Иммуногенные пептиды для применения в профилактике и/или лечении инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, иммунных ответов на аллогенные факторы, аллергических заболеваний, опухолей, отторжения трансплантата и иммунных ответов против вирусных векторов. используемых для генной терапии или генной вакцинации

Иммуногенные пептиды для применения в профилактике и/или лечении инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, иммунных ответов на аллогенные факторы, аллергических заболеваний, опухолей, отторжения трансплантата и иммунных ответов против вирусных векторов. используемых для генной терапии или генной вакцинации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуногенным пептидам и их применению для лечения инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, иммунных ответов на аллогенные факторы, аллергических заболеваний, опухоли, отторжения трансплантата и иммунных ответов против вирусных векторов, используемых для генной терапии или генной вакцинации.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Терапия многих заболеваний у млекопитающих ограничена отсутствием специализированных лекарственных средств.

При инфекциях, вызываемых внутриклеточными патогенами, инфекция персистирует, вследствие недостаточности иммунного ответа, который распознавал бы и устранял инфицированные клетки. Многие патогены снижают поверхностную экспрессию молекул, таких как главный комплекс гистосовместимости класса I (класс I MHC), в клетках, в которые проникли указанные патогены, тем самым, снижая способность иммунной системы индуцировать цитолитический иммунный ответ, который индуцируется, когда T-лимфоциты CD8+ ростка распознают MHC класса I, представляющим происходящие из патогена эпитопы, и активируются им. В значительной степени желательна альтернативная стратегия, посредством которой цитолитические лимфоциты могут устранять клетки, в которые проник патоген. Была предложена такая стратегия (EP 2059256), в которой ограниченные по классу II эпитопы, происходящие из внутриклеточных патогенов и связанные с мотивом тиолоксидоредуктазы, используют для индукции цитолитических CD4+ T-клеток, которые индуцируют антигенпредставляющую клетку (APC) представляющую узнаваемый ей эпитоп. Однако привлечение и активация альтернативной подгруппы цитолитических T-клеток представляют собой другую возможность усилить устранение клеток, инфицированных внутриклеточным патогеном.

При аутоиммунных заболеваниях, как и при иммунных ответах на введение аллогенного фактора и при аллергических заболеваниях, является преимущественным устранение клеток, представляющих пептиды из аутоантигена, аллогенного фактора или аллергена, так чтобы предотвратить какие-либо нежелательные иммунные ответы и, тем самым, заболевания, обусловленные такими нежелательными иммунными ответами. В таких обстоятельствах эпитопы из аутоантигенов, аллогенных факторов или аллергенов, главным образом, представляются MHC класса II, и комплекс, образующийся между эпитопом и детерминантами класса II, активирует T-лимфоциты CD4+ ростка. Это приводит к активации B-лимфоцитов и продукции антител против указанных аутоантигенов, аллогенных факторов или аллергенов. Способ, который обеспечивает устранение APC путем цитолиза, предотвратил бы активацию CD4+ T-клеток и, тем самым, продукцию антител. Такая стратегия была предложена и описана в патентной заявке WO 2008/017517 A1, в которой используют ограниченные по классу II эпитопы аутоантигенов или аллергенов или аллогенных факторов, соответственно, связанные с мотивом тиолоксидоредуктазы. Цитолитические ограниченные по классу II CD4+ T-клетки, индуцированные воздействием ограниченных по классу II эпитопов, связанных с указанным мотивом, индуцируют апоптоз APC, представляющих узнаваемый ей эпитоп. Однако привлечение и активация альтернативных цитолитических T-клеток может обеспечивать ценную альтернативную стратегию.

В случае опухолей, клетки избегают уничтожения путем подавления поверхностной экспрессии детерминант MHC класса I и класса II. Таким образом, любая стратегия, в которой индуцируются цитолитические T-клетки, специфичные к опухолевым антигенам, представляет собой в значительной степени желательную стратегию для лечения опухолей. В WO 2009/101205 описано, что цитолитические T-клетки, активированные ограниченным по классу II представлением происходящих из опухоли антигенов, применимы для устранения опухоли. Однако этот подход ограничивается низкой экспрессией детерминант MHC класса II опухолями.

