Антитела, которые связывают интегрин альфа-v бета-8

Антитела, которые связывают интегрин альфа-v бета-8

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №61/524,708, поданной 17 августа 2011 г., и предварительной заявке США №61/646,111, поданной 11 мая 2012 г., содержание которых в полном объеме включено в данный документ в виде ссылки.

Ссылка на "список последовательностей", таблицу или листинг компьютерной программы - Приложение, представленное в текстовом файле ASCII

Список последовательностей, представленный в файле 81906-848664_ST25.TXT, созданном 17 августа 2012 г., 71601 байт, машинный формат IBM-PC, операционная система MS-Windows, включен в настоящий документ в виде ссылки.

Утверждение прав на изобретения, сделанные в рамках, финансируемых из федерального бюджета научных исследований и разработок

Настоящее изобретение было создано при правительственной поддержке согласно гранту №HL63993, NS-44155, U01 AI075443, присужденному Национальными институтами здоровья. Правительство имеет определенные права на изобретение.

Предпосылки создания изобретения

Многофункциональный цитокин TGF-β (трансформирующий фактор роста-β) оказывает влияние на иммунные, эндотелиальные, эпителиальные и мезенхимальные клетки в периоды развития и взрослой жизни беспозвоночных и позвоночных видов. У млекопитающих эти функции опосредуются тремя широко экспрессированными изоформами - TGF-β1, 2 и 3. Все три изоформы взаимодействуют с одними и теми же рецепторами на поверхности клеток (TGFBR2 и ALK5) и передают сигналы через одни и те же внутриклеточные сигнальные пути, которые вовлекают либо канонические (т.е. SMAD), либо неканонические (т.е. MAPK, JUN, PI3K, PP2A, Rho, PAR6) эффекторы передачи сигналов. В каноническом сигнальном пути TGF-β сигнал распространяется от рецептора TGF-β через фосфорилирование цитоплазматических SMAD-2/3, образование комплекса со SMAD-4, транслокацию комплекса SMAD-2/3/4 в ядро и связывание с SMAD элементами ответа, локализованными в промоторных областях многих генов, вовлеченных в фиброгенный ответ. Хотя изоформы TGF-β имеют сходных сигнальных партнеров, каждая из них служит определенным биологическим функциям. Изоформы TGF-β имеют различия в аффинности связывания с TGF-β рецепторами, механизме активации, интенсивности или длительности сигналирования либо в пространственном и/или временном распределении.

Нокаут и модели условной делеции (т.е. делеции гена только в одном органе (conditional deletion)) TGF-β изоформ, рецепторов и сигнальных медиаторов, а также реагенты, блокирующие функцию, мишенью для которых являются все изоформы TGF-β, выявили существенно важную роль TGF-β в развитии Т-клеток, сердца, легких, сосудов и неба. Мыши с дефицитом TGF-β1 либо умирают in utero (внутриутробно) вследствие дефектов васкулогенеза в желточном мешке, либо выживают до взрослого состояния, имея тяжелые аутоиммунные заболевания полиорганного характера. Генетическая делеция SMAD2, т.е. медиатора TGF-β-сигналирования, выявила, что он играет важную роль в раннем паттернинге и образовании мезодермы. Мыши, имеющие недостаток Smad3, являются жизнеспособными и плодовитыми, но у них проявляются мальформации конечностей, иммунная дисрегуляция, колит, карциномы толстой кишки и расширение альвеол. Во взрослых тканях сигнальный путь TGF-β вовлекается во взаимодействия иммунных, мезенхимальных и эпителиальных клеток для поддержания гомеостаза в ответ на стресс со стороны окружающей среды.

