Отличные от человека животные, экспрессирующие антитела с общей легкой цепью

Отличные от человека животные, экспрессирующие антитела с общей легкой цепью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, экспрессирующей антитела с общей легкой цепью с человеческими вариабельными/мышиными константными участками, связанной с различными тяжелыми цепями с человеческими вариабельными/мышиными константными участками. Настоящее изобретение относится к способу получения биспецифического человеческого антитела из генных последовательностей человеческого вариабельного участка В-клеток мыши.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Антитела обычно содержат гомодимерный компонент из тяжелых цепей, причем каждый мономер в виде тяжелой цепи связан с идентичной легкой цепью. Антитела с гетеродимерным компонентом из тяжелых цепей (например, биспецифические антитела) подходят в качестве терапевтических антител. Но получение биспецифических антител с подходящим компонентом в виде легкой цепи, который может удовлетворительно связываться с каждой из тяжелых цепей биспецифического антитела, оказалось проблематичным.

В соответствии с одним подходом легкая цепь может быть выбрана при помощи изучения статистических данных по частоте использования для всех вариабельных доменов легкой цепи, идентификации наиболее часто используемой легкой цепи в человеческих антителах и соединение такой легкой цепи in vitro с двумя тяжелыми цепями различной специфичности.

В соответствии с другим подходом легкая цепь может быть выбрана при помощи выявления последовательностей легких цепей в фаг-дисплейной библиотеке (например, фаг-дисплейной библиотеке, содержащей последовательности вариабельного участка легкой цепи человека, например, библиотека человеческого scFv) и отбора наиболее часто используемого вариабельного участка легкой цепи из библиотеки. Легкая цепь затем может быть протестирована на двух представляющих интерес тяжелых цепях.

В соответствии с другим подходом легкая цепь может быть выбрана посредством анализа фаг-дисплейной библиотеки вариабельных последовательностей легкой цепи с применением вариабельных последовательностей тяжелых цепей обеих представляющих интерес тяжелых цепей в качестве зондов. Легкая цепь, которая связывается с вариабельными последовательностями обеих тяжелых цепей, может быть выбрана в качестве легкой цепи для тяжелых цепей.

В соответствии с другим подходом возможная легкая цепь может быть выровнена с когнатными легкими цепями тяжелых цепей, и модификации осуществляют в легкой цепи для более точного совпадения характеристик последовательностей, общих для когнатных легких цепей обеих тяжелых цепей. Если необходимо минимизировать вероятность иммуногенности, то такие модификации предпочтительно приводят в результате к последовательностям, которые присутствуют в известных последовательностях легких цепей человека, с тем, чтобы при протеолитическом процессинге было маловероятно образование Т-клеточного эпитопа, исходя из известных в данной области техники параметров и способов оценки вероятности иммуногенности (т.е. in silico, а также мокрые анализы).

Все указанные выше подходы основаны на способах in vitro, которые характеризуются рядом a priori ограничений, например, идентичность последовательностей, способность связываться с конкретными предварительно отобранными тяжелыми цепями и т.д. В данной области техники существует потребность в композициях и способах, которые не основываются на манипуляциях с условиями in vitro, но которые вместо этого задействуют более биологически чувствительные подходы создания связывающихся с человеческим эпитопом белков, которые включают общую легкую цепь.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным мышам, которые экспрессируют вариабельные домены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека, причем мыши имеют ограниченный репертуар вариабельных доменов легкой цепи. Настоящее изобретение относится к биологической системе для создания вариабельного домена легкой цепи, который связывается и экспрессируется с разнообразным репертуаром вариабельных доменов человеческих тяжелых цепей со зрелой аффинностью. Настоящее изобретение относится к способам создания содержащих иммуноглобулиновые вариабельные домены связывающих белков, предусматривающим иммунизацию мышей, которые имеют ограниченный репертуар иммуноглобулиновых легких цепей, представляющим интерес антигеном и использование генной последовательности вариабельного участка иммуноглобулина мыши в связывающемся белке, который специфично связывает представляющий интерес антиген. Способы предусматривают способы получения вариабельных доменов тяжелых цепей иммуноглобулина человека, подходящие для применения при получении мультиспецифических антиген-связывающих белков.

