Средство, индуцирующее иммунитет

Средство, индуцирующее иммунитет

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к средству, индуцирующему иммунитет, эффективному в качестве терапевтического и/или профилактического средства против злокачественного новообразования.

Уровень техники

Злокачественное новообразование является наиболее частой причиной смерти среди всех причин смерти, и современным методом его лечения, в основном, является хирургическое лечение, которое можно проводить в сочетании с лучевой терапией и/или химиотерапией. Несмотря на разработку в последнее время новых хирургических методов и открытие новых противораковых средств, до настоящего времени в лечении злокачественного новообразования, за исключением некоторых его форм, не было достигнуто больших успехов. В последние годы, благодаря достижениям в области молекулярной биологии и иммунологии злокачественных новообразований, были определены антигены злокачественных новообразований, распознаваемые цитотоксическими T-клетками, активными в отношении злокачественных клеток, а также гены, кодирующие антигены злокачественных новообразований, благодаря чему возросла надежда на антиген-специфическую иммунотерапию.

В иммунотерапии для уменьшения побочных эффектов пептид или белок, распознаваемый в качестве антигена, должен практически полностью отсутствовать в нормальных клетках и присутствовать только в злокачественных клетках. В 1991 г. Boon et al. Ludwig Institute in Belgium выделили антиген MAGE 1 меланомы человека, распознаваемый CD8-положительными T-клетками, методом экспрессионного клонирования кДНК с использованием аутологичной линии раковых клеток и активных в отношении злокачественного новообразования T-клеток (непатентный документ 1). Вслед за этим появилось сообщение о способе SEREX (серологической идентификации антигенов путем рекомбинантного экспрессионного клонирования), при котором опухолевые антигены, распознаваемые антителами, продуцируемыми в организме больного со злокачественным новообразованием в ответ на собственные злокачественные клетки пациента, идентифицируют с использованием способа экспрессионного клонирования генов (патентный документ 1, непатентный документ 2), и несколько антигенов злокачественных новообразований были выделены с помощью этого способа. Были начаты клинические испытания иммунотерапии злокачественного новообразования с использованием части антигенов злокачественных новообразований в качестве мишеней.

С другой стороны, как у человека, так у собак и у кошек также известен ряд опухолей, таких как опухоль молочной железы и плоскоклеточная карцинома, и статистика заболеваемости собак и кошек указывает на то, что они являются ведущей причиной смертности. Однако в настоящее время не существует какого-либо терапевтического, профилактического или диагностического средства, эффективного против злокачественных новообразований у собак и кошек. Поскольку большинство опухолей у собак и кошек обнаруживаются хозяевами только после того, как опухоли увеличиваются в размерах при прогрессировании заболевания, бывает слишком поздно обращаться за лечением, и даже в случае проведения хирургического удаления опухоли или введения предназначенного для лечения человека лекарственного средства (противоракового лекарственного средства или тому подобного), животные часто умирают вскоре после лечения. При таких обстоятельствах, если терапевтические и профилактические средства против злокачественных новообразований, эффективные для собак и кошек, будут доступны, ожидается, что будут разработаны способы их применения в случае злокачественного новообразования у собак.

Белок 1, подобный субъединице A катанина p60 (KATNAL1), был идентифицирован как белок, имеющий домен связывания микротрубочек (патентный документ 2, непатентный документ 3). Однако нет информации о том, что белок KATNAL1 обладает активностью индукции иммунитета против злокачественных клеток и, следовательно, что белок эффективен для лечения или профилактики злокачественных новообразований.

Документы предшествующего уровня техники

Патентные документы

[Патентный документ 1] US 5698396 B

[Патентный документ 2] JP 2004-8216 A

Непатентные документы

[Непатентный документ 1] Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991).

[Непатентный документ 2] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995).

[Непатентный документ 3] Rigden D.J. et al., FEBS Lett., Mar 4; 583(5): 872-8 (2009).