При отторжении трансплантата процесс хронического отторжения запускается путем непрямого представления антигенов, отделяющихся от трансплантата и представляемых антигенпредставляющими клетками реципиента его/ее собственным T-лимфоцитам. Непрямое представление происходит путем представления происходящих из трансплантата эпитопов с помощью эпитопов как класса I, так и класса II. T-лимфоциты CD8 ростка, активированные представлением антигенов трансплантата посредством MHC класса I, мигрируют в трансплантат, где они опосредуют отторжение путем распознавания узнаваемых ими эпитопов непосредственно на трансплантированных клетках. Тем не менее, активация CD8-клеток требует помощи CD4-клеток, активируемых путем непрямого представления происходящих из трансплантата антигенов детерминантами MHC класса II. В WO 2009/100505 описано, что использование ограниченных по классу II T-клеточных эпитопов, происходящих из трансплантата и связанных с мотивом тиолоксидоредуктазы, позволяет устранение с помощью апоптоза APC, участвующих в непрямом представлении. Однако в высокой степени желательна альтернативная стратегия, посредством которой образовывалась бы другая подгруппа цитолитических T-клеток.

Аналогично, новые терапевтические подходы, такие как генная терапия и генная вакцинация, в высокой степени ограничены иммунным ответом хозяина на вирусные векторы, используемые для трансгенеза или вакцинации. В обеих из этих ситуаций, антигены, происходящие из вирусных векторов, отделяются от клеток, трансдуцированных вектором, и представляются лимфацитам хозяина посредством APC хозяина, а именно, путем непрямого представления антигенов. Следует отметить тот факт, что многие вирусные векторы не только активируют адаптивную иммунную систему, что приводит к продукции специфических антител и активации специфических T-клеток, но указанные вирусные векторы также активируют врожденную иммунную систему. Активация врожденного иммунитета служит в качестве адъюванта для адаптивного ответа. В WO 2009/101204 описано, что ограниченные по классу II эпитопы, происходящие из вирусных векторов и связанные с мотивом тиолоксидоредуктазы, могут индуцировать активацию цитолитических ограниченных по классу II CD4 T-клеток. Однако в высокой степени желательна альтернативная стратегия, которая подавляла бы активацию врожденной иммунной системы.

Во всех приведенных в настоящем описании примерах очевидно, что для специалиста в данной области представляли бы большую ценность альтернативные стратегии, посредством которых индуцировались бы специфичные к антигену цитолитические T-клетки, которые устраняли бы специфичным к антигену образом APC, представляющие указанный специфический антиген.

Настоящее изобретение обеспечивает такую альтернативную стратегию.

Естественные киллерные T-клетки (NKT) представляют собой отдельную подгруппу нетипичных T-лимфоцитов, которые распознают антигены, представляемые неклассической молекулой комплекса MHC CD1d. В настоящее время описаны две подгруппы NKT-клеток. NKT-клетки 1 типа, также называемые инвариантными NKT-клетками (iNKT), являются наиболее распространенными. Они характеризуются наличием альфа-бета T-клеточного рецептора (TCR), образованного из инвариантной альфа-цепи, Valpha14 у мыши и Valpha24 у человека. Эта альфа-цепь ассоциирована с вариабельным, хотя и ограниченным, количеством бета-цепей. NKT-клетки 2 типа имеют альфа-бета TCR, но с полиморфной альфа-цепью. Однако очевидно, что существуют другие подгруппы NKT-клеток, фенотип которых все еще не полностью определен, однако которые имеют общие характеристики, являясь активируемыми гликолипидами, присутствующими в контексте молекулы CD1d.

NKT-клетки, как правило, экспрессируют комбинацию рецептора естественных киллерных (NK) клеток, включая NKG2D и NK1.1. NKT-клетки являются частью врожденной иммунной системы, которая может быть отличена от адаптивной иммунной системы благодаря тому факту, что она не требуют экспансии перед приобретением полной эффекторной способности. Большинство из их медиаторов образованы заранее и не требуют транскрипции. Было показано, что NKT-клетки являются основными участниками иммунного ответа против внутриклеточных патогенов и отторжения опухоли. Также предполагается их роль в контроле аутоиммунных заболеваний и отторжении трансплантата.