Настоящее изобретение относится к генетически сконструированным мышам, у которых имеет место отбор подходящих вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина человека со зрелой аффинностью, полученных из репертуара неперестроенных генных сегментов вариабельного участка тяжелой цепи человека, причем человеческие иммуноглобулиновые вариабельные домены тяжелой цепи со зрелой аффинностью связываются и экспрессируются с одним вариабельным доменом легкой цепи человека, полученным с одного генного сегмента вариабельного участка легкой цепи человека. Настоящее изобретение относится к генетически сконструированным мышам, которые предлагают выбор двух генных сегментов вариабельного участка легкой цепи человека.

Настоящее изобретение относится к генетически сконструированным мышам, у которых экспрессируется ограниченный репертуар вариабельных доменов легкой цепи человека или отдельный вариабельный домен легкой цепи человека из ограниченного репертуара генных сегментов вариабельного участка легкой цепи человека. Мышей генетически конструируют так, чтобы они включали отдельный неперестроенный генный сегмент вариабельного участка легкой цепи человека (или два генных сегмента вариабельного участка легкой цепи человека), который перестраивается с образованием перестроенного гена вариабельного участка легкой цепи человека (или двух перестроенных генов вариабельных участков легкой цепи), которые экспрессируются в отдельную легкую цепь (или которые экспрессируются в любую из двух или обе легкие цепи). Перестроенные вариабельные домены легкой цепи человека способны образовывать пары с множеством выбранных мышами тяжелых цепей человека со зрелой аффинностью, причем вариабельные участки тяжелой цепи специфично связывают различные эпитопы.

Настоящее изобретение относится к генетически сконструированным мышам, у которых экспрессируется ограниченный репертуар вариабельных доменов легкой цепи человека или отдельный вариабельный домен легкой цепи человека из ограниченного репертуара последовательностей вариабельных участков легкой цепи человека. Мышей генетически конструируют так, чтобы они включали отдельную V/J последовательность легкой цепи человека (или две V/J последовательности), с которой экспрессируется вариабельный участок отдельной легкой цепи (или с которой экспрессируется любой один или оба вариабельных участка). Содержащая вариабельную последовательность легкая цепь способна образовывать пары с множеством клонально отбираемых мышами человеческих тяжелых цепей со зрелой аффинностью, причем вариабельные участки тяжелой цепи специфично связывают различные эпитопы.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, которая содержит отдельный генный сегмент вариабельного (V_L) участка легкой цепи иммуноглобулина человека, который может перестраиваться с человеческим генным сегментом J (выбранным из одного или множества сегментов J_L) и кодировать V_L домен легкой цепи иммуноглобулина человека. В соответствии с другим аспектом мышь содержит не более двух генных сегментов V_L, каждый из которых может перестраиваться с человеческим генным сегментом J (выбранным из одного или множества сегментов J_L) и кодировать человеческий V_L домен иммуноглобулиновой легкой цепи.

В соответствии с одним вариантом осуществления отдельный генный сегмент V_L человека является функционально связанным с генным сегментом J_L человека, выбранным из Jκ1, Jκ2, JκS, Jκ4 И Jκ5, причем отдельный генный сегмент V_L человека может перестраиваться с образованием последовательности, кодирующей ген вариабельного участка легкой цепи, с любым из одного или нескольких генных сегментов J_L человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления генетически модифицированная мышь содержит локус легкой цепи иммуноглобулина, которая не содержит эндогенный генный сегмент V_L мыши, который может перестраиваться с образованием гена иммуноглобулиновой легкой цепи, причем локус V_L содержит отдельный генный сегмент V_L человека, который может перестраиваться с тем, чтобы кодировать участок V_L гена легкой цепи. В соответствии с отдельным вариантом осуществления генный сегмент V_L человека представляет собой генный сегмент Vκ1-39Jκ5 человека или генный сегмент Vκ3-2Jκ1 человека. В соответствии с одним вариантом осуществления генетически модифицированная мышь содержит V_L локус, который не содержит эндогенный генный сегмент V_L мыши, который может перестраиваться с образованием гена легкой цепи иммуноглобулина, причем локус V_L содержит не более двух генных сегментов V_L человека, которые могут перестраиваться с тем, чтобы кодировать участок V_L гена легкой цепи. В соответствии с отдельным вариантом осуществления не более 2 генных сегментов V_L человека представляют собой генный сегмент Vκ1-39Jκ5 человека и генный сегмент Vκ3-20Jκ1 человека.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, которая содержит отдельный перестроенный (V/J) вариабельный участок (V_L) легкой цепи иммуноглобулина человека (т.е. участок V_L/J_L); который кодирует человеческий V_L домен легкой цепи иммуноглобулина. В соответствии с другим аспектом мышь содержит не более двух перестроенных участков V_L человека, которые способны кодировать человеческий V_L домен иммуноглобулиновой легкой цепи.