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые с помощью изобретения

Настоящее изобретение относится к обнаружению нового полипептида, эффективного для создания терапевтического и/или профилактического средства против злокачественного новообразования, и к получению полипептида для применения в средстве, индуцирующем иммунитет.

Способы решения проблем

Используя способ SEREX с использованием библиотеки кДНК, полученной из семенников собаки, и сыворотки, полученной у собаки с опухолью, авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для получения кДНК, кодирующей белок, который связывается с антителами, присутствующими в сыворотке, полученной из организма с опухолью, и на основании кДНК получили полипептид белка 1, подобного субъединице A катанина p60 собаки (далее в настоящем документе называемого KATNAL1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Кроме того, на основании генов человека и мыши, гомологичных полученному гену, были получены белки KATNAL1 человека и мыши, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4 и 6. Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти полипептиды KATNAL1 специфически экспрессируются в тканях или клетках рака молочной железы, опухоли головного мозга, перианальной аденокарциномы, нейробластомы, мастоцитомы, рака печени, рака предстательной железы, рака легкого, рака щитовидной железы и лейкоза. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение KATNAL1 в организм способствует индукции иммуноцитов против KATNAL1 в организме и регрессии в организме опухоли, экспрессирующей KATNAL1. Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что рекомбинантный вектор, способный экспрессировать полинуклеотид, кодирующий полипептид KATNAL1 или его фрагмент, вызывает противоопухолевый эффект в отношении клеток злокачественных новообразований, экспрессирующих KATNAL1, в организме.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что полипептид KATNAL1 обладает способностью быть презентированным антиген-презентирующими клетками, вызывая активацию и рост цитотоксических T-клеток, специфичных для пептида (активность индукции иммунитета), и, следовательно, что полипептид является эффективным для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований. Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что антиген-презентирующие клетки, которые приводят в контакт с полипептидом, и T-клетки, которые приводят в контакт с антиген-презентирующими клетками, являются эффективными для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований и, таким образом, осуществили настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение имеет следующие отличительные признаки.

(1) Средство, индуцирующее иммунитет, содержащее в качестве активного(ых) ингредиента(ов) по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, выбранный из полипептидов (a)-(c) ниже, и/или рекомбинантный(е) вектор(ы), содержащий(е) полинуклеотид(ы), кодирующий(е) по меньшей мере один полипептид, где рекомбинантный(е) вектор(ы) способен(ны) экспрессировать полипептид(ы) in vivo:

(a) полипептида, состоящего не менее чем из 7 последовательных аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:4, 2, 8, 10 и 12 из списка последовательностей;

(b) полипептида, последовательность которого не менее чем на 85% идентична полипептиду, указанному в (a), и состоящего не менее чем из 7 аминокислот; и

(c) полипептида, содержащего полипептид (a) или (b) в качестве части своей последовательности.

(2) Средство, индуцирующее иммунитет, по п. (1), отличающееся тем, что полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, 2, 8, 10 или 12 из списка последовательностей.

(3) Средство, индуцирующее иммунитет, по п. (1) или (2), представляющее собой средство для обработки антиген-презентирующих клеток.

(4) Средство, индуцирующее иммунитет, по п. (1) или (2), представляющее собой терапевтическое и/или профилактическое средство против злокачественного(ых) новообразования(ий).

(5) Средство, индуцирующее иммунитет, по п. (4), отличающееся тем, что злокачественное(ые) новообразование(ия) является(ются) злокачественным(ими) новообразованием(ями), экспрессирующим(и) KATNAL1.

(6) Средство, индуцирующее иммунитет, по п. (4) или (5), отличающееся тем, что злокачественное(ые) новообразование(ия) представляет(ют) собой рак молочной железы, опухоль головного мозга, перианальную аденокарциному, нейробластому, мастоцитому, рак печени, рак предстательной железы, рак легкого, рак щитовидной железы и/или лейкоз.

(7) Средство, индуцирующее иммунитет, по любому из пунктов (1)-(6), дополнительно содержащее иммуностимулятор.

