Новая бактерия и ее экстракты и их применение в терапии

Новая бактерия и ее экстракты и их применение в терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новому штамму бактерий, выделенных из почвенно-грунтовых вод и охарактеризованных. Изобретение также относится к бактериальным экстрактам и их терапевтическому применению, особенно, в контексте лечения воспаления.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым композициям, представляющим интерес в лечении и предупреждении хронических кишечных воспалительных нарушений и периодонтита.

В развитых странах отмечается рост заболеваемости острым колитом, синдромом раздраженного кишечника и болезнью Крона, этими заболеваниями страдает приблизительно 1,4 миллиона американцев (Arijs, I. et al., 2009. PLoS ONE.4:e7984, and Hill, D.A. and D. Artis. 2010. Annu. Rev. Immunol. 28:623-67 and Kaser, A. et al., 2010. Annu. Rev. Immunol. 28:573-621). Болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, поражает отделы пищеварительного тракта, преимущественно подвздошную кишку (терминальный отдел тонкого кишечника) и толстую кишку. Стенка пораженного кишечника становится отечной. При прогрессировании отек стенки кишечника приводит к уменьшению диаметра кишечника. Также может иметь место эволюция в направлении фиброза, на почве которого развивается стеноз (контрактация).

Заболевание характеризуется наличием изъязвлений различной площади и глубины, которые пронизывают стенку (фиссуры), вызывая таким образом появление абсцессов и фистул. Это заболевание поражает лиц обоего пола и возникает, как правило в возрасте от 20 до 40 лет. При типичной форме оно развивается медленно и постепенно. Эпизоды диареи и неясно выраженной абдоминальной боли являются типичной симптоматикой на протяжении нескольких месяцев или лет.

При развернутой стадии заболевания основным симптомом является диарея умеренной интенсивности, иногда сопровождающаяся жирным стулом и изредка появлением крови. С заболеванием также ассоциированы постоянная непроходящая боль в правой подвздошной ямке или пароксизмальная или атипическая боль. Другими важными симптомами являются потеря веса и лихорадка. Признаки варьируют в зависимости от локализации поражений.

При прогрессировании заболевания наблюдаются внезапные обострения, которые различаются по интенсивности и часто подвергаются спонтанной регрессии.

Однако, часто наблюдаются осложнения, которые могут требовать проведения множественных хирургических вмешательств: обструкция кишечника, кишечные фистулы, прободение кишечника, фистулы (отверстия), сообщающиеся с кожей или органами брюшной полости, аноректальные осложнения (фиссуры, абсцессы).

Помимо хирургических процедур существует лечение моноклональными антителами (анти-TNF, анти-IL-12/р40 или анти-IL-23/р40), которое вызывает временное облегчение при болезни Крона, но его недостатком является чрезвычайно высокая стоимость.

В этой связи, в изобретении, описанном в данной патентной заявке, предложен другой эффективный и гораздо менее дорогостоящий подход для облегчения состояния пациентов, страдающих этим заболеванием.

Болезнь Крона является многофакторным и комплексным заболеванием. Один факторов, связанных с этим заболеванием, имеет иммунологическую природу. В последних публикациях было показано, что происходит «срыв» иммунной системы хозяина: было доказано, что провоспалительные и противовоспалительные реакции становятся несоразмерными и усиленными. Предполагают нарушение регуляции иммунной системы: изменение профиля Th1, усиленное продукцией IL-12, и профиля Th17, усиленное повышением IL-23, нарушение естественной флоры кишечника и нарушенную толерантность, что приводит к неадекватным местным и системным иммунным ответам, вызывающим иммунный ответ против нарушенной кишечной флоры, в результате чего запускаются патогенетические процессы (активация Т клеток, появление воспалительных цитокинов, антител к кишечным бактериям) (Abraham С.and Cho J.H., N Engl J Med 2009:361:2066-78).