В соответствии с одним вариантом осуществления V_L участок является перестроенной последовательностью Vκ1-39/J человека или последовательностью Vκ3-20/3 человека. В соответствии с одним вариантом осуществления J_L сегмент человека перестроенной последовательности V_L/J_L выбирают из Jκ1, Jκ2, JκS, Jκ4 И Jκ5. В соответствии с конкретным вариантом осуществления V_L участок представляет собой последовательность Vκ1-39Jκ5 человека или последовательность Vκ3-20Jκ1 человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления мышь имеет как последовательность Vκ1-39Jκ5 человека, так и последовательность Vκ3-20Jκ1 человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления генный сегмент V_L человека является функционально связанным с человеческой или мышиной лидерной последовательностью. В соответствии с одним вариантом осуществления лидерная последовательность является мышиной лидерной последовательностью. В соответствии с конкретным вариантом осуществления мышиная лидерная последовательность является мышиной лидерной последовательностью Vκ3-7. В соответствии с конкретным вариантом осуществления лидерная последовательность является функционально связанной с неперестроенным генным сегментом V_L человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления лидерная последовательность является функционально связанной с неперестроенной последовательностью V_L/J_L человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления генный сегмент V_L является функционально связанным с промоторной последовательностью иммуноглобулина. В соответствии с одним вариантом осуществления промоторной последовательностью является промоторная последовательность человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления иммуноглобулиновым промотором человека является промотор Vκ3-15 человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления промотор является функционально связанным с неперестроенным генным сегментом V_L человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления промотор является функционально связанным с неперестроенной последовательностью V_L/J_L человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления локус легкой цепи содержит лидерную последовательность, фланкированную по 5' (по отношению к направлению транскрипции генного сегмента V_L) иммуноглобулиновым промотором человека и фланкированную по 3' генным сегментом V_L человека, который перестраивается с сегментом J человека и кодирует домен V_L реверсивной химерной легкой цепи, содержащей константный участок (C_L) эндогенной легкой цепи мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления генный сегмент V_L находится в локусе Vκ мыши, а мышиный C_L является мышиным Сκ.

В соответствии с одним вариантом осуществления локус легкой цепи содержит лидерную последовательность, фланкированную по 5' (по отношению к направлению транскрипции генного сегмента V_L) иммуноглобулиновым промотором человека и фланкированную по 3' перестроенным участком V_L человека (V_L/J_L последовательность) и кодирует домен V_L реверсивной химерной легкой цепи, содержащей константный участок (C_L) эндогенной легкой цепи мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления перестроенная последовательность V_L/J_L человека находится в мышином локусе каппа (κ), а мышиный C_L является мышиным Сκ.

В соответствии с одним вариантом осуществления локус V_L модифицированной мыши является локусом легкой цепи κ, и локус легкой цепи κ содержит интронный энхансер κ мыши, 3' энхансер κ мыши или как интронный энхансер, так и 3' энхансер.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит нефункциональный локус иммуноглобулиновой легкой цепи лямбда (λ). В соответствии с конкретным вариантом осуществления локус легкой цепи λ, содержит делецию одной или нескольких последовательностей локуса, причем одна или несколько делеций делает локус легкой цепи Λ не способным к перестройке с образованием гена легкой цепи. В соответствии с другим вариантом осуществления удалены все или практически все генные сегменты V_L локуса легкой цепи λ.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь производит легкую цепь, которая содержит подвергнутый соматической мутации домен V_L, происходящий от генного сегмента V_L человека. В соответствии с одним вариантом осуществления легкая цепь содержит подвергнутый соматической мутации домен V_L, происходящий от генного сегмента V_L человека, и Сκ участок мыши. В соответствии с одним вариантом осуществления мышь не экспрессирует легкую цепь λ.

