожая РПАН из биореактора и значительно увеличивает потери РПАН при дальнейшей очистке препарата. Причиной этого является природное предназначение гемагглютинина вируса гриппа связываться с вирусспецифическим рецептором клетки-хозяина и адсорбировать свои вирионы на поверхности клеток при осуществлении начальной стадии инфицирования. В состав такого рецептора входит сиаловая кислота, которая имеет важное значение для осуществления такого связывания. Из-за сравнительно низкой специфичности такого взаимодействия вирусы гриппа способны связываться с клетками самых разнообразных типов (Xiong X. Receptor binding properties of the influenza virus hemagglutinin as a determinant of host range - Рецептор-связывающие свойства гемагглютинина вируса гриппа, как детерминанта круга хозяев // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2014 - 385:63-91).

В случае вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) процесс его выращивания в культуре клеток осложнен еще больше. Нами были отмечены значительные трудности при выращивании в суспензионной культуре клеток общеизвестными методами именного этого штамма по сравнению с другими штаммами вируса гриппа А. Известно, что в процессе получения на эукариотических клетках, РПАН, экспрессирующие гемагглютинины штамма A/California/07/2009(H1N1) сильнее образуют агрегаты, дают очень слабое накопление и становятся менее стабильными по сравнению с РПАН, несущими гемагглютинины других сезонных штаммов. Возможно, это связано с мутационными изменениями в гене гемагглютинина «калифоринийского» штамма, находящимися в сайте связывания рецептора, что повышает их способность к связыванию с рецептором клеток и усиливает агрегацию (Wang W. A mutation in the receptor binding site enhances infectivity of 2009 H1N1 influenza hemagglutinin pseudotypes without changing antigenicity - Мутация в сайте связывания рецептора усиливает инфекционность гемагглютинина 2009 гриппа H1N1 - псевдотипа без изменения антигенности // Virology - 407 (2010) - 374-380).

Такие особенности в свойствах гемагглютинина вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) не позволяют выращивать РПАН, экспрессирующие ген этого гемагглютинина, по стандартной процедуре в больших титрах из-за сопутствующей сильной агрегации культуры клеток, что также увеличивает потери РПАН при очистке. Это делает невозможным масштабное промышленное производство противогриппозной вакцины и снижает его эффективность.

Как правило, снижение агрегации гемагглютининов и клеток в известных аналогичных способах решается за счет оптимизации схем очистки (Патент РФ №2535153). Этот способ получения высокоочищенных вирионных концентратов призван снизить, как следствие, влияние агрегации частиц на качество очистки и уменьшить потери антигена, но не способен предотвратить образование агрегатов на стадии выращивания. В результате процесс очистки получается многостадийным, затратным в материалах и по времени, но все равно не позволяет максимально снизить потери и улучшить чистоту препарата. Таким образом, снизить влияние агрегации клеточных культур гемагглютининами на процесс производства противогриппозных вакцин до сих пор так и не удалось, что говорит о наличии научно-технической проблемы.

Наиболее близким решением, известным из уровня техники и принятым за прототип, является способ выращивания рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц (РПАН), на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, штамма A/California/07/2009(H1N1), экспрессирующих гены гемагглютининов вирусов гриппа A/H1N1, предложенных в качестве компонента противогрипозных вакцин (Патент РФ №2507257).

В данном изобретении рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы собираются в клетках линии HEK293 (human embryonic kidney - почек эмбриона человека) (например, №300192, CLS, Germany). Геном данного типа клеток содержит область Е1, что позволяет рекомбинантным псевдоаденовирусным частицам с удаленной аналогичной областью собираться и размножаться в клетках этой линии. Сборка рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц сопровождается лизисом клеток, от момента трансдукции до момента лизиса клеток и получения новой генерации рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа проходит 48 часов.

Для роста клеток линии HEK293 в адгезионной культуре необходимо использовать среду DMEM (например, Invitrogen, №52100-047, США), содержащую 25 мМ глюкозы, 4 мМ Д-глютамина и 10% эмбриональной бычьей сыворотки, специальный инкубатор с поддержанием температуры +37°C и 5% CO₂.

Все применяемые в патенте культуральные методы выращивания были общеизвестными.