Cenac et al., (Am J Pathol. 2002.161:1903-1915) обнаружили, что активация активируемого протеиназами рецептора-2 (proteinase-activated receptor-2, PAR2) вызывала острое воспаление кишечника у животных. В желудочно-кишечном тракте имеет место повышенная экспрессия PAR2: в эндотелиальных клетках, миоцитах толстой кишки, энтероцитах, нейронах кишечника, иммунных клетках и т.д. Протеазы (трипсин, триптаза), присутствующие в большом количестве в желудочно-кишечном тракте, расщепляют PAR2 со стороны М-конца, что приводит к экспонированию особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации). Вследствие этого активируется образование провоспалительных цитокинов и запускаются воспалительные реакции (Vergnolle, N. 2005. Gut. 54:867-874 and Vergnolle, N. 2009. Pharmacol. Ther. 123:292-309). Этот феномен наблюдается у мышей дикого типа, но не проявляется у мышей с генным нокаутом (KO) (с отсутствием PAR2). Лечение антипротеазами и/или антагонистами PAR2 дает возможность избежать развития этих воспалительных явлений.

Подобно гингивиту, периодонтит представляет собой воспалительное заболевание периодонта, т.е. специализированных тканей, окружающих и поддерживающих зуб: десен, зубного цемента, периодонтальных связок и альвеолярной кости. Он часто сопровождается альвеолоклазией (разрушением костной ткани). Хронический периодонтит может развиться в любом возрасте, но чаще наблюдается у взрослых. Он является многофакторным заболеванием (связан с генетическими факторами и факторами окружающей среды). Хронический периодонтит вызывают и поддерживают бактерии биопленки на поверхности зубов.

Вместе с тем, механизмы иммунной защиты играют важную роль в его патогенезе. В последних исследованиях было обнаружено, что PAR2 играет важную роль при периодонтите, поскольку его экспрессируют остеобласты, эпителиальные клетки полости рта и десневые фибробласты (Holzhausen, M. et al., 2006. Am J Pathol. 168:1189-1199).

Согласно опубликованным данным, протеаза гингипаин-R, вырабатываемая Porphyromonas gingivalis (основным патогеном при хроническом периодонтите), способна активировать PAR2 путем протеолитического расщепления со стороны N-конца, таким образом вызывая экспонирование особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации) (Abraham, L.A. et al., 2000. Bone. 26:7-14 and Lourbakos, A. et al., 2001. Infect. Immun. 69:5121-5130). Это запускает образование провоспалительных цитокинов с последующим развитием воспаления, приводящим к разрушению костной ткани.

Терапия, нацеленная на ингибирование протеаз или применение антагонистов PAR2, представляет собой возможный подход к регулированию патологических процессов воспалительного происхождения, например, воспалительных заболеваний, таких как периодонтит.

В этой связи настоящее изобретение предлагает решение для лечения этих воспалительных заболеваний путем выделения, характеризации и получения фракций новых бактерий, не описанных ранее.

Заявителю неожиданно удалось впервые выделить из почвенно-грунтовых вод штамм, принадлежащий новому виду бактерий, этот новый бактериальный штамм (или бактерия) был назван LMB64.

Эта бактерия LMB64 была не только выделена, но и охарактеризована, и была установлена ее принадлежность классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, и возможно, новому роду, который еще не был описан. Анализ последовательности гена, кодирующего 16S рРНК, позволил поместить эту бактерию близко к родам Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia и Glubenkiana, с соответствующими последовательностями которых наблюдается 95% сходство.

Эта непатогенная бактерия является грамотрицательной и будет более подробно описана в Примерах. Эта бактерия также характеризуется тем, что не является нитчатой. Кроме того, эту бактерию выгодно отличает способность расти в среде, содержащей любой тип воды, и более конкретно, обычную воду. Например, в отличие от Vitreoscilla filiformis (V. filiformis), культивирование бактерии LMB64 по настоящему изобретению не требует конкретных условий культивирования и, более конкретно, не требует среды, содержащей по меньшей мере один вид минеральной и/или термальной воды, не содержащей серы (в этой связи можно упомянуть патентный документ ЕР2018891 (Gueniche A., 2009) и публикацию Gueniche et al. 2006 (European Journal of Dermatology, 16, 4, 380-384), в которых описано применение бактериального экстракта V. filiformis для лечения атопического дерматита). Это является явным преимуществом как в отношении условий культивирования и оборудования, так и с экономической точки зрения.