В соответствии с одним вариантом осуществления генетически модифицированная мышь способна к соматической гипермутации последовательности участка V_L человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления мышь содержит клетку, которая содержит перестроенный ген легкой цепи иммуноглобулина, происходящий от генного сегмента V_L человека, который может перестраиваться и кодировать V_L домен, и ген перестроенной легкой цепи иммуноглобулина содержит подвергнутый соматической мутации домен V_L.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит клетку, которая экспрессирует легкую цепь, включающую подвергнутый соматической мутации домен V_L человека, связанный с Cκ мыши, причем легкая цепь связывается с тяжелой цепью, содержащей подвергнутый соматической мутации домен V_H, происходящий от генного сегмента V_H человека, а тяжелая цепь содержит константный участок (С_Н) тяжелой цепи мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления тяжелая цепь содержит С_Н1 мыши, шарнир мыши, С_Н2 мыши и С_Н3 мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления тяжелая цепь содержит С_Н1 человека, шарнир, С_Н2 мыши и С_Н3 мыши.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит замену эндогенных генных сегментов V_H мыши одним или несколькими генными сегментами V_H человека, причем генные сегменты V_H человека функционально связаны с геном С_Н участка мыши так, чтобы у мыши перестраивались генные сегменты V_H человека и экспрессировалась реверсивная химерная иммуноглобулиновая тяжелая цепь, которая содержит домен V_H человека и С_Н мыши. В соответствии с одним вариантом осуществления 90-100% неперестроенных генных сегментов V_H мыши заменены по меньшей мере одним неперестроенным генным сегментом V_H человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления все или практически все эндогенные генные сегменты V_H мыши заменены по меньшей мере одним неперестроенным генным сегментом V_H человека. В соответствии с одним вариантом осуществления замена осуществляется по меньшей мере 19, по меньшей мере 39 или по меньшей мере 80 или 81 неперестроенными генными сегментами V_H человека. В соответствии с одним вариантом осуществления замена осуществляется по меньшей мере 12 функциональными неперестроенными генными сегментами V_H человека, по меньшей мере 25 функциональными неперестроенными генными сегментами V_H человека или по меньшей мере 43 функциональными неперестроенными генными сегментами V_H человека. В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит замену всех мышиных сегментов D_H и J_H по меньшей мере одним неперестроенным сегментом D_H человека и по меньшей мере одним неперестроенным сегментом J_H человека. В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере один неперестроенный сегмент D_H человека выбран из 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27 и их комбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере один неперестроенный сегмент J_H человека выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6 и их комбинации. В соответствии с конкретным вариантом осуществления один или несколько генных сегментов V_H человека выбраны из 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 и 6-1 генного сегмента V_H человека и их комбинации.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит В-клетку, которая экспрессирует связывающий белок, который специфично связывает представляющий интерес антиген, причем связывающий белок содержит легкую цепь, полученную в результате перестройки Vκ1-39Jκ5 человека или перестройки Vκ3-20/Jκ1 человека, и причем клетка содержит перестроенный ген тяжелой цепи иммуноглобулина, полученной в результате перестройки генных сегментов V_H человека, выбранных из генного сегмента 1-69, 25, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59 и 5-51. В соответствии с одним вариантом осуществления один или несколько генных сегментов V_H человека перестраиваются с генным сегментом J_H тяжелой цепи человека, выбранным из 1, 2, 3, 4, 5 и 6. В соответствии с одним вариантом осуществления один или несколько генных сегментов V_H и J_H человека перестраиваются с генным сегментом D_H человека, выбранным из 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 и 7-27. В соответствии с конкретным вариантом осуществления ген легкой цепи имеет 1, 2, 3, 4 или 5 или более соматических гипермутаций.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит В-клетку, которая содержит перестроенную генную последовательность вариабельного участка иммуноглобулиновой тяжелой цепи, содержащей участок V_H/D_H/J_H, выбранный из 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/66/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/3-16/6, 5-51/5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1-69/6-6/5 и 1-69/6-13/4. В соответствии с конкретным вариантом осуществления В-клетка экспрессирует связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком тяжелой цепи мыши, и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком легкой цепи мыши. В соответствии с одним вариантом осуществления перестроенный участок V_L человека является последовательностью Vκ1-39Jκ5 человека, и у мыши экспрессируется реверсивная химерная легкая цепь, содержащая (i) V_L домен, полученный с последовательности V_L/J_L человека, и (ii) C_L мыши; причем легкая цепь связана с реверсивной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) С_Н мыши и (ii) подвергнутый соматической мутации домен V_H человека, полученный с генного сегмента V_H человека, выбранного из генного сегмента 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 и 6-1 V_H человека и их комбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется легкая цепь, которая подвергнута соматической мутации. В соответствии с одним вариантом осуществления C_L представляет собой Сκ мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления генный сегмент V_H человека выбран из генного сегмента 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51 и 1-69. В соответствии с конкретным вариантом осуществления подвергнутый соматической мутации домен V_H человека содержит последовательность, полученную от сегмента D_H, выбранного из 1-1. 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 и 7-27. В соответствии с конкретным вариантом осуществления подвергнутый соматической мутации домен V_H человека содержит последовательность, полученную от сегмента J_H, выбранного из 1, 2, 3, 4, 5 и 6. В соответствии с конкретным вариантом осуществления подвергнутый соматической мутации домен V_H человека кодируется перестроенной последовательностью V_H/D_H/J_H человека, выбранной из 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, 1-69/6-6/5 и 1-69/6-13/4.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит В-клетку, которая экспрессирует связывающий белок, который специфично связывает представляющий интерес антиген, причем связывающий белок содержит легкую цепь, полученную в результате перестройки Vκ1-39Jκ5 человека, и причем клетка содержит перестроенную генную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую участок V_H/D_H/J_H, выбранный из 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 и 1-69/6-13/4. В соответствии с конкретным вариантом осуществления В-клетка экспрессирует связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком тяжелой цепи мыши, и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком легкой цепи мыши.