Поэтому у прототипа имеются существенные недостатки: представленная технология является лабораторной и не позволяет получать промышленные количества препарата с фармацевтическим качеством. Указанная активность рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц от 5×10⁷ до 5×10⁸ БОЕ/мл относится к совершенно неочищенному препарату и указана в качестве характеристики биологической активности штамма, так как описание стадии очистки отсутствует. Из знаний специалиста становиться очевидным, что потери РПАН после стадии очистки такого препарата будут значительными, зачастую доходя до 70-80%. Большую проблему представляет также процесс агрегации при выращивании культур, что приводит к слабому накоплению и, соответственно, к невозможности промышленного использования данного способа.

Следовательно, существует нерешенная научно-техническая проблема по процессу получения концентратов РПАН с геном гемагглютинина вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) или A/California/07/2009(H1N1)-подобного в количествах, достаточных для быстрого промышленного производства вакцин, что особенно важно при возникновении пандемических ситуаций.

Раскрытие изобретения

Техническая задача заявляемого изобретения направлена на разработку способа получения концентрата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) или A/California/07/2009(H1N1)-подобного, позволяющего получать концентрированный продукт с биологической активностью РПАН от ×10⁸ БОЕ/мл, фармацевтического качества, с достаточной хроматографической чистотой и пригодного для промышленного производства противогриппозных вакцин с высоким выходом.

Техническая задача решается за счет того, что в способе получения концентрата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) или A/California/07/2009(H1N1)-подобного, технологические стадии включают следующие последовательности:

- получение из мастер-банка производственной культуры клеток - рабочего банка производственной суспензионной культуры клеток с концентрацией 2,0×10⁶ кл/мл с увеличением выхода клеток не менее чем в 700 раз, и получение с увеличением активных единиц РПАН не менее чем в 33 раза из мастер-банка РПАН - рабочего банка РПАН с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/мл;

- подготовка образцов дезагрегированной стартовой культуры РПАН с активностью не менее 2×10⁸ БОЕ/мл из рабочего банка РПАН, полученного на предыдущей стадии, путем очистки от гемагглютининов, экспрессированных РПАН в процессе выращивания рабочего банка РПАН;

- проведение однораундовой инфекции производственной суспензионной культуры клеток с концентрацией клеток 1,0×10⁶ кл/мл в биореакторе с питательной средой посредством внесения дезагрегированной стартовой производственной культуры РПАН с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/мл, с получением в результате РПАН-содержащей суспензии неочищенной с титром не менее 10⁸ БОЕ/мл путем культивирования продолжительностью 24 часа с увеличением выхода активных единиц РПАН в процессе выращивания не менее чем в 10 раз, с дальнейшим осаждением клеточной массы центрифугированием и отведением отработанной питательной среды;

- ресуспендирование осажденной на предыдущей стадии клеточной массы в лизисном буфере, содержащем неионный детергент Triton Х-100 в концентрации 1% в течение 3 часов, затем однократное замораживание в течение 2 часов в криохранилище с последующим размораживанием суспензии на водяной бане при температуре 23-25°C, затем обрабатывание бензоназой, и проведение отделения РПАН от разрушенных клеток последовательно путем центрифугирования, ультрафильтрации, анион-обменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии, стерилизующей фильтрации с получением стерильного концентрата РПАН фармацевтического качества с высоким уровнем хроматографической чистоты и с титром не менее 5×10⁸ БОЕ/мл.

Фиг. 1

Результат анализа концентрата РПАН после эксклюзионной хроматографии.

Пик 1 - РПАН.

Результат анализа показал, что чистота полученных псевдоаденовирусных частиц 97%.

Реализация изобретения

Реализация изобретения подтверждается примерами. Примеры реализации изобретения осуществлены на вирусе гриппа A/California/07/2009(H1N1), но не ограничены им, а могут быть воспроизведены на любом A/California/07/2009(H1N1)-подобном штамме вируса гриппа, так как специалисты под данным названием подразумевают идентичность постоянно выделяемых штаммов в различных местах мира по отношению к эталонному вирусу A/California/07/2009 (H1N1).