Гомеостатические пути, опосредуемые TGF-β, нарушаются в ответ на хронически повторяющееся повреждение. TGF-β является основным профиброгенным цитокином в ответной реакции на повреждение, замедляющим эпителиальное заживление раны. TGF-β ингибирует эпителиальную пролиферацию и миграцию, способствует апоптозу и увеличивает в объеме мезенхимальный компартмент, индуцируя рекрутмент фибробластов, сжимаемость фибробластов и отложение внеклеточного матрикса. Внутритрахеальный перенос аденовирусного рекомбинантного TGF-β1 в легкое грызунов резко увеличивает аккумуляцию фибробластов и экспрессию коллагена I типа и IIΙ типа вокруг дыхательных путей и в легочном интерстиции. Нейтрализующие анти-TGFβ антитела могут блокировать блеомицин или индуцированный радиацией фиброз легких.

Повышенная активность TGF-β может играть определенную роль в фиброзном заболевании легких, гломерулосклерозе и рестенозе сосудов сердца, первично опосредованных TGF-β1. TGF-β1 в организме человека многофункционален, на что указывают наследственные заболевания, вовлекающие либо сам TGF-β1, либо его сигнальные эффекторы. Мутации, которые повышают активность пути TGF-β, приводят к нарушениям метаболизма в костной ткани (т.е. болезнь Камурати-Энгельмана), соединительной ткани (т.е. синдром Марфана) и в аневризмам аорты (т.е. синдром Лойса-Дитца). Мутации, которые приводят к снижению активности пути TGF-β, коррелируют с раком. Однако роль TGF-β как опухолевого супрессора при раке неоднозначна, поскольку TGF-β может также способствовать росту и метастазированию опухолей.

Несмотря на множественные важные функции TGF-β, введение единичной дозы или кратковременное введение нейтрализующего пан-TGF-β антитела переносится хорошо. Побочных эффектов у грызунов при введении им доз, ингибирующих фиброз органов или рост клеток карциномы и метастазирование, не наблюдалось. Это лечение также эффективно ингибирует экспериментальный фиброз. Клинические испытания (I/II фаз) однократной дозы с использованием нейтрализующих пан-TGFβ антител для лечения метастатической почечно-клеточной карциномы, меланомы, фокально-сегментарного гломерулосклероза и идиопатического легочного фиброза продолжаются (Genzyme Corporation, доступ на genzymeclinicalresearch.com).

Краткое описание сущности изобретения

Предлагаются композиции антител, которые могут использоваться для диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с высокой активностью TGF-β, опосредованной αvβ8. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфически связывает αvβ8, при этом выделенное антитело ингибирует высвобождение активного зрелого TGFβ-пептида, но не ингибирует в значительной мере адгезию латентного TGF-β к αvβ8 на αvβ8-экспрессирующей клетке, при этом выделенное антитело связывает фиксированные (например, фиксированные в формалине) αvβ8-экспрессирующие клетки. Антитело с указанной активностью обозначено как 11Е8, причем этот термин включает аффинно-зрелые, гуманизированные, химерные и меченые версии антител 11Е8, а также их αvβ8-связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело специфически связывается с эпитопом на β8, расположенным в пределах SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR (области, определяющие комплементарность) тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 48, 49 и 50). В некоторых вариантах антитело содержит CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 51, 52 и 53). В некоторых вариантах антитело содержит CDR тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 10, и CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи 11E8Mut28. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи 11E8Mut28. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи 11E8Mut94. В некоторых вариантах антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи 11E8Mut94. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи 11E8Mut39. В некоторых вариантах антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи 11E8Mut39. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело связывается с эпитопом β8 с высокой аффинностью, например, с аффинностью, превышающей аффинность анти-αvβ8 антитела 37Е1, с аффинностью в наномолярном или пикомолярном диапазоне, или с Кд (константа диссоциации) порядка 10^-7, 10^–8, 10^-9 или ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело меньше 50 килодальтон (кДа), меньше 25 кДа или является одноцепочечным антителом (например, scFv). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-αvβ8 антитело 37Е1 или 37Е1В5 конкурирует с антителом 11Е8 за связывание с αvβ8 на αvβ8-экспрессирующей клетке. Предлагается также фармацевтическая композиция, содержащая описанное здесь выделенное антитело и фармацевтический вспомогательный компонент (эксципиент).