В соответствии с одним вариантом осуществления перестроенный участок V_L человека является последовательностью Vκ3-20Jκ1 человека, и у мыши экспрессируется реверсивная химерная легкая цепь, содержащая (i) домен V_L, полученный с перестроенной последовательности V_L/J_L человека и (ii) C_L мыши; причем легкая цепь связана с реверсивной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) С_Н, мыши и (ii) подвергнутый соматической мутации домен V_H человека, полученный с генного сегмента V_H человека, выбранного из генного сегмента 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 и 6-1 V_H человека и их комбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется легкая цепь, которая подвергнута соматической мутации. В соответствии с одним вариантом осуществления C_L представляет собой Сκ мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления генный сегмент V_H человека выбран из генного сегмента 3-30, 3-33, 3-53, 4-39 и 5-51. В соответствии с конкретным вариантом осуществления подвергнутый соматической мутации домен V_H человека содержит последовательность, полученную от сегмента D_H, выбранного из 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 3-16 и 6-13. В соответствии с конкретным вариантом осуществления подвергнутый соматической мутации домен V_H человека содержит последовательность, полученную от сегмента J_H, выбранного из 3, 4, 5 и 6. В соответствии с конкретным вариантом осуществления подвергнутый соматической мутации домен V_H человека кодируется перестроенной последовательностью V_H/D_H/J_H человека, выбранной из 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5 и 3-53/1-1/4.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит В-клетку, которая экспрессирует связывающий белок, который специфично связывает представляющий интерес антиген, причем связывающий белок содержит легкую цепь, полученную в результате перестройки Vκ3-20Jκ1 человека, и причем клетка содержит перестроенную генную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую участок V_H/D_H/J_H, выбранный из 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 и 3-53/1-1/4. В соответствии с конкретным вариантом осуществления В-клетка экспрессирует связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком тяжелой цепи мыши, и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком легкой цепи мыши.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит как перестроенную последовательность Vκ1-39Jκ5 человека, так и перестроенную последовательность Vκ3-20Jκ1 человека, и у мыши экспрессируется реверсивная химерная легкая цепь, содержащая (i) домен V_L, полученный с последовательности Vκ1-39Jκ5 человека или последовательности Vκ3-20Jκ1 человека, и (ii) C_L мыши; причем легкая цепь связана с реверсивной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) С_Н, мыши и (ii) подвергнутый соматической мутации V_H человека, полученный от генного сегмента V_H человека, выбранного из генного сегмента 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 и 6-1 V_H человека и их комбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется легкая цепь, которая подвергнута соматической мутации. В соответствии с одним вариантом осуществления C_L представляет собой Сκ мыши.