Пример 1

Подготовительные работы

Получение из мастер-банка производственной культуры клеток - рабочего банка производственной суспензионной культуры клеток с концентрацией 2,0×10⁶ кл/мл с увеличением выхода клеток не менее чем в 700 раз и получение с увеличением активных единиц РПАН не менее чем в 33 раза из мастер-банка РПАН - рабочего банка РПАН с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/мл;

Основной принцип получения РПАН состоит в их выращивании на специализированной культуре эукариотических клеток, в которой возможно размножение РПАН. Мастер-банк клеток и мастер-банк РПАН были получены ранее, постоянно хранятся в криохранилище и используются в качестве стартовых культур для осуществления полного цикла производства серии вакцины.

Мастер-банк производственной культуры клеток. Расплодка культуры, называемая «мастер-банк клеток» хранится в криохранилище с концентрацией 2×10⁶ кл/мл. В качестве производственной использовали общеизвестную специализированную суспензионную культуру клеток HEK-293 (human embryonic kidney, линия эмбриональных клеток почки человека). Мастер-банк РПАН. Расплодка культуры РПАН хранится в виде «мастер-банка» с титром не менее 10⁸ БОЕ/мл в криохранилище (при температуре жидкого азота). РПАН в данном изобретении могут быть любые аденовирусные векторы на основе аденовируса 5 типа человека, экспрессирующие гены гемагглютининов вируса гриппа H1N1 типа А. РПАН должны быть репликативно-дефектными, чем достигается безопасность препарата. Данные конструкции могут быть получены общеизвестными генноинженерными манипуляциями, известными из современного уровня техники (например, как показано в патенте РФ №2507257).

Здесь и по тексту, активность (титр) РПАН измеряется в БОЕ (бляшко-образующие единицы). Количество БОЕ определяется широкоизвестным методом - по цитопатическому действию образца на слой клеток HEK293. Этот показатель характеризует количество активных вирусных частиц, сохранивших не только физическую целостность, но и физиологическую активность, т.е. способность проникать внутрь клеток и активизировать экспрессию своего генетического материала.

1) Приготовление питательной среды

Процесс начинали с приготовления питательной среды, пригодной для выращивания культуры клеток HEK-293.

Взяли пригодную для выращивания культуры клеток HEK-293 сухую питательную среду (например, CD293AGT) в количестве 118 г и растворяли ее в очищенной воде (Milli-Q) объемом 5 л с перемешиванием на магнитной мешалке. После растворения добавляли 1,65 л очищенной воды. Далее проводили стерилизацию жидкой питательной среды на системе фильтрации с вакуум-фильтрами с диаметром пор 0,22 мкм. Добавляли глутамин в стерильную среду в количестве 1,933 г (в концентрации 2,92×10-3 г/л непосредственно перед применением питательной среды). Все сыпучие компоненты взвешивали на электронных весах. Приготовление питательных сред производили в помещении, отдельном от боксов, предназначенных для работы с культурой клеток и культурой РПАН. Среды хранили в холодильнике при температуре +4°C.

Готовую среду транспортировали и использовали для осуществления дальнейших технологических процессов в культуральном боксе, вирусном боксе и реакторной.

Приготовленную и перемешанную питательную среду контролировали на стерильность. Измеряли показатель рН.