Кроме того, предлагается гуманизированное антитело, которое специфически связывает αvβ8, при этом выделенное антитело ингибирует высвобождение активного зрелого TGF8-пептида, но не ингибирует в значительной мере адгезию латентного TGF-β к αvβ8 на αvβ8-экспрессирующей клетке. Антитело с указанной активностью обозначено как h37E1B5 (гуманизированное 37Е1В5 или Hu37E1B5), причем этот термин относится к меченому h37E1B5 и его αvβ8-связывающим фрагментам. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело специфически связывается с эпитопом на β8, расположенным в пределах SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело специфически связывается с эпитопом β8 с высокой аффинностью, например, с аффинностью, превышающей аффинность анти-αvβ8 антитела 37Е1, с аффинностью в наномолярном или пикомолярном диапазоне, или с Кд порядка 10^-7, 10^-8, 10^-9 или ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело меньше 50 кДа, меньше 25 кДа или является одноцепочечным антителом (например, scFv). В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 9. Предлагается также фармацевтическая композиция, содержащая описанное здесь гуманизированное антитело и фармацевтический вспомогательный компонент.

Предлагаются также композиции антител, которые могут использоваться для диагностики заболеваний, ассоциированных с повышенной активностью TGF-β, опосредованной αvβ8. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфически связывает αvβ8, при этом антитело не ингибирует высвобождение активного зрелого TGFβ-пептида или адгезию латентного TGFβ к αvβ8 на αvβ8-экспрессирующей клетке; при этом выделенное антитело связывает фиксированные (например, фиксированные в формалине) αvβ8-экспрессирующие клетки или ткань и при этом антитело различает уровни экспрессии αvβ8 в клетке или ткани (например, антитело может использоваться для сравнения уровней экспрессии αvβ8 на различных клетках). Антитела с указанной активностью обозначены как 6В9 и 4F1, которые включают аффинно-зрелые, гуманизированные, химерные и меченые версии антител 6В9 и 4F1, а также их αvβ8-связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело специфически связывается с эпитопом на β8, расположенным в пределах SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп включает S95 человеческого β8, полноразмерная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах антитело содержит CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах антитело содержит CDR тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 18, и CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи 6B9Mut1. В некоторых вариантах антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи 6B9Mut1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах антитело содержит CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах антитело содержит CDR тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 20, и CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело связывается с эпитопом β8 с высокой аффинностью, например, с аффинностью в наномолярном или пикомолярном диапазоне, или с Кд порядка 10^-7, 10^-8, 10^-9 или ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело меньше 50 кДа, меньше 25 кДа или является одноцепочечным антителом (например, scFv). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-αvβ8 антитело 6В9 или 4F1 не конкурирует с антителами 37Е1, 37Е1В5 или 11Е8 за связывание с αvβ8 на αvβ8-экспрессирующей клетке. Предлагается также фармацевтическая композиция, содержащая описанные в заявке выделенные антитела и фармацевтический вспомогательный компонент.

Предлагаются также способы снижения TGFβ-сигналирования (снижение активности TGF-β, сокращение высвобождения зрелого активного TGF-β) у индивидуума, предусматривающие введение индивидууму фармацевтической композиции, содержащей антитело 11Е8 или h37E1B5 (описанные выше), для снижения TGFβ-сигналирования у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает по меньшей мере одним состоянием (заболеванием, нарушением), выбранным из группы, включающей воспалительное заболевание кишечника (IBD), хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), астму, артрит, фиброз печени, фиброз легких, воспалительное аутоиммунное заболевание головного мозга, рассеянный склероз, демиелинизирующее заболевание, нейровоспаление, болезнь почек, аденокарциному, сквамозную карциному, глиому и карциному молочной железы, а снижение TGFβ-сигналирования способствует улучшению состояния.