Ген, кодирующий 16S рРНК был практически полностью секвенирован (1487 пн). Бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду размером 10948 пн. Эта плазмида была полностью секвенирована и ее последовательность представлена в последовательности SEQ ID No.2.

Согласно первому воплощению, настоящее изобретение касается непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, у которой нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 16S рРНК, включает или содержит последовательность SEQ ID No.1 или любую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична указанной последовательности SEQ ID No.1.

Предпочтительно, настоящее изобретение касается непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, характеризующейся тем, что нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК указанной бактерии включает или содержит последовательность SEQ ID No.1.

В контексте настоящего изобретения "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот обозначает процентное содержание идентичных нуклеотидов между двумя сравниваемыми последовательностями, полученный после наилучшего выравнивания (оптимального выравнивания), причем это процентное содержание является сугубо статистическим, а отличия между двумя последовательностями случайным образом распределены по всей их длине. Сравнение последовательностей двух нуклеиновых кислот как правило выполняют путем сравнения этих последовательностей после их выравнивания оптимальным образом, причем указанное сравнение можно выполнять по сегментам или по "окнам сравнения". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять не только вручную, но и при помощи алгоритма поиска локальной гомологии, предложенного Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], при помощи алгоритма поиска локальной гомологии, предложенного Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], при помощи методики поиска сходства, разработанной Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. The USA 85:2444] или при помощи компьютерных программ, использующих эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Group Computer, 575 Science Dr., Madison, Wl, или программ BLAST N или BLAST P, выполняющих сравнение).

Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот определяют путем сравнения этих двух выровненных оптимальным образом последовательностей, причем сравниваемая последовательность нуклеиновой кислоты может иметь вставки или делеции по отношению к референсной последовательности для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент идентичности рассчитывают путем определения числа позиций, в которых нуклеотиды идентичны между двумя последовательностями, путем деления этого числа идентичных позиций на общее число позиций в окне сравнения и умножения полученного результата на 100 для получения процента идентичности между этими двумя последовательностями.

Например, можно использовать программу "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences," FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), доступную по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с используемыми по умолчанию значениями параметров (в частности, с параметрами "штраф за открытие гэпа": 5, и "штраф за удлинение гэпа": 2; с выбором в качестве матрицы, например, матрицы "BLOSUM 62", предлагаемой программой), с расчетом процента идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями непосредственно самой программой. Также возможно использовать другие программы, такие как программы "ALIGN" или "Megalign" (DNASTAR).

Согласно другому воплощению, бактерия по изобретению имеет по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID No.2 или любую последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% с указанной последовательностью SEQ ID No.2.

Предпочтительно, бактерия LMB64 имеет по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID No.2.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, бактерия LMB64 характеризуется тем, что она не является нитчатой.

Другие характеристики указанной бактерии LMB64 будут подробно описаны ниже в Примерах.

Кроме того, бактерия LMB64 по настоящему изобретению была депонирована от имени Заявителя в Национальную Коллекцию Культур Микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM) в институте Пастера в Париже 8 апреля 2010 г. под номером 1-4290.

Таким образом, один объект изобретения представляет собой бактерию, депонированную в CNCM 8 апреля 2010 г. под номером 1-4290, или ее гомолога, потомка или любого мутанта.

Термин "мутант" обозначает любую бактерию, которая непосредственно происходит из штамма I-4290 и может содержать естественные мутации или рекомбинации, такие как, например, любые рекомбинации, связанные с клеточной пролиферацией, клеточным делением (мутации вследствие ошибок, возникающих в ходе деления бактерий или репликации ДНК) или любым иным механизмом естественного отбора или селекции в культуральной среде, такой как селекция мутантов, резистентных или становящихся резистентными к заданному соединению. Эти мутанты включают любых бактерий, происходящих из штамма I-4290, имеющих одну или более мутаций в их геномной последовательности (или последовательности их плазмиды), у которых мутации вызваны радиацией, вирусом, транспозонами или мутагенными химическими веществами.