Распознающий элемент, молекула CD1d, имеет структуру, в высокой степени сходную со структурой молекулы MHC класса I, включая наличие бета-2-микроглобулина. Он характеризуется глубокой щелью, ограниченной двумя альфа-цепями и содержащей высоко гидрофобные остатки, которые акцептируют липидные цепи. Щель является открытой на обоих концах, что позволяет вмещать более длинные цепи. Каноническим лигандом для CD1d является синтетический альфа-галактозилцерамид (альфа-GalCer). Однако описаны многие природные альтернативные лиганды, включая глико- и фосфолипиды, природный липидный сульфатид, встречающийся в миелине, микробный фосфоинозитолманнозид и альфа-глюкуронозилцерамид. В настоящее время в данной области существует согласованное мнение о том (см. обзоры, такие как Matsuda et al. Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 и Godfrey et al. Nature reviews Immunology 2010, 11: 197-206), что CD1d связывает только лиганды, содержащие цепи липидов, или, как правило, общую структуру, образованную из липидной концевой части, погруженной в CD1d, и головной группы из остатков сахаров, которая выступает из CD1d.

Пептиды не считают способными активировать NKT-клетки через представление посредством CD1d. Однако было предположено, что длинные гидрофобные пептиды, содержащие объемные аминокислотные остатки, могут связываться с CD1d (Castano et al. Science 1995, 269: 223-226). Наблюдения, проведенные с использованием библиотек фагового дисплея, экспрессирующих пептиды со случайной последовательностью без определенного физиологического значения, позволили установить теоретический консенсусный мотив (Castano et al. Science 1995, 269: 223-226 и см. ниже).

В действительности, Castano et al. показали, что клетки, которые активируются, представляют собой CD8+ T-клетки, а именно ограниченные по MHC класса I клетки, а не NKT-клетки. Эти данные указывают специалисту в данной области на то, что отсутствуют доказательства того, что гидрофобные пептиды представляются молекулами CD1d. Физиологическое значение заявления, сделанного Castano et al. было далее оспорено вследствие неспособности индуцировать NKT-клетки согласно общепринятым протоколам иммунизации (Matsuda et al. Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 и Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Искусственные системы, такие как иммунизация клетками, трансфицированными для сверхэкспрессии CD1d и нагруженными in vitro происходящим из овальбумина пептидом, были способны индуцировать NKT-клетки. Аналогично, внутрикожная иммунизация плазмидной ДНК вместе с CD1d мыши и костимуляторными молекулами индуцирует цитолитические ограниченные по CD1d T-клетки (Lee et al. Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438). Castano et al. (Science 269: 223, 1995) утверждают, что гидрофобные пептиды, содержащие структурный мотив, образованный из ароматических остатков в положениях P1 и P7, которые соответствуют заякоривающим остаткам для связывания с гидрофобными карманами CD1d, расположенными на каждом конце молекулы CD1d, и алифатической цепи в положении P4, содержат центральный мотив для связывания эпитопов CD1d. Как описано выше, заключения, сделанные Castano et al., не подтверждаются данными.

Авторы настоящего изобретения сделали неожиданное открытие, что пептиды, охватывающие гидрофобную аминокислотную последовательность, в действительности способны индуцировать активацию клеток NKT. Примером такой последовательности является мотив [FW]-xx-[ILM]-xx-[FW], где [FW] представляет собой аминокислоту, выбранную из фенилаланина или триптофана, и [ILM] представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина или метионина. [FW] в P7 называют пермиссивной, что означает, что либо F, либо W, могут быть заменены на T или H.

Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что CD1d-связывающий мотив был особенно эффективным в отношении модулирования активности NKT, когда он был связан с мотивом тиолоксидоредуктазы. Этот мотив имеет общую структуру C-XX-C, в которой C представляет собой цистеин и X представляет собой любую аминокислоту, за исключением тирозина, фенилаланина и триптофана. В патентной заявке WO 2008/017517 A1 описано, что ограниченные по классу II T-клеточные эпитопы, связанные с мотивом тиолоксидоредуктазы, приобретают свойство трансформации фенотипа и функции ограниченных по классу II CD4 T-клеток в мощные цитолитические клетки, индуцирующие апоптоз APC. Этот эффект является следствием увеличенного образования синапсов между APC- и T-клетками вследствие укорочения и изомеризации молекулы CD4 на поверхности T-клеток.