(8) Средство, индуцирующее иммунитет, по п. (7), отличающееся тем, что иммуностимулятор представляет собой по меньшей мере один из иммуностимуляторов, выбранных из группы, состоящей из неполного адъюванта Фрейнда; монтанида; поли-I:C, а также их производных; олигонуклеотидов CpG; интерлейкина-12; интерлейкина-18; интерферона-α; интерферона-β; интерферона-ω; интерферона-γ; а также лиганда Flt3.

Эффект изобретения

Настоящее изобретение относится к новому средству, индуцирующему иммунитет, эффективному для лечения, профилактики, и/или тому подобному, злокачественного новообразования. Как конкретно описано в нижеприведенных примерах, введение полипептида по настоящему изобретению в организм способствует индукции иммуноцитов в организме, и уже имеющаяся в организме злокачественная опухоль может уменьшиться в размерах или регрессировать. Таким образом, полипептид является эффективным для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлен профиль экспрессии идентифицированного гена KATNAL1 в нормальных тканях, опухолевых тканях и линиях раковых клеток собаки. Номером 1 обозначен профиль экспрессии гена KATNAL1 собаки в различных тканях и клеточных линиях собаки; номером 2 обозначен профиль экспрессии гена GAPDH собаки в различных тканях и клеточных линиях собаки.

На фигуре 2 представлен профиль экспрессии идентифицированного гена KATNAL1 в нормальных тканях, опухолевых тканях и линиях раковых клеток человека. Номером 3 обозначен профиль экспрессии гена KATNAL1 человека в различных тканях и клеточных линиях человека; номером 4 обозначен профиль экспрессии гена GAPDH человека в различных тканях и клеточных линиях человека.

На фигуре 3 представлен профиль экспрессии идентифицированного гена KATNAL1 в нормальных тканях, опухолевых тканях и линиях раковых клеток мыши. Номером 5 обозначен профиль экспрессии гена KATNAL1 мыши в различных тканях и клеточных линиях мыши; номером 6 обозначен профиль экспрессии гена GAPDH мыши в различных тканях и клеточных линиях мыши.

Лучший вариант осуществления изобретения

Примеры полипептида, содержащегося в средстве, индуцирующем иммунитет, по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, включают следующие. В настоящем изобретении термин «полипептид» означает молекулу, образованную множеством аминокислот, соединенных пептидными связями, и включает не только полипептидные молекулы с большим количеством составляющих их аминокислот, но и низкомолекулярные молекулы с небольшим числом аминокислот (олигопептиды), а также полноразмерные белки. Настоящее изобретение также охватывает полноразмерные белки KATNAL1, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10 или 12.

(a) Полипептид, состоящий не менее чем из 7 последовательных аминокислот в полипептиде с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, 2, 8, 10 или 12 из списка последовательностей и обладающий активностью индукции иммунитета.

(b) Полипептид, состоящий не менее чем из 7 аминокислот, последовательность которого не менее чем на 85% идентична полипептиду (a), и обладающий активностью индукции иммунитета.

(c) Полипептид, содержащий полипептид (a) или (b) в качестве части своей последовательности и обладающий активностью индукции иммунитета.

В настоящем изобретении термин «имеющий аминокислотную последовательность» означает, что аминокислотные остатки расположены в указанном порядке. Таким образом, например, «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2» означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность Met Asn Leu Ala … (разрыв) … Glu Phe Gly Ser Ala, приведенную в SEQ ID NO: 2, при этом полипептид имеет длину 490 аминокислотных остатков. Кроме того, например, «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2» можно для краткости называть «полипептид SEQ ID NO:2». Это также относится к термину «имеющий последовательность оснований». В этом случае термин «имеющий» можно заменить выражением «состоящий из».

Используемый в настоящем документе термин «активность индукции иммунитета» означает способность к индукции иммуноцитов, которые секретируют цитокины, такие как интерферон, в организме.