Согласно первому воплощению изобретения, из бактериальной культуры можно выделить общую биомассу при помощи различных известных способов, например, таких как фильтрация, осаждение спиртом (этанолом, изопропанолом, изобутанолом), высушивание на цилиндре с предслоем с очищаемой поверхностью, и т.д., а затем использовать в высушенной вымораживанием или инактивированной нагреванием форме.

Согласно другому предпочтительному воплощению, изобретение в общем касается бактериального экстракта, также называемого бактериальной фракцией, полученного(ой) из суспензии бактерий, описанных выше, а именно бактерии LMB64.

Термин "бактериальный экстракт" обозначает любой экстракт или фракцию бактериальной биомассы или любую активную фракцию указанного экстракта. Например, такой экстракт можно получить из культуры бактерии LMB64, при этом способ получения включает по меньшей мере один этап лизиса бактерий и один этап разделения различных составляющих его фракций путем центрифугирования или путем фильтрации.

Экстракт согласно изобретению может состоять из бактериальных клеток, выделенных из культуральной среды, которую сконцентрировали, например, путем центрифугирования; или из концентрата бактериальных клеток, прошедших обработку, при которой клеточная оболочка была разрушена любым способом, известным специалистам в данной области, например, под воздействием ультразвука или автоклавирования; или из супернатанта, полученного путем фильтрования, но не исчерпывается этим.

Важный этап способа приготовления экстракта по изобретению состоит в удалении различных внутриклеточных компонентов, например, таких как нуклеиновые кислоты (хромосомная ДНК, внехромосомная кольцевая ДНК, плазмиды), рибосомы и внутриклеточные запасные вещества, такие как гликоген, крахмал и поли-β-гидроксибутират и т.д.

Предпочтительно, бактериальный экстракт согласно изобретению получают после обработки указанной бактериальной суспензии таким образом, чтобы удалить внутриклеточные компоненты.

В результате экстракт по изобретению преимущественно содержит компоненты, происходящие из мембраны, периплазматического пространства и/или из внеклеточного пространства.

Более конкретно, указанные внутриклеточные компоненты содержат, по меньшей мере нуклеиновые кислоты.

Помимо удаления внутриклеточных компонентов, в качестве примера, не являющегося исчерпывающим, после проведения лизиса бактерий и центрифугирования также возможно разделение компонентов культурального супернатанта (далее обозначается фракция S0) и компонентов, составляющих осадок (далее обозначаются Е0), которое может быть легко выполнено специалистами в данной области. Например, можно предложить, чтобы пороговое значение для разделения компонентов S0 и Е0 приблизительно соответствовало молекулярному весу 100 кДа. Таким образом, компоненты фракции S0 будут преимущественно иметь молекулярный вес менее 100 кДа, тогда как компоненты фракции Е0 будут преимущественно иметь молекулярный вес более 100 кДа.

Более конкретно, при помощи методик, известных специалистам в данной области, возможно экстрагировать и отделять биомолекулы, присутствующие в культуральном супернатанте (S0), от тех, которые главным образом представлены поверхностными белками и белками, находящимися в периплазматическом пространстве бактерий (Е0).

Согласно одному воплощению изобретения, бактериальный экстракт включает фракцию Е0, содержащую по меньшей мере мембранные белки, периплазматические белки и белки, происходящие из жгутика.

Периплазматические белки включают белки, находящиеся в периплазматическом пространстве грамотрицательных бактерий, которые могут высвобождаться при осмотическом шоке или при инкубации со средой, содержащей хаотропные агенты или детергенты (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition: Sambrook and Russell. CSHL Press).

Белки, происходящие из жгутика, включают мультимерные белки жгутика или фрагменты жгутика. Способы выделения и очистки целых бактериальных жгутиков при помощи детергентов с последующим разделением при помощи ультрацентрифугирования (в градиенте CsCI) описаны в литературе. В изобретении приведенные примеры способов экстракции позволили выделить фрагменты жгутиков.