2) Культивирование и анализ рабочего банка клеточной суспензии

Для получения рабочего банка производственной культуры клеток использовали суспензионную культуру клеток линии HEK293 из мастер-банка. Культуру клеток в объеме 1,5 мл с концентрацией 2×10⁶ кл/мл, взятую из криохранилища, размораживали при 37°C. Далее пробирку центрифугировали, сливали надосадочную жидкость и добавляли питательную среду в объеме 1 мл. В стерильном культуральном боксе с ламинарным потоком класса В засевали 1,5 мл клеточной суспензии в пластиковую емкость с площадью поверхности 25 см² (содержащую 3,5 мл питательной среды). Культивировали в CO₂-инкубаторе до концентрации 1×10⁶ кл/мл (48-72 часов). Далее пересевали клеточную суспензию в пластиковую емкость с площадью поверхности 75 см² (содержащую 5 мл питательной среды, общий объем 10 мл). Начальная концентрация клеток составляет 0,5×10⁶ кл/мл. Культивировали в CO₂-инкубаторе до концентрации 2×10⁶ кл/мл (24-48 часов). Пересевали клеточную суспензию в пластиковую емкость с площадью поверхности 75 см² (содержащую 15 мл питательной среды, общий объем 25 мл). Начальная концентрация клеток составляла 0,8×10⁶ кл/мл. Культивировали в CO₂-инкубаторе до концентрации 2,0×10⁶ кл/мл (24-48 часов), что составляет ≈5,0×10⁷ кл. Далее пересевали клеточную суспензию в лабораторный биореактор (с мешалкой для культивирования клеток во флаконах) объемом 200 мл с 35 мл питательной среды (общий объем 60 мл). Далее лабораторный биореактор помещали в CO₂-инкубатор. Культивирование клеток проводили до достижения концентрации 2,0×10⁶ кл/мл. Засевали 60 мл клеточной суспензии из лабораторного биореактора объемом 200 мл в аналогичный лабораторный биореактор, но объемом 500 мл (с 90 мл питательной среды, полученный общий объем 150 мл). Культивировали в CO₂-инкубаторе до концентрации 2,0×10⁶ кл/мл (24-48 часов). В результате вырастили 3×10⁸ клеток. Далее пересеяли 150 мл клеточной суспензии из лабораторного биореактора объемом 500 мл в лабораторный биореактор объемом 2000 мл, добавив 250 мл питательной среды, таким образом, чтоб общий объем составлял 400 мл, начальная концентрация ≈0,8×10⁶ кл/мл. Культивировали в CO₂-инкубаторе до концентрации 2,0×10⁶ кл/мл (24-48 часов). По достижению необходимой концентрации добавляли 650 мл питательной среды (общий объем 1050 мл). Начальная концентрация ≈0,8×10⁶ кл/мл. Культивировали в CO₂-инкубаторе до концентрации 2,0×10⁶ кл/мл (24-48 часов).

По достижению необходимой концентрации часть полученной клеточной суспензии, в объеме 120 мл передали для начала выполнения стадии «Получение культуры РПАН» (Пример 3).

3) Получение рабочего банка культуры РПАН, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа

Использовали клеточную суспензию с предыдущей стадии. Стерильно отобрали 120 мл клеточной суспензии с лабораторного биореактора объемом 2000 мл и перелили ее в лабораторный биореактор объемом 500 мл, отстояли в течение 30 минут. Слили надосадочную жидкость (2/3 объема ≈80 мл). Довели оставшийся объем до 240 мл (добавили 200 мл питательной среды), таким образом, концентрация клеток составляла 1,0×10⁶ кл/мл.

В вирусном ламинар-боксе с ламинарным потоком класса В внесли 15 мл культуры РПАН из мастер-банка (с титром не менее 10⁸ БОЕ/мл) в лабораторный биореактор, содержащий полученную клеточную суспензию объемом 240 мл (общий объем 255 мл), и культивировали в нем 36-48 часов. Инкубировали в CO₂-инкубаторе. Провели анализ суспензии титрованием, титр составлял не менее 2×10⁸ БОЕ/мл.

Был проведен анализ образцов на выявление посторонних вирусов и RCA, на выявление ДНК Mycoplasma hominis, стерильность. Для этого анализируемые образцы рабочего банка общим объемом 5 мл были центрифугированы с целью концентрирования. Посторонних вирусов, RCA, ДНК Mycoplasma hominis не было выявлено, образцы были стерильны.

Таким образом, на данной стадии из 15 мл культуры РПАН (с титром не менее 10⁸ БОЕ/мл) было получено 250 мл культуры РПАН с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/мл.

Пример 2

Подготовка образцов дезагрегированной стартовой культуры РПАН с активностью не менее 2×10⁸ БОЕ/мл из рабочего банка РПАН, полученного на предыдущей стадии, путем очистки от гемагглютининов, экспрессированных РПАН в процессе выращивания рабочего банка РПАН

В стандартных схемах выращивания полученная на предыдущей стадии культура РПАН из рабочего банка сразу же идет на засев биореактора без каких-либо дополнительных манипуляций. В результате: во-первых, если штамм РПАН имеет низкий уровень накопления, сложно получить культуру для засева с требующимися по активности титрами; во-вторых, при внесении такой культуры в биореактор попадает большое количество экспрессированных на предыдущей стадии гемагглютининов, которые способствуют агрегации суспензионной культуры в биореакторе и снизят количество инфицированных РПАН клеток. Обе причины вызовут резкое снижение урожая РПАН. Введенная авторами дополнительная стадия в процессе производства заключается в определенной подготовке стартовой культуры РПАН.