Значительное большинство NKT-клеток имеют корецептор CD4, роль которого остается неопределенной. Однако в недавней публикации было предположено, что CD4 связывается с молекулой CD1d в значительной степени аналогично тому, как она связывается с MHC класса II (Thedrez et al. Blood 110: 251-258, 2007). Кроме того, было показано, что присутствие CD4 требуется для полной активации NKT-клеток.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению гидрофобных пептидов, имеющих способность связываться с CD1d и, тем самым, привлекать и активировать NKT-клетки, связанных с мотивом тиолоксидоредуктазы. Такие пептиды обеспечивают специфичность к антигену и отражают ценный подход для лечения:

(1) инфекционных заболеваний с внутриклеточными патогенами, в которых инфицированные клетки представляют гидрофобные пептиды, происходящие из патогена и связанные с CD1d. Увеличенное привлечение и/или активность таких NKT-клеток, таким образом, будет обеспечивать устранение инфицированных клеток;

(2) аутоиммунные заболевания, иммунные ответы на введение аллогенного фактора и аллергические заболевания, при которых антигены, ассоциированные с каждым из этих 3 типов заболеваний, образуют гидрофобные пептиды, представляемые CD1d. Увеличенное привлечение и/или активность специфичных к антигену NKT-клеток, таким образом, может помочь устранить антигенпредставляющие клетки и, тем самым, устранить нежелательный иммунный ответ;

(3) опухоли, поскольку опухолевые клетки часто экспрессируют CD1d, несущий опухолеспецифические антигены, которые могут распознаваться NKT-клетками. Увеличение активности и привлечение таких NKT-клеток привело бы к увеличению устранения опухоли;

(4) отторжение трансплантата, поскольку антигенпредставляющие клетки хозяина представляют гидрофобные пептиды, происходящие из трансплантата, в контексте CD1d. Распознавание этих пептидов NKT-клетками хозяина привело бы к устранению антигенпредставляющих клеток и прервало бы хронический процесс отторжения трансплантата;

(5) генная терапия и генная вакцинация, где антигены из вирусных векторов и отделяющиеся от трансдуцированных клеткок представляются детерминантами CD1d. Привлечение и активация NKT-клеток, устраняющих APC хозяина через распознавание антигенов вирусных векторов, было бы благоприятным как для продолжения экспрессии трансгена, так и для поддержания полной иммуногенности трансгена при генной вакцинации.

В дополнение к интересу к настоящему изобретению с терапевтической точки зрения, авторы настоящего изобретения сделали неожиданное наблюдение, что добавление мотива оксидоредуктазы во фланкирующие остатки эпитопов CD1d увеличивает связывание TCR, что приводит к значительно увеличенному выявлению CD4+ NKT-клеток. Пептиды, охватывающие природные ограниченные по CD1d эпитопы и по меньшей мере один мотив тиоредуктазы формата CxxC, в которых C означает цистеин и x означает любые аминокислоты, за исключением цистеина или объемных остатков, как описано в рамках настоящего изобретения, представляют, таким образом, значительный интерес для:

(1) аналитических целей: выявление частоты клеток-предшественников NKT до вакцинации, оценка аффинности связывания пептида с комплексами CD1d, наблюдение специфических NKT-клеток в ходе вакцинации или при иммуносупрессии, идентификация клеток, независимо от их биологической активности, идентификация клеток, вовлеченных в механизм заболевания, истощение специфических NKT-клеток и детекция NKT-клеток in situ, как например, в биоптатах органов;

(2) препаративные цели: получение специфических NKT-клеток для оценки функции и получение NKT-клеток для культивирования и очистки;

(3) контроль качества для популяции клеток с целью клеточной терапии;

(4) терапевтические цели, включая истощение специфических CD4+ NKT-клеток перед трансплантацией органа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для профилактики и лечения инфекции внутриклеточным патогеном у индивидуума путем увеличения иммунного ответа на специфические антигены, происходящие из указанного внутриклеточного патогена.

Настоящее изобретение также относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для профилактики и лечения аутоиммунных ответов, иммунных ответов на введение аллогенных факторов и иммунных ответов на воздействие аллергенов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для лечения опухолей.

Настоящее изобретение также относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для профилактики отторжения трансплантата.

Настоящее изобретение также относится к применению выделенных иммуногенных пептидов для профилактики иммунного ответа против вирусных белков, используемых для генной терапии и/или генной вакцинации.

Настоящее изобретение также относится к пептидам для выявления, получения и истощения NKT-клеток.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного выделенного иммуногенного пептида, содержащего (i) эпитоп NKT-клетки, происходящий из ассоциированного с патогеном антигена и (ii) мотив тиолоксидоредуктазы (кратко тиоредокс-мотив) в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения у индивидуума инфекции указанным патогеном.

В следующем аспекте изобретение также охватывает применение по меньшей мере одного выделенного иммуногенного пептида, содержащего (i) эпитоп NKT-клетки, происходящий из аутоантигена, аллогенного фактора или аллергена, и (ii) тиоредокс-мотив, в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения у индивидуума иммунных ответов против аутоантигенов, аллогенных факторов и/или аллергенов.