В соответствии с различными вариантами осуществления вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком тяжелой цепи мыши, и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина человека, гибридизованный с константным участком легкой цепи мыши, экспрессируемым В-клеткой, являются когнатными у мыши. В соответствии с различными вариантами осуществления экспрессируемые мышью химерная легкая цепь и химерная тяжелая цепь являются когнатными у мыши.

В соответствии с одним вариантом осуществления 90-100% эндогенных неперестроенных генных сегментов V_H мыши заменены по меньшей мере одним неперестроенным генным сегментом V_H человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления все или практически все эндогенные неперестроенные генные сегменты V_H мыши заменены по меньшей мере одним неперестроенным генным сегментом V_H человека. В соответствии с одним вариантом осуществления замена осуществляется по меньшей мере 18, по меньшей мере 39, по меньшей мере 80 или 81 неперестроенными генными сегментами V_H человека. В соответствии с одним вариантом осуществления замена осуществляется по меньшей мере 12 функциональными неперестроенными генными сегментами V_H человека, по меньшей мере 25 функциональными неперестроенными генными сегментами V_H человека или по меньшей мере 43 неперестроенными генными сегментами V_H человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления генетически модифицированной мышью является линия C57BL, в соответствии с конкретным вариантом осуществления, выбранная из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/01a. В соответствии с конкретным вариантом осуществления генетически модифицированная мышь является комбинацией вышеупомянутой линии 129 с вышеупомянутой линией C57BL/6. В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления мышь является комбинацией вышеупомянутых линий 129 или комбинацией вышеупомянутых линий BL/6. В соответствии с конкретным вариантом осуществления линия 129 из комбинации является линией 129S6 (129/SvEvTac).

В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется реверсивное химерное антитело, содержащее легкую цепь, которая содержит Сκ мыши и подвергнутый соматической мутации домен V_L человека, полученный от перестроенной последовательности Vκ1-39Jκ5 человека или перестроенной последовательности Vκ3-20Jκ1 человека, и тяжелую цепь, которая содержит С_Н мыши и подвергнутый соматической мутации домен V_H человека, полученный с генного сегмента V_H человека, выбранного из генного сегмента 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 и 6-1 V_H человека, причем у мыши не экспрессируется полностью мышиное антитело и не экспрессируется полностью человеческое антитело. В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит локус легкой цепи κ, который содержит замену эндогенных генных сегментов легкой цепи κ мыши перестроенной последовательностью Vκ1-39Jκ5 человека или перестроенной последовательностью Vκ3-20Jκ1 человека и содержит замену всех или практически всех эндогенных генных сегментов V_H мыши полным или практически полным репертуаром генных сегментов V_H человека.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к мыши, у которой экспрессируется иммуноглобулиновая легкая цепь с перестроенной последовательностью иммуноглобулиновой легкой цепи в зародышевой линии мыши, причем иммуноглобулиновая легкая цепь содержит вариабельную последовательность человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления у зародышевой линии мыши отсутствует функционально неперестроенный генный сегмент V иммуноглобулиновой легкой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления у зародышевой линии мыши отсутствует функционально неперестроенный генный сегмент J иммуноглобулиновой легкой цепи.

В соответствии с одним вариантом осуществления зародышевая линия мыши содержит не более одной, не более двух или не более трех перестроенных последовательностей (V/J) легкой цепи.