Подготовка осуществляется путем очистки рабочего банка РПАН, полученного на предыдущей стадии, от гемагглютининов, экспрессированных РПАН в процессе выращивания, агрегирующих производственную клеточную культуру.

Отрицательное влияние агрегации клеток культуры выражается в значительном снижении эффективности инфекции культуры клеток РПАНами на последующем основном производственном цикле выращивания. При внесении в культуру клеток такого не очищенного рабочего банка РПАН гемагглютинины сразу же адсорбируются на рецепторах клеток культуры и агрегируют их, что не позволяет РПАНам инфицировать значительную часть клеток и в дальнейшем резко снижает выход РПАН. Кроме того, снижается степень агрегации культуры в процессе основного цикла выращивания, так как общее количество гемагглютининов будет меньшим и состоящим только из экспрессированных в данном производственном цикле. Снижение агрегации скажется на увеличении выхода РПАН на последующих стадиях очистки препарата.

В ходе экспериментов было установлено, что наиболее эффективным методом является введение дополнительной стадии очистки именно стартовой культуры РПАН перед внесением ее для засева биореактора.

Для проведения дезагрегации стартовой производственной культуры РПАН, полученной на предыдущей стадии объемом 250 мл с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/мл, ее подвергают очистке.

Очистка может осуществляться всеми приемлемыми методами, позволяющими удалить гемагглютинины из культуры, сохраняя при этом биологическую активность РПАН.

Авторы применяли методику очистки, полностью повторяющую содержащую все этапы разработанной авторами и описанной далее в примере 4 очистке для основного цикла.

В итоге после очистки было получено 5 мл стартовой дезагрегированной культуры РПАН с хроматографической чистотой 97%. Хранение осуществляли при +4°C. Непосредственно перед засевом биореактора объем стартовой культуры доводили до 250 мл питательной средой.

Пример 3

Получение культуры РПАН

Культуру РПАН получали путем однораундовой инфекции производственной суспензионной культуры клеток (происходит сборка РПАН в суспензии клеток).

Созданная авторами на данной стадии методика однораундовой инфекции позволила значительно увеличить выход РПАН из-за снижения агрегации.

Экспериментальным путем при подборе условий культивирования было установлено, что сбор урожая через 24 часа обеспечивает однократное инфицирование клеток суспензионной культуры HEK293 дезагрегированной стартовой культурой РПАН, это хотя и немного снижает выход РПАН на данной стадии, значительно увеличивает выход РПАН в дальнейшем после осуществления очистки из-за практически полного отсутствия агрегации клеток культуры. Этот метод назвали однораундовой инфекцией. Он основан на том, что время сборки и выхода частиц РПАН занимает около 24 часов. При проведении стандартного цикла выращивания на протяжении 48-96 часов происходит многократный выход собравшихся РПАН накопление и перезаражение клеток суспензионной культуры, (т.е. многораундовая инфекция) одновременно сопровождающийся увеличивающимся с каждым разом накоплением гемагглютининов с дальнейшим усилением агрегации.

1) Культивирование клеточной суспензии

В реакторном боксе с ламинарным потоком класса С в волновой биореактор монтировали стерильный мешок 10 л. Перелили туда оставшуюся с предыдущей стадии «Культивирование и анализ рабочего банка клеточной суспензии» (см. пример 1) клеточную суспензию и довели питательной средой до конечного объема 2380 мл (долив 1450 мл питательной среды). Культивирование продолжали 48-96 часов до достижения концентрации клеток 2,0×10⁶ кл/мл. Для контроля процедуры через каждые 24 часа проводили подсчет концентрации клеток в камере Горяева. В результате получили 2380 мл суспензии, содержащей ≈4,76×10⁹ клеток. Отстаивали клеточную суспензию в течение 30 минут. Сливали надосадочную жидкость (2/3 объема ≈1590 мл). Довели оставшийся объем до 4750 мл (добавили 3960 мл питательной среды), таким образом, концентрация клеток составила 1,0×10⁶ кл/мл.