В следующем аспекте изобретение также охватывает применение по меньшей мере одного выделенного иммуногенного пептида, содержащего (i) эпитоп NKT-клетки, происходящий из ассоциированного с опухолью антигена, и (ii) тиоредокс-мотив, в качестве лекарственного средства для лечения у индивидуума опухоли.

В следующем аспекте изобретение также охватывает применение по меньшей мере одного выделенного иммуногенного пептида, содержащего (i) эпитоп NKT-клетки, происходящий из аллоантигена, и (ii) тиоредокс-мотив, в качестве лекарственного средства для профилактики у индивидуума отторжения трансплантата.

В следующем аспекте изобретение также охватывает применение по меньшей мере одного выделенного иммуногенного пептида, содержащего (i) эпитоп NKT-клетки, происходящий из вирусного вектора для генной терапии или генной вакцинации, и (ii) тиоредокс-мотив, в качестве лекарственного средства для профилактики у индивидуума иммунного ответа против вирусного вектора.

В следующем аспекте изобретение также охватывает применение по меньшей мере одного выделенного иммуногенного пептида, содержащего (i) эпитоп NKT-клетки, происходящий из ассоциированного с патогеном антигена, аутоантигена, аллогенного фактора, аллергена, ассоциированного с опухолью антигена, аллоантигена или антигена вирусного вектора, и (ii) тиоредокс-мотив, в качестве лекарственного средства для повышения активации, продуцирования цитокинов и цитолитической активности CD4+ NKT-клеток у указанного индивидуума.

Главным образом, изобретение относится к иммуногенным пептидам, содержащим (i) эпитоп NKT-клеток, происходящий из ассоциированного с патогеном антигена, аутоантигена, аллогенного фактора, аллергена, ассоциированного с опухолью антигена, аллоантигена или антигена вирусного вектора, и (ii) тиоредокс-мотив, для применения для профилактики или лечения инфекции внутриклеточным патогеном, профилактики или лечения иммунного ответа против аутоантигенов, аллогенных факторов, аллергенов, лечения опухолей, профилактики иммунизации против аллоантигенов или против антигенов вирусных векторов, у реципиента путем увеличения ответа CD4+ NKT-клеток у указанного реципиента.

Настоящее изобретение также относится к NKT-клеткам либо подгруппы типа 1 (iNKT), либо подгруппы типа 2, а также к менее охарактеризованным подгруппам NKT, причем все из них характеризуются как имеющие корецептор CD4 и цепь TCR-бета, способную распознавать связанный с CD1d пептид.

Также настоящее изобретение относится к гидрофобным пептидам, способным связываться с CD1d, для представления NKT-клеток.

Настоящее изобретение относится к гидрофобным пептидам, охватывающим по меньшей мере один ограниченный по CD1d T-клеточный эпитоп. Структура молекулы CD1d указывает на то, что требуются гидрофобные аминокислотные остатки для занятия двух гидрофобных карманов, расположенных на концах щели CD1d, и что алифатический остаток должен занимать положение в центре щели. Таким образом, в качестве общего примера связывающей CD1d последовательности можно использовать мотив [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH], в котором [FW] указывает на то, что либо F, либо W, может занимать первый заякоривающий остаток (P1), что положение P4 может занимать I, L или M, и что P7 может занимать F, W, T или H. x в этом общем модельном мотиве означает любую аминокислоту. Специалисту в данной области должно быть понятно, что возможны различные комбинации этих аминокислотных остатков. В конкретном варианте осуществления общий модельный мотив может быть представлен как перевернутая последовательность, такая как [FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW].

Указанный тиоредокс-мотив образован из консенсусной последовательности ([CST]-XX-[CST]), где [CST] представляет собой аминокислоту, выбранную из цистеина, серина и треонина, и X может представлять собой любую аминокислоту, за исключением тирозина (Y), фенилаланина (F) и триптофана (W). Указанный тиоредокс-мотив добавляют к пептиду либо на N-конце, либо на С-конце, или на обоих концах, и он потенциально отделен от указанного ограниченного по CD1d T-клеточного эпитопа линкером из 1-7 аминокислот.

В конкретном варианте осуществления указанный линкер содержит аминокислоты, которые являются частью природных фланкирующих остатков.