Предлагаются также способы диагностики αvβ8-ассоциированного заболевания у индивидуума, предусматривающие контактирование клетки, полученной от индивидуума, с описанным выше антителом 11Е8, 6В9 или 4F1 и детекцию связывания выделенного антитела с клеткой, где связывание выделенного антитела с клеткой указывает на то, что индивидуум страдает αvβ8-ассоциированным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения αvβ8-ассоциированное заболевание выбрано из группы, включающей воспалительное заболевание кишечника (IBD), хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), астму, артрит, фиброз печени, фиброз легких, воспалительное аутоиммунное заболевание головного мозга, рассеянный склероз, демиелинизирующее заболевание, нейровоспаление, болезнь почек, аденокарциному, сквамозную карциному, глиому и карциному молочной железы. В некоторых вариантах осуществления изобретения (например, в диагностических технологиях in vitro) клетка фиксируется. В некоторых вариантах осуществления изобретения αvβ8-ассоциированным заболеванием является IBD, и клетку получают из кишечника индивидуума (например, толстой кишки или других отделов кишечника). В некоторых вариантах αvβ8-ассоциированным заболеванием является артрит, и клетка является хондроцитом или хрящевой клеткой от индивидуума. В некоторых вариантах αvβ8-ассоциированным заболеванием является фиброз печени, и клетка является стеллатной клеткой печени индивидуума. В некоторых вариантах αvβ8-ассоциированным заболеванием является астма, COPD или фиброз легких, и клетку получают из дыхательных путей индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ также предусматривает введение фармацевтической композиции (содержащей антитело 11Е8, 37Е1В5 или h37E1B5) индивидууму.

Кроме того, предлагаются способы определения относительного уровня αvβ8-экспрессии на тестируемой клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ предусматривает контактирование тестируемой клетки с антителом 6В9, детекцию связывания антитела 6В9 с тестируемой клеткой и сравнение уровня связывания антитела 6В9 с уровнем связывания контрольной клетки для определения, тем самым, относительного уровня экспрессии αvβ8 на тестируемой клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ предусматривает контактирование тестируемой клетки с антителом 4F1, детекцию связывания антитела 4F1 с тестируемой клеткой и сравнение уровня связывания антитела 4F1 с уровнем связывания контрольной клетки для определения, тем самым, относительного уровня экспрессии αvβ8 на тестируемой клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения тестируемая клетка фиксируется (например, фиксируется в формалине). В некоторых вариантах контрольная клетка фиксируется. В некоторых вариантах осуществления изобретения контрольная клетка является клеткой дикого типа, нераковой клеткой. В некоторых вариантах контрольная клетка является здоровой клеткой (от индивидуума, не страдающего αvβ8-ассоциированным заболеванием). В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии является индикатором числа β8-геномных копий в клетке, так что, например, более высокий относительный уровень экспрессии по сравнению с нераковым контролем указывает на то, что тестируемая клетка имеет увеличенное число β8-геномных копий. В некоторых вариантах осуществления изобретения тестируемая клетка присутствует в биологическом образце от индивидуума (например, в in vitro образце биологической жидкости или ткани). В некоторых вариантах тестируемая клетка представляет собой клетку in situ индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ также предусматривает диагностику у индивидуума αvβ8-ассоциированного заболевания (описанного выше), если уровень экспрессии αvβ8 выше, чем нормальный в тестируемой клетке. Специалисту в данной области понятно, что контрольная клетка может быть клеткой от здорового индивидуума (например, репрезентативной клеткой нормальных уровней экспрессии) или может быть положительным контролем, например, известным как имеющий повышенный уровень экспрессии αvβ8, или может быть клеткой от индивидуума с αvβ8-ассоциированным заболеванием.