Далее передали выращенную клеточную суспензию на следующую стадию «Сборка РПАН в суспензии клеток» для заражения культурой РПАН.

2) Сборка РПАН в суспензии клеток

Непосредственно сборку РПАН в суспензии клеток производили в биореакторе. Для этого далее засеяли дезагрегированной стартовой производственной культурой РПАН с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/мл, объемом 250 мл биореактор с клеточной суспензией объемом 4750 мл. Культивирование продолжали до достижения концентрации РПАН не менее 10⁸ БОЕ/мл 24 часов.

РПАН-содержащую клеточную суспензию проверяли на следующие показатели: определение стерильности и определение титра.

Таким образом, на данной стадии в качестве полупродукта из 250 мл культуры РПАН с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/мл получили 5 л РПАН-содержащей суспензии неочищенной с титром не менее 10⁸ БОЕ/мл (т.е. всего получено не менее 5×10¹¹ БОЕ РПАН) через 24 часа после засева биореактора.

3) Осаждение клеточной массы центрифугированием

Охарактеризованную РПАН-содержащую суспензию неочищенную из биореактора стерильно разливали в 6 центрифужных пробирок по 830 мл в каждую, уравновешивали. Центрифугировали при 6000 g в течение 15 мин. Отведенный супернатант в виде жидкой части (отработанная питательная среда, продукты метаболизма и др. физические частицы) инактивировали автоклавированием.

Твердый осадок является требуемой клеточной массой, содержащей РПАН.

Пример 4

Очистка культуры РПАН для получения концентрата фармацевтического качества.

Целевое вещество - рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы - имеют внутриклеточную локализацию, поэтому вначале требуется разрушить клетки и затем проводить очистку. Процесс сложен и проводится многостадийно. Проблемой также является агрегация клеток культуры гемагглютининами, хотя и в наименьшем количестве, но экспрессированными в процессе однораундовой инфекции.

Авторами экспериментальным путем была оптимизирована схема очистки препарата. Обычно применяемая стадия четырехкратного оттаивания-замораживания для разрушения клеток культуры с целью извлечения РПАН заменена на химический лизис. Схема очистки многостадийная и состоит из следующих ниже этапов.

а) Ресуспендирование в лизисном буфере

Для выполнения собственно очистки культуры РПАН разрушали клетки культуры химическим лизисом.

Для этого осадок, полученный на предыдущем этапе из 5 л РПАН-содержащей суспензии неочищенной, ресуспендировали в лизисном буфере.

Состав данного лизисного буфера был выяснен экспериментальным путем, по сравнению со стандартным способом многократного перемораживания использование химического лизиса более технологично - сокращает количество манипуляций с пробирками, снижает их количество и значительно сокращает время проведения стадии (только на заморозку уходит 8 часов), появляются возможности для масштабирования производства.

Лизисный буфер содержал следующие компоненты следующего состава: трис(гидроксиметил)аминометан 5 мМ, 1% Triton Х-100; магния хлорида гексагидрат 1 мМ, сахароза 5,0%; натрия хлорид 0.075 М, воды очищенной до 60 мл, рН 8.0. Обработку клеточной суспензии лизирующим буфером проводили в течение 3 часов. Коэффициент концентрации ×67. Объем РПАН-содержащей суспензии неочищенной (общего лизата) составил 80±5 мл.

б) Извлечение РПАН из РПАН-содержащей клеточной суспензии

Далее для более эффективного разрушения клеток, РПАН-содержащая суспензия однократно замораживалась в четырех флаконах объемом 50 мл (по 20 мл суспензии в каждом) в течение 2 часов в криохранилище.

Размораживали суспензию на водяной бане (23-25°C), не давая согреться. Содержимое всех пробирок объединяли в один стеклянный флакон. Визуально проводили контроль цветности, мутности суспензии.