Мембранные белки включают белки, закрепленные в мембране и частично экспонированные на поверхность (такие как белки наружной мембраны, или Omp, от англ. outer membrane proteins), белки, адгезированные к поверхности мембраны, липопротеины и порины (Ward JB., Microbial adhesion to surfaces, 1980).

Предпочтительно, указанные мембранные белки состоят из поринов, OmpA, липополисахаридов и/или липопротеинов.

Согласно другому воплощению изобретения может быть предпочтительно применять фракцию S0.

Более конкретно, бактериальный экстракт согласно изобретению включает фракцию S0, содержащую по меньшей мере секретируемые пептиды и белки, а также вторичные метаболиты.

Секретируемые пептиды и белки включают пептиды и белки, которые естественным образом вырабатывают и секретируют бактерии LMB64 и которые можно получить путем центрифугирования или фильтрации.

Вторичные метаболиты включают низкомолекулярные молекулы, вырабатываемые и секретируемые в культуральную среду бактериями LMB64.

Следует здесь отметить присутствие липополисахаридов в составе фракции S0. В действительности, липополисахариды, хотя они преимущественно обнаруживаются во фракции Е0, также обнаруживаются в меньших количествах во фракции S0.

Предпочтительно, фракции Е0 и S0 можно комбинировать таким образом, чтобы получить фракцию ES0, например, оставляя культуральную среду для инкубации и реагирования в щелочной среде (рН от 9 до 11) приблизительно в течение 5 часов при температуре 4°С, центрифугируя и фильтруя через фильтр 0,2 мкм для получения прозрачного раствора ES0.

Бактериальный экстракт ES0, таким образом, состоит, помимо прочего, из мембранных белков, липополисахаридов, периплазматических белков, фрагментов белков жгутика и первичных и вторичных метаболитов, вырабатываемых бактериями.

Предпочтительно, экстракт ES0 имеет белковый профиль, в котором при помощи электрофореза в полиакриламидном геле можно выделить, по меньшей мере, двенадцать полос, включая три основных полосы, соответствующие молекулярным весам (с приблизительной оценкой по стандартам с известным молекулярным весом, Bio-Rad), находящимися в пределах:

- полоса 1: 30 кДа и 36 кДа, преимущественно 34 кДа;

- полоса 2: 41 кДа и 45 кДа, преимущественно 43 кДа;

- полоса 3: 47 кДа и 51 кДа, преимущественно 49 кДа.

Согласно другому воплощению изобретения, бактериальный экстракт включает фракцию ES0, содержащую по меньшей мере фракцию Е0 и фракцию S0.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения бактериальный экстракт включает фракцию ES0, у которой белковый профиль, полученный при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, включает три основных полосы, соответствующие молекулярным весам, находящимся в пределах 30 кДа и 36 кДа, 41 кДа и 45 кДа, 47 кДа и 51 кДа соответственно.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения бактериальный экстракт включает фракцию ES0, у которой белковый профиль, полученный при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, включает три основных полосы, соответствующие молекулярным весам 34 кДа, 43 кДа и 49 кДа, соответственно.

В другом аспекте изобретения описан способ приготовления бактериального экстракта, включающий этапы:

a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде; и

b) удаления внутриклеточных компонентов.

Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта S0, причем указанный способ включает этапы:

a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;

b) центрифугирования указанной культуры; и

c) сбора супернатанта S0.

Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта Е0, причем указанный способ включает этапы:

a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;

b) центрифугирования указанной культуры и удаления супернатанта;

c) обработки биомассы, полученной на этапе b) таким образом, чтобы удалить внутриклеточные компоненты; и

d) сбора осадка Е0.

Предпочтительно, этап с) состоит из ультразвуковой обработки биомассы, полученной на этапе b), с последующим предварительным центрифугированием, предназначенным для удаления осадка, содержащего указанные внутриклеточные компоненты, а затем вторым центрифугированием супернатанта.

Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта Е0, причем указанный способ включает этапы:

a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;

b) центрифугирования указанной культуры и удаления супернатанта;

c) обработки ультразвуком биомассы, полученной на этапе b);

d) центрифугирования указанной биомассы, обработанной ультразвуком и удаления полученной биомассы;

e) центрифугирования супернатанта, полученного на этапе d); и

f) сбора осадка Е0.

Следует отметить, что различные способы, описанные выше, приведены только в качестве иллюстрации и что можно применять любые способы, известные с специалистам в данной области.

Как станет очевидным из приведенных ниже Примеров, помимо активности, предполагаемой для экстрактов такого типа, Заявитель продемонстрировал некоторые новые виды активности, не описанные ранее.

Первый преимущественный аспект изобретения, касающийся иммуномодуляции, основан на модуляции свойств провоспалительных цитокинов. Более конкретно, применение бактерии и/или экстракта согласно изобретению способно, в случае если ответ связан с Th1 или Th17 профилем, как при болезни Крона, восстанавливать гомеостаз.

Другое преимущество изобретения основано на том факте, что, как станет очевидно из Примеров, применение бактерии и/или экстракта согласно изобретению индуцирует образование противомикробных пептидов, например, таких как пептиды hBD-2, hBD-3, S1007A и LL-31, но не исчерпывается ими. Эти пептиды обладают антимикробным эффектом в отношении патогенов, заселяющих кишечный тракт, без ущерба для нормального роста симбиотической микрофлоры. В результате их действие восстанавливает нормальную микрофлору кишечника.

Более конкретно, как упоминалось выше, бактериальный экстракт Vitreoscilla filiformis (Gueniche A. et al., 2006) известен своей активностью в отношении TLR2, благодаря наличию OmpA, и в отношении TLR4, благодаря наличию липополисахаридов. Из-за отсутствия жгутиков у бактерии V. filiformis экстракт, получаемый из V. filiformis, не обладает активностью в отношении TLR5.

Впервые Заявителем был описан бактериальный экстракт по изобретению, который помимо активности в отношении TLR2 и TLR4, обладает активностью в отношении TLR5.

Таким образом, изобретение относится к применению бактерии и/или бактериального экстракта, описанных выше, в качестве активатора TLR2, TLR4 и TLR5.

Предпочтительно, указанный бактериальный экстракт, активирующий TLR2, TLR4 и TLR5, состоит из экстракта, содержащего все или некоторые из белков, происходящих из жгутика. В этом случае, например, указанный экстракт предпочтительно представляет собой экстракт ЕО или экстракт ES0.

Указанная активность, приводящая к стимуляции TLR5, представляет значительный интерес, поскольку известно, что TLR5 повышает уровень некоторых противомикробных пептидов, таких как псориазин (S100A7) и hBD-2 (Glaser et al., Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 641-649). Кроме того, агонисты TLR5 действуют синергично с агонистами TLR2 и TLR4, что потенциирует выработку противомикробных пептидов. Было показано, что при блокировании TLR5 при помощи антител, последние вырабатываются в малых количествах или не вырабатываются совсем.

Таким образом, данный аспект является особенно инновационным в части, касающейся использования бактерии и/или экстрактов согласно изобретению для иммуномодуляции.

Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ лечения или предупреждения патологии, в частности, патологии, относящейся к инфекции или нарушению иммунного ответа, причем указанная патология связана с нарушением активности TLR2, TLR4 и TLR5, а указанное лечение или предупреждение включает модуляцию активности, в частности, повышение активности указанных TLR2, TLR4 и TLR5 путем введения активатора указанных рецепторов, причем указанный способ включает введение пациенту, имеющему или возможно имеющему указанную патологию, эффективного количества бактерии или бактериального экстракта согласно настоящему изобретению.

Кроме того, в противоположность бактериальным экстрактам, описанным до настоящего времени, Заявителем была неожиданно продемонстрирована антагонистическая активность в отношении PAR2. Эта активность представляет значительный интерес в контексте противовоспалительного лечения.

Таким образом, изобретение в частности касается применения бактерии и/или бактериального экстракта, описанных выше, в качестве антагониста PAR2.