Дополнительно предлагается выделенное антитело, которое специфически связывается с αvβ8, при этом указанное антитело не ингибирует высвобождение активного зрелого TGFβ-пептида или адгезию латентного TGF-β к αvβ8 на αvβ8-экспрессирующей клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело специфически связывается с эпитопом на β8, расположенным в пределах SEQ ID NO: 1. Антитело с указанной активностью обозначено как 14Е5, причем этот термин включает аффинно-зрелые, гуманизированные, химерные и меченые версии антитела 14Е5, а также их αvβ8-связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах антитело содержит CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах антитело содержит CDR тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 12, и CDR легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи аффинно-зрелого антитела, выбранного из группы, состоящей из 14E5Mut11, 14E5Mut42, 14E5Mut54, 14E5Mut68, 14E5Mut65, 14E5Mut83 и 14E5Mut95. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID No: 12, и вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи аффинно-зрелого антитела, выбранного из группы, состоящей из 14E5Mut11, 14E5Mut42, 14E5Mut54, 14E5Mut68, 14E5Mut65, 14E5Mut83 и 14E5Mut95. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело связывается с эпитопом β8 с высокой аффинностью, например, с более высокой аффинностью, чем аффинность анти-αvβ8 антитела 37Е1, с аффинностью в наномолярном или пикомолярном диапазоне, или с Кд порядка 10^-7, 10^-8, 10^-9 или ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело меньше 50 кДа, меньше 25 кДа или является одноцепочечным антителом (например, scFv). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-αvβ8 антитело 37Е1 или 37Е1В5 конкурирует с антителом 14Е5 за связывание с αvβ8 на αvβ8-экспрессирующей клетке.

Предлагаются способы детекции присутствия αvβ8-экспрессирующей клетки, предусматривающие контактирование клетки с антителом 14Е5 и определение того, связывается ли антитело с клеткой, согласно которым связывание антитела с клеткой указывает на присутствие αvβ8-экспрессирующей клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения контактирование проводится in vivo. В некоторых вариантах контактирование проводится in vitro.

Такие способы могут применяться в методах диагностики у индивидуума αvβ8-ассоциированного заболевания, предусматривающих контактирование клетки от индивидуума с антителом 14Е5, описанным выше, и детекцию связывания выделенного антитела с клеткой, согласно которым связывание выделенного антитела с клеткой указывает на то, что индивидуум страдает αvβ8-ассоциированным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения αvβ8-ассоциированное заболевание выбрано из группы, включающей воспалительное заболевание кишечника (IBD), хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), астму, артрит, фиброз печени, фиброз легких, воспалительное аутоиммунное заболевание головного мозга, рассеянный склероз, демиелинизирующее заболевание, нейровоспаление, болезнь почек, аденокарциному, сквамозную карциному, глиому и карциному молочной железы. В некоторых вариантах осуществления изобретения αvβ8-ассоциированным заболеванием является IBD, и клетку получают из кишечника (например, толстой кишки или других отделов кишечника) индивидуума. В некоторых вариантах αvβ8-ассоциированным заболеванием является артрит, и клетка является хондроцитом или хрящевой клеткой от индивидуума. В некоторых вариантах αvβ8-ассоциированным заболеванием является фиброз печени, и клетка является стеллатной клеткой печени от индивидуума. В некоторых вариантах αvβ8-ассоциированным заболеванием является астма, COPD или фиброз легких, и клетку получают из дыхательных путей индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ предусматривает также введение фармацевтической композиции (содержащей антитело 11Е8, 37Е1В5 или h37E1B5) индивидууму.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлено выравнивание вариабельных областей тяжелых и легкой цепи для антител 37Е1, 37Е1В5 и гуманизированного антитела 37Е1В5. Отмечены последовательности CDR и каркасных участков.

На Фиг. 2 показана экспрессия человеческого β8 на стеллатных клетках печени ITGβ8 трансгенных мышей. На верхней панели показан контроль изотипов, в то время как на нижней панели показана экспрессия β8, определение которой производилось с использованием антитела 14Е5.