Кроме того, изобретение относится к способам получения или индукции популяций NKT-клеток, как описано выше, причем указанные способы включают стадии:

(i) предоставление выделенных естественных CD4+ T-клеток;

(ii) контактирование этих клеток с иммуногенным пептидом, содержащим T-клеточный эпитоп, представляемый молекулой CD1d, и соседний с указанным T-клеточным эпитопом или отделенный от него линкером из не более чем 7 аминокислот мотив C-XX-[CST] или [CST]-XX-C; и

(iii) увеличение в количестве указанных клеток в присутствии IL-2/IL-15 и/или IL-7

В следующем аспекте, изобретение относится к способу идентификации популяции CD4+ NKT-клеток, причем указанный способ включает стадии:

(i) предоставление выделенных природных CD4+ T-клеток;

(ii) предоставление CD4+ T-клеток, предположительно являющихся цитотоксическими; и

(iii) определение того, что T-клетки, предоставленные в (ii), проявляют, по сравнению с T-клетками, предоставленными в (i), описанные выше характеристики.

В любом из указанных выше применений указанный ассоциированный с внутриклеточным патогеном антиген может представлять собой любой антиген, происходящий из вирусов, бактерий, микобактерий или паразитов с внутриклеточным жизненным циклом.

В любом из описанных выше применений указанный аутоантиген может представлять собой любой антиген, ассоциированный с аутоиммунным заболеванием. Примерами таких заболеваний являются инсулин-зависимый диабет, рассеянный склероз, миастения и тиреоидит.

В любом из описанных выше применений, указанные аллогенные факторы представляют собой полипептиды или белки и факторы, используемые для заместительной терапии при дефектах свертываемости крови или фибринолитических дефектах, включая фактор VIII, фактор IX и стафилокиназу, гормоны, такие как инсулин и гормон роста, цитокины и факторы роста, такин как интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, GM-CSF и G-CSF, антитела для модулирования иммунных ответов, включая антитела против IgE при аллергических заболеваниях, антитела против CD3, антитела против CD4 и антитела против CD20 при отторжении трансплантата и при различных аутоиммунных заболеваниях, антитела против TNF-альфа при ревматоидном артрите, и эритропоэтин при почечной недостаточности.

В любом из описанных выше применений указанный аллерген представляет собой ингаляционный аллерген, такой как аллергены, происходящие из клещей домашней пыли, из пыльцы или из домашних животных, аллергены пищи, такие как арахис, овальбумин, злаки, фрукты и бобовые растения, и контактные антигены, такие как латекс. Заболевания, характеризующиеся сенсибилизацией к аллергену, включают аллергическую астму, аллергический риносинусит, анафилактический шок, крапивницу, атопический дерматит и контактный дерматит.

В любом из описанных выше применений указанные ассоциированные с опухолью антигены представляют собой онкоген, протоонкоген, происходящий из вируса белок, фактор выживания или клонотипическую детерминанту, такую как идиотипическая детерминанта, происходящая из B-клеточного рецептора.

В любом из описанных выше применений указанные аллоантигены представляют собой главные антигены гистосовместимости, второстепенные антигены гистосовместимости или тканеспецифические антигены. Указанные антигены вовлечены в отторжение трансплантата клеток и тканей.

В любом из описанных выше применений указанные вирусные векторы происходят из аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса или лентивируса.

В любом из описанных выше применений указанный тиоредокс-мотив может быть соседним с указанным эпитопом NKT-клеток или он может быть отделен от указанного эпитопа NKT-клеток линкером. В конкретных вариантах осуществления линкер состоит из не более, чем 7 аминокислот.

В следующем варианте осуществления иммуногенного пептида в описанных выше применениях указанный тиоредокс-мотив не встречается в природе в области из 8 аминокислот на N- или C-конце рядом с эпитопом NKT-клеток в указанном ассоциированном с патогеном антигене, аутоантигене, аллогенном факторе, аллергене, ассоциированном с опухолью антигене, аллоантигене или антигене вирусного вектора. В частности, указанный тиоредокс-мотив расположен на N-конце эпитопа NKT-клеток.

В конкретном варианте осуществления иммуногенного пептида для описанных выше применений иммуногенный пептид дополнительно содержит нацеливающую на эндосомы последовательность. Любой из описанных выше иммуногенных пептидов можно получать химическим синтезом или путем рекомбинантной экспрессии.