Объектом изобретения также является способ лечения или предупреждения патологии, в частности, патологии, относящейся к воспалению, причем указанная патология связана с нарушением функции PAR2, а указанное лечение или предупреждение включает модуляцию активности указанного PAR2, в частности путем введения антагониста указанного рецептора, причем указанный способ включает введение пациенту, имеющему или возможно имеющему указанную патологию, эффективного количества бактерии или бактериального экстракта согласно настоящему изобретению.

Предпочтительно, указанный бактериальный экстракт, являющийся антагонистом PAR2, состоит из экстракта S0 или экстракта ES0.

Повышенная экспрессия PAR2 наблюдается в эндотелиальных клетках, миоцитах толстой кишки, энтероцитах, нейронах кишечника, иммунных клетках и кератиноцитах. Протеазы (трипсин, триптаза), присутствующие в большом количестве в окружающей среде, расщепляют PAR2 со стороны N-конца, что приводит к экспонированию особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации). В результате это активирует выработку провоспалительных цитокинов и запускает воспалительные реакции (Vergnolle, N. 2009, Pharmacol. Ther. 123:292-309). Этот феномен наблюдается у мышей дикого типа, но отсутствует у мышей с генным нокаутом (с отсутствием PAR2). Лечение антипротеазами и/или антагонистами PAR2 позволяет избежать этих воспалительных явлений.

Сочетание всех этих видов активности и синергия между ними обеспечивают бактерии LMB64 или любому экстракту, получаемому из этих бактерий, большие потенциальные возможности в лечении воспалительных заболеваний и, в частности, воспалительных заболеваний, в которые вовлечен PAR2 и/или при которых происходит ослабление, нарушение или дисбаланс иммунной системы.

Таким образом, изобретение касается применения бактерии, описанной выше, и/или бактериального экстракта, полученного из указанных бактерий, для изготовления композиции, предназначенной для лечения и/или предупреждения воспалительных нарушений желудочно-кишечного тракта или полости рта.

Предпочтительно, указанные воспалительные нарушения желудочно-кишечного тракта или полости рта состоят из болезни Крона, колита или периодонтита.

Согласно другому воплощению изобретение, представленное в данной патентной заявке, относится к композициям, содержащим, в качестве активного ингредиента, по меньшей мере одну бактерию и/или один бактериальный экстракт согласно изобретению.

Композиция согласно изобретению имеет отношение к лечению воспалительных нарушений желудочно-кишечного тракта или полости рта.

Предпочтительно указанные воспалительные нарушения желудочно-кишечного тракта или полости рта состоят из болезни Крона, колита или периодонтита.

Таким образом, изобретение касается фармацевтической композиции, также содержащей фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем описании "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает соединение или комбинацию соединений, являющиеся частью фармацевтической композиции, которые не вызывают побочных реакций и которые, например, облегчают введение активных соединений, повышают длительность их существования и/или эффективность в организме, повышают их растворимость в растворе или улучшают их сохранность. Указанные фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть адаптированы специалистами в данной области в зависимости от природы и способа введения выбранных активных соединений.

Предпочтительно, указанные соединения можно вводить системно внутримышечным, интрадермальным, интраперитонеальным или подкожным путем, или оральным путем. Композиции, содержащие антитела по изобретению, можно вводить в виде нескольких доз, разделенных во времени.

Их оптимальные способы введения, режимы дозирования и галеновые формы могут быть установлены в соответствии с критериями, обычно принимаемыми во внимание при разработке лечения, адаптированного для пациента, например, с учетом возраста или веса пациента, общего состояния здоровья пациента, переносимости лечения и отмеченных побочных эффектов.

Приведенные ниже Примеры, иллюстрирующие изобретение, позволяют лучше понять изобретение, но не ограничивают его объема.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фигуре 1 изображено филогенетическое положение последовательности, кодирующей 16S рРНК штамма LMB64. Последовательности, представленные на этом дереве, являются последовательностями из базы данных GenBank, наиболее близкими последовательности LMB64.