Обладает ли полипептид активностью индукции иммунитета, можно определять, например, с помощью известного анализа ELISPOT. Более конкретно, например, как описано ниже в примерах, клетки, такие как мононуклеарные клетки периферической крови, получают из организма после введения в него полипептида, активность индукции иммунитета которого нужно оценить, и полученные клетки затем культивируют совместно с полипептидом, после чего измеряют количество(а) цитокина(ов), продуцируемого(мых) клетками, используя специфическое антитело/антитела, что позволяет измерять число иммуноцитов среди клеток. С помощью этого можно оценивать активность индукции иммунитета.

Альтернативно, как описано в нижеприведенных примерах, введение рекомбинантного полипептида по любому из пунктов (a)-(c), описанного выше, животному с опухолью приводит к регрессии опухоли вследствие его активности индукции иммунитета. Таким образом, вышеуказанную активность индукции иммунитета (далее в настоящем документе называемую «противоопухолевой активностью») можно также оценивать как способность подавлять рост клеток злокачественного новообразования или вызывать уменьшение в размерах или исчезновение раковой ткани (опухоли). Противоопухолевую активность полипептида можно подтверждать, например, как более конкретно описано в приведенных ниже примерах, наблюдением за тем, уменьшается ли в размерах опухоль, когда полипептид вводят в организм с имеющейся опухолью.

Альтернативно, противоопухолевую активность полипептида можно также оценивать по тому, демонстрируют ли T-клетки, стимулированные полипептидом (то есть, T-клетки, приведенные в контакт с антиген-презентирующими клетками, представляющими полипептид), цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток in vitro. Контакт между T-клетками и антиген-презентирующими клетками можно создавать путем их совместного культивирования в жидкой среде, как указано ниже. Измерение цитотоксической активности можно проводить, например, известным способом, называемым анализом с высвобождением ⁵¹Cr, который описан в журнале Int. J. Cancer, 58: стр. 317, 1994. В случаях, когда полипептид будут использовать для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования, оценку активности индукции иммунитета, предпочтительно, проводят, используя в качестве показателя противоопухолевую активность, хотя показатели этим не ограничиваются.

Каждая из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 8, 10 и 12 из списка последовательностей, раскрытых в настоящем изобретении, представляет собой аминокислотную последовательность белка KATNAL1, который был выделен способом SEREX с использованием библиотеки кДНК, полученной из семенников собаки, и сыворотки, полученной у собаки с опухолью, как полипептид, который специфически связывается с антителом, присутствующим в сыворотке собаки с опухолью, или гомолог полипептида у человека, коровы, лошади или курицы (см. пример 1). KATNAL1 человека, который является человеческим гомологом KATNAL1 собаки, который идентичен последовательности на 95% с точки зрения последовательности оснований и на 98% с точки зрения аминокислотной последовательности; KATNAL1 быка, который является гомологом быка, который идентичен последовательности на 91% с точки зрения последовательности оснований и на 97% с точки зрения аминокислотной последовательности; KATNAL1 лошади, который является гомологом лошади, который идентичен последовательности на 87% с точки зрения последовательности оснований и на 88% с точки зрения аминокислотной последовательности; и KATNAL1 курицы, который является гомологом курицы, имеет идентичность последовательности 81% с точки зрения последовательности оснований и 90% с точки зрения аминокислотной последовательности.

Полипептид (a) представляет собой полипептид, состоящий не менее чем из 7 последовательных, предпочтительно, 8, 9 или не менее чем 10 последовательных аминокислот в полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10 или 12, и обладающий активностью индукции иммунитета. Более предпочтительно, полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая идентична последовательности не менее чем на 85% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и особенно предпочтительно, полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 4, 8, 10 или 12. Как известно в данной области, полипептид, содержащий не менее чем 7 аминокислотных остатков, может проявлять свою антигенность и иммуногенность. Таким образом, полипептид, имеющий не менее чем 7 последовательных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, может обладать активностью индукции иммунитета и, следовательно, полипептид можно использовать для получения средства, индуцирующего иммунитет, по настоящему изобретению.