Для удаления геномной клеточной ДНК к 80 мл РПАН-содержащей суспензии добавляли натрия хлорид до 1 М (20 мл натрия хлорид 5 М). Обрабатывали бензоназой до финальной концентрации 500 U/мл (≈160 мкл).

Проводили мягкое перемешивание, в течение 1,5 часов на водной бане (33-35°C).

На данной стадии из 0,08 л РПАН-содержащей суспензии (общий лизат) получили 0,1 л РПАН-содержащей суспензии (лизат).

в) Отделение РПАН от разрушенных клеток центрифугированием

Отделение РПАН от разрушенных клеток осуществляли центрифугированием. Отбирали супернатант, содержащий РПАН.

Растворенную РПАН-содержащую суспензию разливали в 4 центрифужные пробирки (по ≈25 мл в каждую), уравновешивали. Центрифугировали при 9000 g в течение 10 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки, повторяли дважды.

Супернатант перенесли в чистую емкость, закрыли многопортовой крышкой и поставили на магнитную мешалку для ультрафильтрации.

Осуществляли отвод осадка в виде клеточного дебриса на инактивацию для последующей утилизации.

Из РПАН-содержащей суспензии (лизат) объемом 0,1 л получали РПАН-содержащую суспензию (осветленный лизат) объемом 0,095 л.

Технологом отбирался супернатант в объеме 7×0,1 мл и проводился анализ на титр в БОЕ.

г) Ультрафильтрация

Большинство примесей, таких как фрагменты ДНК, белки клеток хозяина и другие примеси, связанные с технологическим процессом, имеют размер меньше, чем физический размер РПАН (около 70 нм). Поэтому нами применялась тангенциальная фильтрация, во время которой поток жидкости движется тангенциально (т.е. по касательной) к поверхности фильтра обычно в замкнутом контуре. Часть потока жидкости, которая проходит сквозь фильтр, носит название фильтрат или пермеат, а оставшаяся часть потока, которая не проходит сквозь фильтр и поступает на рециркуляцию - ретентат. Если в процессе тангенциальной фильтрации используется мембрана, размер пор которой составляет от 0,1 μм и до нескольких нанометров, то такой процесс носит название ультрафильтрации.

Очистка растворов с помощью УФ являются привлекательной из-за высокой производительности, низкой стоимости и легкому масштабированию. Также с помощью тангенциальной фильтрации можно осуществлять концентрирование продукта или замену буфера. Перед нами стояла задача определения условий протекания процесса ультрафильтрации, позволяющей избавиться от примесей, размер которых меньше размера РПАН, при сохранении высокого выхода активных псевдоаденовирусных частиц. При разработке процесса ультрафильтрации определили ряд параметров процесса:

I) мембрану (материал мембраны, размер пор);

II) нагрузку на мембрану, т.е. концентрацию целевого вещества в образце для нанесения;

III) скорость рециркуляции, температура процесса, время, степень замены буфера, трансмембранное давление.

В процессе ультрафильтрации отслеживали концентрацию псевдоаденовирусных частиц, так как более чем 50% материала может быть потеряно на этой стадии вследствие агрегации. Считается, что агрегацию может вызывать высокая локальная концентрация вирусных частиц вблизи поверхности мембраны. Таким образом, оптимизация данного шага являлась критичной для увеличения выхода продукта.

При отработке условий протекания процесса ультрафильтрации были проанализированы два вида мембран: мембраны из полиэфирсульфона с размером пор 300 и 500 кДа, а также мембраны из регенерированной целлюлозы с размером пор 300 и 1000 кДа. Оба материала являются гидрофильными, их характеризует низкая сорбция белковых молекул. Полученные результаты говорили о большей пропускной способности мембран из полиэфирсульфона по сравнению с мембраной из регенерированной целлюлозы и об их преимуществе с позиции сокращения времени процесса ультрафильтрации. Параллельно оценивалось удерживание целевого компонента в ретентате. Данные о влияние размера пор мембраны на выход активных РПАН в процессе ультрафильтрации показаны в таблице 1. Анализ количества вирусных частиц проводили по методу реакции бляшкообразования.

Полученные результаты говорят о том, что при использовании мембран с размером пор более 300 кДа часть рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц проходит сквозь мембрану, тем самым снижая выход продукта. Однако время процесса ультрафильтрации при использовании мембраны с размером пор 300 кДа увеличивается от 1,5 до 3 раз.