На Фиг. 3 показана экспрессия β8 на альвеолярных макрофагах легких, дендритных клетках, медиастинальных клетках лимфатических узлов, Т- и В-клетках и приведена сводная таблица данных окрашивания в других органах. A) Макрофаги легких: аутофлуоресцентные+, CD11Chi+, F480+, CD8+, CD11B-, Ly6G-, CD103-, Ly6C+/-, TCR-; B) Дендритные клетки легких: аутофлуоресцентные-, CD11C промежут.+, F480 (в основном отрицательные), CD8+, CD11B+, CD103-/+, Ly6C+/-, TCR-, Ly6G-, GR-1-C); C) Т-клетки легких: TCR αβ+, CD3+, B220-, класса II-, CD19-, неаутофлуоресцентные; D) В-клетки легких: TCR αβ-, CD3-, В220+, класса ΙΙ+, CD19+, неаутофлуоресцентные; E) Дендритные клетки медиастинальных лимфоузлов (MLN): аутофлуоресцентные-, CD11C промежут.+, CD11B+, МНС hi (главный комплекс гистосовместимости) класса II, F480-, Ly6C+/-, Ly6G- (вероятно CD8+, CD103+/-, GR-1+/-); F) В-клетки MLN: TCR αβ-, CD3-, Β220+, класса ΙΙ+, CD19+, неаутофлуоресцентные; G) Сводная таблица данных окрашивания в различных органах. Окрашивание проводилось с использованием гибридомного клона 14Е5.

На Фиг. 4 показано влияние введения 37Е1В5 на размер тонкой кишки (воспаление) у BACtg мышей.

На Фиг. 5 представлен снимок разреза тонкой кишки контрольных (без лечения) мышей и BACtg мышей, получавших лечение антителом 37Е1В5.

На Фиг. 6 показано, что антитела 4F1 и 6В9 специфически связываются с и окрашивают фиксированные в формалине клетки линии 293, экспрессирующие β8 (293 β8), но не трансфицированные клетки 293 (293 WT). Антитела окрашивают также фиксированные в формалине срезы головного мозга от трансгенных по интегрину β8 мышей (ITGβ8 BAC).

Фиг. 7: Гибридомный клон 4F1 специфически окрашивает фиксированные в формалине, залитые парафином головной мозг и легкое ITGβ8 ВАС трансгенных (Tg) мышей. Головной мозг или легкое ITGβ8 ВАС Tg-мышей или мышей дикого типа (WT) фиксировались в течение ночи в 10% буферном растворе формалина и затем подвергались процессу обработки тканей, заливки в парафин и приготовления срезов. Иммуноокрашивание проводилось таким же методом тепло-индуцированного поиска антигенов, какой описан выше, а детекция антител проводилась с использованием коммерческого набора (Dako).

Фиг. 8: Гибридомный клон 6В9 способен обнаруживать варьирование числа копий, как показывает иммуноокрашивание фиксированного в формалине, залитого в парафин головного мозга ITGβ8 ВАС трансгенной (Tg) мыши. Показаны три линии Tg-мышей (В, С и D) в сравнении с WT-мышами (нижняя панель). Число копий следующее: 1 копия (D---линия BAC/WT), 2 копии (В и С---линии BAC/WT; D---линия ВАС/ВАС) или 4 копии (В и С---линии ВАС/ВАС).

Фиг. 9: Рекомбинантный моноклональный кроличий IgG, происходящий из вариабельных доменов клона 4F1, способен обнаруживать варьирование числа копий, как показывает иммуноокрашивание фиксированного в формалине, залитого в парафин легкого ITGβ8 ВАС трансгенных (Tg) мышей. Показаны три линии Tg-мышей (В, С и D) в сравнении с WT-мышами (нижняя панель). Число копий следующее: 1 копия (D---линия BAC/WT), 2 копии (В и С---линии BAC/WT; D---линия ВАС/ВАС) или 4 копии (В и С---линии ВАС/ВАС).

Фиг. 10: Рекомбинантный моноклональный кроличий IgG, происходящий из вариабельных доменов клона 4F1, способен обнаруживать экспрессию αvβ8 иммуноокрашиванием фиксированного в формалине, залитого в парафин человеческого легкого, пораженного фиброзом. Стрелки указывают на окрашивание веретенообразных клеток, представляющих собой фибробласты, вкрапленные в плотную фиброзную соединительную ткань.