В принципе, известно, что, когда вызывают иммунитет путем введения полипептидного антигена злокачественного новообразования, обычно происходит следующий процесс: полипептид попадает в антиген-презентирующую клетку, а затем под действием пептидаз в клетке распадается на более мелкие фрагменты, после чего презентируется на поверхности клетки. Затем фрагменты распознаются цитотоксической T-клеткой или тому подобными, которые избирательно убивают клетки, презентирующие антиген. Размер полипептида, презентированного на поверхности антиген-презентирующей клетки, относительно невелик и составляет примерно 7-30 аминокислот. Вследствие этого, с точки зрения презентации полипептида на поверхности антиген-презентирующей клетки, одним из предпочтительных вариантов вышеописанного полипептида (a) является полипептид, состоящий из примерно 7-30 последовательных аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, 4, 8, 10 или 12, и более предпочтительно, полипептид, состоящий примерно из 8-30 или примерно из 9-30 является достаточным в качестве полипептида (a). В некоторых случаях эти относительно небольшие полипептиды представлены непосредственно на поверхности антиген-презентирующих клеток, не будучи включенными в антиген-презентирующие клетки.

Кроме того, полипептид, включенный в антиген-презентирующую клетку, расщепляется в случайных сайтах клеточными пептидазами с образованием различных полипептидных фрагментов, которые затем презентируются на поверхности антиген-презентирующей клетки. Вследствие этого, введение большого полипептида, такого как полноразмерная область SEQ ID NO:2, 4, 8, 10 или 12, неизбежно вызывает образование полипептидных фрагментов в результате деградации в антиген-презентирующей клетке, и эти фрагменты являются эффективными для вызывания иммунитета при помощи антиген-презентирующей клетки. Вследствие этого, также для вызывания иммунитета при помощи антиген-презентирующих клеток можно, предпочтительно, использовать большой полипептид, и полипептид может состоять не менее чем из 30, предпочтительно, не менее чем из 100, более предпочтительно, не менее чем из 200, еще более предпочтительно, не менее чем из 250 аминокислот. Еще более предпочтительно, полипептид может состоять из полноразмерной области SEQ ID NO:2, 4, 8, 10 или 12.

Полипептид (b) представляет собой тот же полипептид, что и полипептид (a), за исключением того, что небольшое число (предпочтительно, один или несколько) аминокислотных остатков заменены, делетированы и/или вставлены, который идентичен последовательности не менее чем на 90%, предпочтительно, не менее чем на 95%, более предпочтительно, не менее чем на 98%, еще более предпочтительно, не менее чем на 99% или не менее чем на 99,5% исходной последовательности и обладает активностью индукции иммунитета. В данной области хорошо известно, что часто бывают случаи, когда белковый антиген сохраняет почти такую же антигенность, что и исходный белок, даже если аминокислотная последовательность белка модифицирована таким образом, что небольшое число аминокислотных остатков заменены, делетированы и/или вставлены. Вследствие этого, поскольку полипептид (b) может также проявлять активность индукции иммунитета, его можно использовать для получения средства, индуцирующего иммунитет, по настоящему изобретению. Кроме того, полипептид (b) также, предпочтительно, представляет собой полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2, 4, 8, 10 или 12, за исключением того, что один или несколько аминокислотных остатков заменены, делетированы и/или вставлены. Используемый в настоящем документе термин «несколько» означает целое число от 2 до 10, предпочтительно, целое число от 2 до 6, более предпочтительно, целое число от 2 до 4.