На Фигурах 2А и 2Б представлен вид бактерии LMB64 в трансмиссионном электронном микроскопе (А) и сканирующем электронном микроскопе (Б).

На Фигуре 3 представлены оптимальные условия культивирования, установленные в зависимости от температуры, рН и минерализации культуральной среды R3.

На Фигуре 4 показана индукция экспрессии поверхностных молекул CD80, CD86, CD83 и CD54 под воздействием экстракта ЕО (дозозависимое действие).

На Фигуре 5 показано ингибирование рецепторов IgE под воздействием экстракта Е0.

На Фигуре 6 показана активация TLR2 под воздействием экстракта ES0.

На Фигуре 7 показана активация TLR4 под воздействием экстракта ES0.

На Фигуре 8 показана активация TLR5 под воздействием экстракта ES0.

На Фигуре 9 показана антагонистическая активность экстракта ES0, специфическая в отношении PAR2.

На Фигуре 10 продемонстрировано разделение экстракта ES0 в полиакриламидном геле.

На Фигуре 11 продемонстрирован эффект ES0 в виде индукции TLR5-зависимой экспрессии генов, кодирующих противомикробные пептиды.

На Фигуре 12 показана активность ES0 в отношении кератиноцитов полости рта человека опосредована TLR5.

На Фигуре 13 показан противовоспалительный эффект ES0 на модели острого колита у крыс.

На Фигурах 14А и 14Б продемонстрировано, что превентивное введение штамма LMB64 существенно сокращает поражение кишечника, вызванное TNBS [А], а также воспалительный ответ (активность МПО) [Б].

Пример 1: Выделение и характеристика бактерии LMB64

Бактерия LMB64 была выделена из почвенно-грунтовых вод.

Таксономическое положение новой бактерии LMB64 предложено на Фигуре 1.

Более конкретно, бактерия LMB64 имеет палочковидную форму, длиной приблизительно 2,3 мкм (±0,3) и толщиной приблизительно 1,0 мкм (±0,1). Отличительной чертой этой бактерии является наличие полярно расположенного жгутика (Фигуры 2А и 2Б). Как видно из рисунков, бактерия LMB64 представляет собой бактерию, которая не относится к нитчатым бактериям.

Как было упомянуто выше, бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду размером приблизительно 11 тпн. Эта плазмида была полностью секвенирована (SEQ ID No.2).

Ген, кодирующий 16S рРНК, также был секвенирован (SEQ ID No.1). Бактерию культивировали в ферментере в искусственной среде. Скорость роста была выше, когда среда содержала углеродные субстраты в низких концентрациях.

Были апробированы культуральные среды R3, MS-глюкоза и LB, состав которых представлен ниже в Таблицах 1а, 16 и 1в, соответственно.

Таблица 1а
Состав среды R3
Дрожжевой экстракт	1 г/л
Протеозопептон Difco	1 г/л
Казаминовые кислоты	1 г/л
Глюкоза	1 г/л
Растворимый крахмал	1 г/л
Пируват натрия	0,5 г/л
K2HPO4	0,6 г/л
MgSO4,7H2O	0,1 г/л

Таблица 1б
Состав среды MS-Глюкоза
Глюкоза	6,0 г/л
Лимонная кислота	0,84 г/л
MgSO4, 7H2O	0,25 г/л
NH4Cl	1,06 г/л
Безводный K2HPO4	8,75 г/л
Пируват натрия	0,5 г/л
Сульфат цинка, 7Н2О	4 мг/л
Хлорид кобальта, 6H2O	3,5 мг/л
Молибдат натрия, 2H2O	3,5 мг/л
Сульфат марганца, 1 H2O	5 мг/л
Борная кислота	2 мг/л
Концентрированная соляная кислота	50 мг/л
Сульфат меди, 5H2O	4 мг/л
Хлорид железа, 6H2O	27 мг/л

Таблица 1в
Состав среды LB
Триптон	10 г/л
Дрожжевой экстракт	5 г/л
NaCl	5 г/л

Скорость роста бактерии LMB64 в зависимости от культуральной среды представлена ниже в Таблице 2.