Следующий способ по изобретению нацелен на получение популяции NKT-клеток, причем указанный способ включает стадии:

(i) предоставления иммуногенного пептида, содержащего эпитоп NKT-клетки, происходящий из ассоциированного с внутриклеточным патогеном антигена, аутоантигена, аллофактора, аллергена, ассоциированного с опухолью антигена, аллоантигена или антигена вирусного вектора, и (ii) тиоредокс-мотив;

(ii) введение иммуногенного пептида индивидууму; и (в присутствии адъюванта)

(iii) получение популяции CD4+ NKT-клеток.

Популяции CD4+ NKT-клеток, получаемые описанными выше способами, также являются частью изобретения, также как и их применение в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения у индивидуума инфекции указанным внутриклеточным патогеном, профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, иммунного ответа на аллогенный фактор, профилактики или лечения аллергических заболеваний, лечения опухолей, профилактики отторжения трансплантата, и профилактики иммунного ответа на вирусный вектор, используемый для генной терапии или генной вакцинации.

Следующий аспект изобретения относится к выделенным иммуногенным пептидам, содержащим эпитоп NKT-клеток, происходящий из ассоциированного с внутриклеточным патогеном антигена или из аутоантигена, аллогенного фактора, аллергена, ассоциированного с опухолью антигена, аллоантигена или антигена вирусного вектора, и соседний с эпитопом NKT-клеток или отделенный от эпитопа NKT-клеток линкером тиоредокс-мотив.

Следующий аспект изобретения относится к выделенному пептиду, содержащему эпитоп NKT-клеток, происходящий из ассоциированного с внутриклеточным патогеном антигеном или из аутоантигена, аллогенного фактора, аллергена, ассоциированного с опухолью антигена, аллоантигена или антигена вирусного вектора, и соседний с эпитопом NKT-клеток или отделенный от эпитопа NKT-клеток линкером тиоредокс-мотив, для выявления, получения или истощения NKT-клеток.

Кроме того, изобретение охватывает выделенные вирусные векторы, характеризующиеся тем, что они содержат по меньшей мере один ассоциированный с патогеном антиген, или по меньшей мере один аутоантиген, или по меньшей мере один аллогенный фактор, или по меньшей мере один аллерген, или по меньшей мере один ассоциированный с опухолью антиген, или по меньшей мере один аллоантиген, или по меньшей мере один антиген вирусного вектора, содержащий эпитоп NKT-клеток, и соседний с указанным эпитопом NKT-клеток или отделенный от эпитопа NKT-клеток линкером тиоредокс-мотив.

Более конкретно, изобретение относится к выделенным вирусным векторам, характеризующимся тем, что по меньшей мере один эпитоп NKT-клеток, присутствующий по меньшей мере в одном из ассоциированных с патогеном антигенов, или аутоантигенов, или аллогенных факторов, или аллергенов, или ассоциированных с опухолью антигенов, или аллоантигенов, или антигенов вирусного вектора модифицирован встраиванием в указанный ассоциированный с патогеном антиген, указанный аутоантиген, указанный аллогенный фактор, указанный аллерген, указанный ассоциированный с опухолью антиген, указанный аллоантиген, или указанный антиген вирусного вектора, соседнего с указанным эпитопом NKT-клеток или отделенного от указанного эпитопа NKT-клеток линкером тиоредокс-мотива.

Определения

Термин "пептид", когда его используют в настоящем описании, относится к молекуле, содержащей аминокислотную последовательность из от 2 до 200 аминокислот, соединенных пептидными связями, но которые в конкретном варианте осуществления могут содержать неаминокислотные структуры (например, такие как линкерное органическое соединение). Пептиды по изобретению могут содержать любую из общепринятых 20 аминокислот или их модифицированных вариантов, или могут содержать не встречающиеся в природе аминокислоты, включенные путем химического синтеза пептидов или путем химической или ферментативной модификации.

Термины "пептид" или "иммуногенный пептид" используют взаимозаменяемо, однако "иммуногенный пептид" обычно является предпочтительным для пептида, используемого в терапевтических целях, в то время как "пептид" является предпочтительным для выявления, получения и истощения NKT-клеток.

Термин "эпитоп", когда его используют в настоящем описании, относится к одной или нескольким частям (которые могут определять конформационный эпитоп) белка, которые специфично распознаются и связываются антителом или его частью (Fab’, Fab2’, и т.д.) или рецептором, представленном на клеточной поверхности B- или T-лимфоцита, и которые способны путем указанного связывания индуцировать иммунный ответ.