Используемый в настоящем документе термин «идентичность последовательности» аминокислотных последовательностей или последовательностей оснований означает величину, рассчитанную путем сравнения двух аминокислотных последовательностей (или последовательностей оснований), которые предстоит сравнивать, таким образом, чтобы число совпадающих аминокислотных остатков (или оснований) было максимальным между аминокислотными последовательностями (или последовательностями оснований), и деления числа совпадающих аминокислотных остатков (или числа совпадающих оснований) на общее число аминокислотных остатков (или общее число оснований), данную величину представляют в процентном выражении. При сравнении один или более разрывов вносят в одну или обе последовательности, которые сравнивают, если это необходимо. Такое сравнение последовательностей можно проводить с использованием хорошо известной программы, такой как BLAST, FASTA или CLUSTAL W. Если вносят один или более разрывов, вышеописанное общее число аминокислотных остатков представляет собой число остатков, рассчитанное, если принимать один разрыв за один аминокислотный остаток. Если рассчитанное таким образом общее число аминокислотных остатков различается между двумя сравниваемыми последовательностями, идентичность последовательностей (%) рассчитывают путем деления числа совпадающих аминокислотных остатков на общее число аминокислотных остатков в более длинной последовательности.

Двадцать видов аминокислот, составляющих природные белки, можно разделить на группы, каждая из которых образована по принципу общности свойств, например, нейтральные аминокислоты с боковыми цепями, имеющими низкую полярность (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), нейтральные аминокислоты с гидрофобными боковыми цепями (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), кислые аминокислоты (Asp, Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys, His) и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp). Известно, что во многих случаях замена аминокислоты на другую аминокислоту из той же группы не меняет свойства полипептида. Вследствие этого, в случаях, когда аминокислотный остаток в полипептиде (а) по настоящему изобретению заменен, вероятность того, что активность индукции иммунитета будет сохранена, можно увеличить, если проводить замену внутри одной группы, что является предпочтительным.

Полипептид (с) представляет собой полипептид, который содержит полипептид (a) или (b) в качестве части своей последовательности и обладает активностью индукции иммунитета. То есть, полипептид (c) представляет собой полипептид, в котором одна или более аминокислот и/или один или более полипептидов добавлены на одном или обоих концах полипептида (a) или (b), и который обладает активностью индукции иммунитета. Такой полипептид также можно использовать для получения средства, индуцирующего иммунитет, по настоящему изобретению.

Вышеописанные полипептиды можно синтезировать, например, способом химического синтеза, таким как Fmoc-способ (способ с использованием флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc-способ (способ с использованием трет-бутилоксикарбонила). Кроме того, их можно синтезировать общепринятыми способами, используя коммерчески доступные пептидные синтезаторы различных типов. Кроме того, интересующий полипептид можно получать с использованием известных способов генной инженерии, получая полинуклеотид, кодирующий полипептид, и встраивая этот полинуклеотид в вектор экспрессии, с последующим введением полученного вектора в клетку-хозяина и созданием условий для продукции клеткой-хозяином этого полипептида.

Полинуклеотид, кодирующий вышеуказанный полипептид, может быть легко получен известными способами генной инженерии или общепринятым способом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, имеющую последовательность оснований SEQ ID NO:1, можно получать способом ПЦР с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК собаки в качестве матрицы, и пары праймеров, сконструированных таким образом, что с их помощью можно амплифицировать последовательность оснований SEQ ID NO:1. ДНК, имеющую последовательность оснований SEQ ID NO:3, можно аналогичным образом получать с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы. Можно соответствующим образом устанавливать условия для ПЦР, и примеры условий реакции включают, но ими не ограничиваются, повторение процесса реакции при 94°C в течение 30 секунд (денатурация), при 55°C в течение периода времени от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и при 72°C в течение 2 минут (удлинение) на протяжении, например, 30 циклов, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Кроме того, нужную ДНК можно выделять, создавая соответствующий зонд или праймер на основе информации о последовательности оснований или аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или 3 из списка последовательностей в настоящем описании, и проводя скрининг библиотеки кДНК собаки, человека, и тому подобных, с использованием зонда или праймера. Библиотеку кДНК, предпочтительно, получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок SEQ ID NO:2 или 4. Вышеописанные операции, такие как создание зонда или праймера, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование интересующего гена, известны специалистам в данной области, и могут быть выполнены способами, описанными в Molecular Cloning, второе издание; Current Protocols in Molecular Biology, и/или тому подобных. Из полученной таким образом ДНК можно получать ДНК, кодирующую полипептид (a). Кроме того, поскольку кодоны, кодирующие каждую аминокислоту, известны, последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего конкретную аминокислотную последовательность, можно легко определять. Вследствие этого, поскольку последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего полипептид (b) или полипептид (c), также можно легко определять, такой полинуклеотид также можно легко синтезировать общепринятым способом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот.