В соответствии с одним вариантом осуществления перестроенная последовательность V/J содержит последовательность легкой цепи κ. В соответствии с конкретным вариантом осуществления последовательность легкой цепи κ представляет собой последовательность легкой цепи человека κ. В соответствии с конкретным вариантом осуществления последовательность легкой цепи κ выбирают из последовательности Vκ1-39/J человека, последовательности Vκ3-20/J человека и их комбинаций. В соответствии с конкретным вариантом осуществления последовательность легкой цепи представляет собой последовательность Vκ1-39Jκ5 человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления последовательность легкой цепи представляет собой последовательность Vκ3-20Jκ1 человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь дополнительно содержит в своей зародышевой линии последовательность, выбранную из интронного энхансера к мыши, 5' по отношению к перестроенной иммуноглобулиновой последовательности легкой цепи, 3' энхансера к и их комбинации.

В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит неперестроенный генный сегмент V_H человека, неперестроенный генный сегмент D_H человека и неперестроенный генный сегмент J_H человека, причем указанные генные сегменты V_H, D_H и J_H могут перестраиваться с образованием вариабельной генной последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, функционально связанной с константной генной последовательностью тяжелой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления мышь содержит множество генных сегментов V_H, D_H и J_H человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления генные сегменты V_H, D_H и J_H человека заменяют эндогенные генные сегменты V_H, D_H и J_H мыши в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления мышь содержит замену всех или практически всех функциональных генных сегментов V_H, D_H и J_H мыши на все или практически все функциональные генные сегменты V_H, D_H и J_H человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется иммуноглобулиновая легкая цепь, которая содержит константную последовательность мыши. В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется иммуноглобулиновая легкая цепь, которая содержит константную последовательность человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется иммуноглобулиновая тяжелая цепь, которая содержит мышиную последовательность, выбранную из последовательности С_Н1, шарнирной последовательности, последовательности С_Н2, последовательности С_Н3 и их комбинации.

В соответствии с одним вариантом осуществления у мыши экспрессируется иммуноглобулиновая тяжелая цепь, которая содержит человеческую последовательность, выбранную из последовательности С_Н1, шарнирной последовательности, последовательности С_Н2, последовательности С_Н3 и их комбинации.

В соответствии с одним вариантом осуществления перестроенная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина в зародышевой линии мыши находится в эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина мыши. В соответствии с конкретным вариантом осуществления перестроенная последовательность легкой цепи иммуноглобулина в зародышевой линии мыши заменяет все или практически все последовательности V и J легкой цепи мыши в эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина мыши.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к мышиной клетке, которая выделена из описываемой в настоящем документе мыши. В соответствии с одним вариантом осуществления клетка представляет собой ES клетку. В соответствии с одним вариантом осуществления клетка представляет собой лимфоцит. В соответствии с одним вариантом осуществления лейкоцит представляет собой В-клетку.

В соответствии с одним вариантом осуществления В-клетка экспрессирует химерную тяжелую цепь, включающую вариабельный домен, полученный с генного сегмента человека, и легкую цепь, полученную с перестроенной последовательности Vκ1-39/J человека, перестроенной последовательности Vκ3-20/J человека или их комбинации; причем вариабельный домен тяжелой цепи гибридизирован с константным участком мыши или человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к В-клетке мыши, которая выделена из описываемой в настоящем документе мыши, причем В-клетка экспрессирует химерную тяжелую цепь, полученную с перестроенной последовательности V_H/D_H/J_H человека, выбранной из 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 и 1-69/6-13/4; и химерную легкую цепь, полученную с перестроенной последовательности Vκ1-39Jκ5 человека; причем вариабельный домен гибридизован с константным участком мыши, и вариабельный домен легкой цепи гибридизован с константным участком мыши.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к В-клетке мыши, которая выделена из описываемой в настоящем документе мыши, причем В-клетка экспрессирует химерную тяжелую цепь, полученную с перестроенной последовательности V_H/D_H/J_H человека, выбранной из 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 и 3-53/1-1/4; и химерную легкую цепь,