Фиг. 11А-11В: Последовательности вариабельной области тяжелой цепи для множества вновь открытых антител и их последующих аффинно-зрелых вариантов (обозначены как "Mut"). Аминокислоты, выделенные жирным шрифтом и подчеркиванием, указывают на отличия от в исходной ("wt") последовательности вариабельной области тяжелой цепи.

Фиг. 12А-12В: Последовательности вариабельной области легкой цепи для множества вновь открытых антител и их последующих аффинно-зрелых вариантов (обозначены как "Mut"). Аминокислоты, выделенные жирным шрифтом и подчеркиванием, указывают на отличия от исходной ("wt") последовательности вариабельной области легкой цепи.

Подробное описание изобретения

I. Введение

Трансформирующий фактор роста β (TGF-β) первоначально был охарактеризован как онкоген, способный индуцировать трансформированный фенотип в клетках неопухолевой природы. С тех пор были найдены иные члены семейства TGF-β на основе присутствия сходных аминокислотных доменов.

Некоторые изоформы TGF-β экспрессируются повсеместно у млекопитающих (TGF-β 1-3), но поддерживаются в неактивной форме за счет нековалентного взаимодействия с пропептидом - ассоциированным с латентностью доменом TGF-β (LAP). Для передачи сигнала TGF-β должен высвободиться из своего неактивного комплекса посредством процесса, называемого активацией TGF-β. Латентный комплекс TGF включает 3 компонента: активный (зрелый) TGFβ-димер, LAP (ассоциированный с латентностью пептид) и LTBP (латентный TGFβ-связывающий белок). LAP - это димер, связанный дисульфидной связью, который представляет собой N-концевой участок белка-предшественника TGF-β. Зрелый TGFβ-бело? представляет собой С-концевой участок (около 25 кДа) предшественника. Связь между TGFβ и LAP расщепляется протеолитически внутри аппарата Гольджи, но TGFβ-пропептид остается связанным с TGF-β нековалентными взаимодействиями. Комплекс TGF-β с LAP называется малым латентным комплексом (SLC). Эта ассоциация LAP и TGF-β обусловливает латентность. LAP-TGFβ-связанные является обратимым, и выделенные очищенные компоненты могут воссоединиться с образованием неактивного SLC. Как SLC, так и более крупный комплекс обозначены в описании как латентный TGF-β, поскольку оба они являются неактивными.

В общем смысле интегрины являются молекулами адгезии и опосредуют прикрепление клеток к белкам внеклеточного матрикса. Интегрин αvβ8 связывается с LAP TGF-β и опосредует активацию TGF-β1 and -β3 (Mu et al. (2002) J. Cell Biol. 159:493). Интегрин αvβ8-опосредованная активация TGF-β необходима для активации TGF-β in vivo (т.е. для высвобождения зрелого TGFβ-полипептида), поэтому αvβ8 является "стражем" TGFβ-функции. Интегрин αvβ8 экспрессируется в нормальном эпителии (например, в эпителии дыхательных путей), мезенхимальных клетках и нейронных тканях. Результаты, приведенные здесь, показывают, что интегрин αvβ8-опосредованная активация TGF-β может привести к развитию COPD (хронической обструктивной болезни легких), фиброза легких, артрита, воспалительного заболевания кишечника, фиброза печени и почек, воспалительных аутоиммунных заболеваний головного мозга и демиелинизирующих заболеваний (например, MS (рассеянный склероз), поперечный миелит, болезнь Девика, синдром Гийена-Барре), нейровоспаления, болезни почек и к росту и метастазированию раковых опухолей.

II. Терминология

Если конкретно не оговаривается иное, то употребляемые в описании научно-технические термины имеют общепринятое значение, понятное специалисту в данной области. См., например, Lackie, Dictionary of Cell and Molecular Biology, Elsevier (4^th ed. 2007); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Любые способы, устройства и материалы, сходные или эквивалентные описанным в заявке, могут применяться при осуществлении настоящего изобретения. Для облегчения понимания некоторых терминов, часто употребляемых в описании, ниже приводятся следующие их определения, не имеющие целью ограничить объем настоящего изобретения.