Клетки-хозяева не имеют ограничений при условии, что клетки способны экспрессировать описанный выше полипептид, и примеры клеток включают, но ими не ограничиваются, прокариотические клетки, такие как E. coli, и эукариотические клетки, такие как культивируемые клетки млекопитающих, включая клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичника китайского хомячка CHO; почкующиеся дрожжи; делящиеся дрожжи; клетки шелкопряда и яйцеклетки Xenopus laevis.

В случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используют вектор экспрессии, содержащий точку начала репликации, делающую возможной репликацию вектора в прокариотической клетке, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт клонирования ДНК, терминатор и/или тому подобное. Примеры вектора экспрессии для E. coli включают систему pUC, pBluescriptII, экспрессионную систему pET и экспрессионную систему pGEX. Путем встраивания ДНК, кодирующей вышеуказанный полипептид, в такой вектор экспрессии и трансформирования прокариотических клеток-хозяев таким вектором, с последующим культивированием полученных трансформантов, можно добиться экспрессии полипептида, кодируемого ДНК, в прокариотических клетках-хозяевах. В таком случае полипептид также может быть экспрессирован в виде слитого белка с другим белком.

В случаях, когда эукариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, в качестве вектора экспрессии используют вектор экспрессии для эукариотических клеток, содержащий промотор, сайт сплайсинга, сайт добавления поли(A) и/или тому подобное. Примеры такого вектора экспрессии включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV вектор, pRS, pcDNA3, pMSG и pYES2. Как и в предыдущем случае, путем встраивания ДНК, кодирующей вышеуказанный полипептид, в такой вектор экспрессии и трансформирования эукариотических клеток-хозяев таким вектором с последующим культивированием полученных трансформантов можно добиться экспрессии полипептида, кодируемого ДНК, в эукариотических клетках-хозяевах. В случаях, когда pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобные используют в качестве вектора экспрессии, вышеуказанный полипептид может быть экспрессирован в виде слитого белка, содержащего маркер, такой как His-таг, FLAG маркер, myc маркер, HA маркер или GFP.

Для введения вектора экспрессии в клетки-хозяева можно использовать хорошо известные способы, такие как электропорация, кальций-фосфатный способ, липосомный способ или способ с ДЭАЭ-декстраном.

Выделение и очистку интересующего полипептида из клеток-хозяев можно проводить при помощи сочетания известных способов разделения. Примеры известных способов разделения включают, но ими не ограничиваются, обработку денатурирующим средством, таким как мочевина, или сурфактантом; обработку ультразвуком; расщепление ферментами; высаливание или дробное осаждение растворителем; диализ; центрифугирование; ультрафильтрацию; гель-фильтрацию; SDS-ПААГ; изоэлектрическое фокусирование; ионообменную хроматографию; гидрофобную хроматографию; аффинную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию.

Полипептиды, полученные вышеуказанными способами, также включают, как упоминалось выше, полипептиды в форме слитого белка с другим произвольным белком. Примеры таких полипептидов включают слитые белки с глутатион-S-трансферазой (GST) и слитые белки с His-тагом. Такой полипептид в виде слитого белка также включен в объем настоящего изобретения, как описанный выше полипептид (c). Кроме того, в некоторых случаях, полипептид, экспрессируемый в трансформированной клетке, модифицируется различными способами в клетке после трансляции. Такой посттрансляционно модифицированный полипептид также включен в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает активностью индукции иммунитета. Примеры такой посттрансляционной модификации включают: удаление N-концевого остатка метионина; N-концевое ацетилирование; гликозилирование; ограниченное расщепление внутриклеточными протеазами; миристоилирование; изопренилирование и фосфорилирование.