Термин "антиген", когда его используют в настоящем описании, относится к структуре макромолекулы, содержащей один или несколько гаптен(ов) и/или содержащий один или несколько T-клеточных эпитопов. Как правило, указанная макромолекула представляет собой белок или пептид (с полисахаридами или без них) или образована из белковой композиции и содержит один или несколько эпитопов; причем указанная макромолекула альтернативно в настоящем описании может быть обозначена как "антигенный белок" или "антигенный пептид".

Термин "эпитоп T-клеток" или "T-клеточный эпитоп" в контексте настоящего изобретения относится к доминанте, субдоминанте или второстепенному T-клеточному эпитопу, т.е. части антигенного белка, которая специфично распознается и связывается рецептором на клеточной поверхности T-лимфоцита. То, является ли эпитоп доминантным, субдоминантным или второстепенным, зависит от иммунной реакции, индуцируемой против эпитопа. Доминантность зависит от частоты, с которой такие эпитопы распознаются T-клетками и способны активировать их, среди всех возможных T-клеточных эпитопов белка. В частности, T-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый молекулами MHC класса I или MHC класса II.

Термин "эпитоп NKT-клеток" относится к части антигенного белка, которая специфично распознается и связывается рецептором на клеточной поверхности T-лимфоцита. В частности, эпитоп NKT-клеток представляет собой эпитоп, связываемый молекулами CD1d.

Термин "CD4+ эффекторные клетки" относится к клеткам, относящимся к CD4-положительной подгруппе T-клеток, функцией которых является обеспечение помощи другим клеткам, например, таким как B-клетки. Эти эффекторные клетки обычно обозначают как Th-клетки (от T-хелперных клеток) с различными подгруппами, такими как клетки Th0, Th1, Th2 и Th17.

Термин "NKT-клетки" относится к клеткам врожденной иммунной системы, характеризующимся тем, что они имеют рецепторы, такие как NK1.1 и NKG2D, и распознают эпитопы, представляемые молекулой CD1d. В контексте настоящего изобретения NKT-клетки могут относиться либо к подгруппе типа 1 (инвариантные), либо к подгруппе типа 2, или к любым из менее охарактеризованных NKT-клеток с более полиморфными T-клеточными рецепторами, чем у NKT-клеток типа 1 или типа 2.

"Молекула CD1d" относится к происходящей не из MHC молекуле, образованной из 3 альфа-цепей и набора антипараллельных бета-цепей, расположенных в глубоком гидрофобном желобке, открытом с двух сторон, и способных представлять липиды, гликолипиды или гидрофобные пептиды NKT-клеткам.

Термин "иммунные нарушения" или "иммунные заболевания" относится к заболеваниям, где реакция иммунной системы ответственна за или поддерживает нарушение функции или нефизиологическое состояние в организме. Иммунные нарушения в контексте настоящего изобретения относятся к патологии, индуцируемой инфекционными агентами и опухолевым надзором.

Термин "аллогенный фактор" относится к белку, пептиду или фактору (т.е. любой молекуле), проявляющему полиморфизм при сравнении между двумя индивидуумами одного и того же вида, и, более часто, любой белок, пептид или фактор, который индуцирует (аллореактивный) иммунный ответ у индивидуума, которому ввели аллогенный фактор.

Термин "аллоантиген" или "антиген аллотрансплантата", когда его используют в настоящем описании, относится к антигену, происходящему из (отделяющемуся от и/или присутствующему в) клетки или ткани, который при переносе от донора к реципиенту может распознаваться и связываться антителом B- или T-клеточного рецептора реципиента. Аллоантигены, как правило, представляют собой продукты полиморфных генов. Аллоантиген представляет собой белок или пептид, который, при сравнении между донором и реципиентом (относящимся к одному и тому же виду), проявляет небольшие структурные отличия. Присутствие такого донорного антигена в организме реципиента может индуцировать иммунный ответ у реципиента. Такой аллореактивный иммунный ответ является специфичным к аллоантигену.

Термин "мотив тиолоксидоредуктазы", "мотив тиоредуктазы", "тиоредокс-мотив" или "редокс-мотив" используют в настоящем описании в качестве синонимических терминов и они относятся к мотиву с общей последовательностью [CST]-XX-[CST], в которой C обозначает цистеин, S обозначает серин, T обозначает треонин и X обозначает любую аминокислоту, за исключением тирозина, фенилаланина или триптофана.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится способам профилактики или лечения у индивидуума инфекции внутриклеточным патогеном. Кром