Термины "анти-αvβ8 антитело", "антитело, специфичное к αvβ8," "антитело к αvβ8" и "анти-αvβ8" употребляются в описании синонимично и относятся к антителу, которое специфически связывается с αvβ8. Равным образом, анти-β8 антитело (и подобные термины) относится к антителу, которое специфически связывается с β8. Описанные здесь анти-αvβ8 антитела и анти-β8 антитела связываются с белком, экспрессированным на αvβ8-экспрессирующих клетках.

Фиксированная клетка - это клетка, которая была подвергнута обработке с целью ингибировать клеточный метаболизм и законсервировать клетку для исследования. Фиксация традиционно практикуется в данной области техники, например, чтобы исследовать цитологические характеристики с помощью гистологии или исследовать экспрессию маркеров на поверхности клеток с помощью иммуноокрашивания и/или проточной цитометрии. Специалисту в данной области понятно, что клетка может фиксироваться в любом из целого ряда известных фиксирующих растворов, содержащих, например, формалин, формальдегид, параформальдегид, метанол, ацетон и др. Ткани могут фиксироваться аналогичным путем.

αvβ8-ассоциированное заболевание - это состояние, характеризующееся присутствием αvβ8-экспрессирующих клеток, при котором либо клетки, экспрессируют повышенный уровень αvβ8, либо количество αvβ8-экспрессирующих клеток увеличено по отношению к нормальному здоровому контролю. TGFβ-ассоциированные заболевания (заболевания, характеризуемые более высокой, чем нормальная, TGFβ-активностью) включают αvβ8-ассоциированные заболевания, так как αvβ8 в определенных условиях вовлекается в активацию TGF-β, как описано здесь.

"Нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам либо в одно-, либо в двухцепочечной форме и к комплементарным им последовательностям. Термин "полинуклеотид" относится к линейной последовательности нуклеотидов. Термин "нуклеотид", как правило, относится к одной единице полинуклеотида, т.е. мономеру. Нуклеотиды могут быть рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами или их модифицированными версиями. Примеры полинуклеотидов, рассматриваемых в изобретении, включают одно- и двухцепочечную ДНК, одно- и двухцепочечную РНК (включая миРНК (малые интерферирующие)) и гибридные молекулы, содержащие смеси одно- и двухцепочечных ДНК и РНК.

Слова "комплементарный" или "комплементарность" относятся к способности нуклеиновой кислоты в одном полинуклеотиде к спариванию с другой нуклеиновой кислотой во втором полинуклеотиде. Например, последовательность A-G-T комплементарна последовательности Т-С-А. Комплементарность может быть частичной, когда только некоторые из нуклеиновых кислот являются сопоставимыми согласно правилу спаривания оснований, или полной, когда все нуклеиновые кислоты являются сопоставимыми согласно правилу спаривания оснований.

Специалистам в данной области известно множество методов измерения специфических ДНК и РНК, которые используют технику гибридизации нуклеиновых кислот (см. Sambrook, Id.). Некоторые методы включают электрофоретическое разделение (например, Саузерн-блоттинг для обнаружения ДНК и нозерн-блоттинг для обнаружения РНК), но измерение ДНК и РНК может также проводиться в отсутствие электрофоретического разделения (например, с помощью количественной ПЦР, дот-блота или анализа на чипе).

Слова "белок", "пептид" и "полипептид" употребляются взаимозаменяемо для обозначения аминокислотного полимера или комплекса из двух или более взаимодействующих или связанных аминокислотных полимеров. Термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотный остаток является искусственным химическим миметиком соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам, к аминокислотным полимерам, содержащим модифицированные остатки, и к аминокислотному полимеру, не встречающемуся в природе.

Термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют подобно природным аминокислотам. Природные аминокислоты - это аминокислоты, кодированные генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые позднее модифицируются, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Термин "аналоги аминокислот" относится к соединениям, которые имеют одинаковую с природной аминокислотой основную химическую структуру, например, содержат α-углеродный атом, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионин-метил-сульфоний. Такие аналоги могут содержать модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют одинаковую с природной ами