Как описано более конкретно в нижеприведенных примерах, введение полипептида, обладающего активностью индукции иммунитета, в организм с опухолью делает возможной регрессию уже существующей опухоли. Вследствие этого, средство, индуцирующее иммунитет, по настоящему изобретению может быть использовано в качестве терапевтического и/или профилактического средства против злокачественного новообразования. Кроме того, полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, можно использовать в способе лечения и/или профилактики злокачественных новообразований путем индукции иммунитета.

Используемые в настоящем документе термины «опухоль» и «злокачественное новообразование» означают злокачественное новообразование и используются как взаимозаменяемые.

В данном случае формы злокачественного новообразования, которое предстоит лечить, не имеют ограничений, при условии, что ген, кодирующий полипептид SEQ ID NO:KATNAL1, экспрессируется при данной форме злокачественного новообразования, и злокачественное новообразование, предпочтительно, представляет собой рак молочной железы, опухоль головного мозга, перианальную аденокарциному, нейробластому, мастоцитому, рак печени, рак предстательной железы, рак легкого, рак щитовидной железы или лейкоз.

Животным, предпочтительно, является млекопитающее, более предпочтительно, такое млекопитающее, как примат, домашнее животное, сельскохозяйственное животное или спортивное животное, особенно предпочтительными, являются человек, собака или кошка.

Способ введения средства, индуцирующего иммунитет, по настоящему изобретению в организм может представлять собой либо пероральное введение, либо парентеральное введение, и, предпочтительно, представляет собой парентеральное введение, такое как внутримышечное введение, подкожное введение, внутривенное введение или внутриартериальное введение. В случаях, когда средство, индуцирующее иммунитет, используют для лечения злокачественных новообразований, его можно вводить в региональный лимфатический узел в непосредственной близости от опухоли, которую предстоит лечить, как описано в приведенных ниже примерах, в целях повышения его противораковой активности. Доза может быть любой дозой при условии, что эта доза эффективна для индукции иммунитета, и, например, в случаях, когда средство используют для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований, доза может быть дозой, эффективной для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования. Дозу, эффективную для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования, соответствующим образом выбирают в зависимости от размера, симптомов, и тому подобного, опухоли, и эффективная доза, как правило, составляет от 0,0001 мкг до 1000 мкг, предпочтительно, от 0,001 мкг до 1000 мкг на животное в сутки. Средство можно вводить один раз или несколько раз по частям. Средство, предпочтительно, вводят несколько раз по частям, раз в несколько дней или несколько месяцев. Как конкретно показано в приведенных ниже примерах, средство, индуцирующее иммунитет, по настоящему изобретению способно вызывать регрессию уже существующей опухоли. Вследствие этого, поскольку средство может проявлять свою противораковую активность также против небольшого количества клеток злокачественных новообразований на ранней стадии, развитие или рецидив злокачественного новообразования можно предотвращать, применяя средство до развития злокачественного новообразования или после лечения злокачественного новообразования. То есть, средство, индуцирующее иммунитет, по настоящему изобретению эффективно как для лечения, так и для профилактики злокачественных новообразований.

Средство, индуцирующее иммунитет, по настоящему изобретению может содержать только полипептид или может быть получено путем смешивания, по мере необходимости, с добавкой, такой как фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель, для каждого способа введения. Способы получения и добавки, которые можно использовать, хорошо известны в области разработки лекарственных препаратов, и можно использовать любые из способов и добавок. Конкретные примеры добавок включают, но ими не ограничиваются, такие разбавители, как физиологичес