Параметры клеточной биомассы могут значительно отличаться для каждого культивирования. Было найдено, что наименьшим потерям на стадии ультрафильтрации соответствуют условия, когда количество вирусных частиц в образце, поступающем на стадию ультрафильтрации, эквивалентно приблизительно 50-100 л объема культивирования на квадратный метр площади мембраны.

В результате была разработана следующая схема ультрафильтрации.

Осветленный клеточный лизат поступал на стадию ультрафильтрации для избавления от примесей, размер которых меньше размера РПАН. Ультрафильтрацию осуществляли на предварительно подготовленной мембране из полиэфирсульфона 0,015 м² с размером пор 300 кДа. Раствор разбавляли в 4 раза буфером для ультрафильтрации, затем концентрировали до первоначального объема. В процессе ультрафильтрации контролировали величину трансмембранного давления в системе (0,6-1,0 бар).

Таким образом, ниже представлена разработанная стадия ультрафильтрации.

Сначала подготовили прибор для ультрафильтрации. Приготовили буфер для ультрафильтрации следующего состава: трис(гидроксиметил)аминометан 50 мМ, магния хлорида гексагидрат 2 мМ, сахароза 5,0%, натрия хлорид 1 М, вода для инъекций - до 1,62 л, рН 7,5.

Промыли систему 3 л воды очищенной до полного вымывания консервирующего раствора 0.1 М NaOH, (контроль рН - 6,0-7,0). Прокачали систему воздухом, уравновесили 0,3 л буфера для ультрафильтрации.

Провели собственно процесс ультрафильтрации.

Для этого суспензию объемом 95 мл довели буфером для ультрафильтрации до объема 400 мл и подвергли ультрафильтрации. Провели ультрафильтрацию использовав 1 л буфера для ультрафильтрации. Объем ретентата после ультрафильтрации составил ≈100 мл. Разбавили препарат в 4 раза «пустым» буфером (Трис 40 мМ). Полученный объем - 400 мл.

По окончанию измерили объем буфера (пермеата), прокаченного через мембрану.

Производили замер давления по манометру каждые 5 минут (оно не должно превышать 1,2 атм).

На данной стадии было израсходовано 0,095 л РПАН-содержащей суспензии (осветленный лизат) и получено 0,4 л РПАН-содержащей суспензии (ретентат).

5) Анион-обменная хроматография

Далее очистку производили путем анион-обменной хроматографии.

Процесс начинали с подготовки колонки.

Готовили буфер А, содержащий следующие компоненты: трис(гидроксиметил)аминометан 40 мМ, магния хлорида гексагидрат 2 мМ, сахароза 5,0%, натрия хлорид 0,5 М, вода для инъекций - до 2100 мл, рН 7,5.

Готовили буфер Б, содержащий следующие компоненты: трис(гидроксиметил)аминометан 40 мМ, магния хлорида гексагидрат 2 мМ, сахароза 5,0%, натрия хлорид 0,27 М, полисорбат-80 0,1%, вода для инъекций - до 1300 мл, рН 7,5.

Провели кондиционирование колонки буфером (фазой) Б - около 500 мл до выхода на плато показателя проводимости (42-44 мкС). Далее кондиционирование объема колонки буфером (фазой) А - около 500 мл до выхода на плато показателя проводимости (25.6 мкС).

Суспензию, содержащую РПАН, наносили на колонку 70/300, скорость потока 15 мл/мин. Проводимость наносимой пробы: 25.4-26 мкС. Объем колонки 400 мл.

Контролировали давление в процессе хроматографирования (не должно превышать 1 бар).

Проводили сорбирование фракций, содержащих РПАН. Для чего после нанесения препарата осуществлялась элюция примесей - 3.0 CV (1200 мл) буфера А. Далее снятие вирусного пика (фракция), содержащего РПАН, используя буфер Б - 2.0 CV (800 мл). Колонку кондиционировали буфером А - 1.0 CV (400 мл). Собирали фракции нужного пика - объем элюата 400 мл. Контролировали давление в процессе хроматографирования (не должно было превышать 1 бар).