Сухая композиция трансглутаминазы

Сухая композиция трансглутаминазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение касается композиций трансглутаминазы, в частности, стабильных лиофилизированных или высушенных распылением композиций XIII фактора свертывания крови, и также оно касается способов изготовления указанных композиций, восстановленных растворов, фармацевтических композиций и способов лечения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансглутаминазы представляют собой Са²⁺ зависимые ферменты, которые катализируют образование изопептидных связей в белках между γ-карбоксамидной группой боковой цепи глутамина и ε-аминогруппой боковой цепи лизина. Трансглутаминазы обнаруживаются как внеклеточно, так и внутриклеточно. Примерами трансглутаминаз являются фактор XIII, эпидермальные трансглутаминазы, трансглутаминазы II типа (трансглутаминазы тканевого типа, трансглутаминазы печени) и трансглутаминазы I типа (трансглутаминазы кератиноцитов).

XIII фактор свертывания крови (FXIII) является плазменной трансглутаминазой, известной также как "фибринолигаза" и "фибрин-стабилизирующий фактор", циркулирующей в плазме в концентрации 20 мкг/мл. Этот белок существует в плазме в виде тетрамера, состоящего из двух субъединиц А и двух субъединиц В (А₂В₂). Каждая субъединица имеет молекулярный вес приблизительно 80000 Да, а весь белок имеет молекулярный вес приблизительно 330000 Да. Субъединицы А содержат каталитический сайт трансглутаминазы, тогда как субъединицы В не обладают каталитической активностью, но играют роль структурного белка, препятствуя клиренсу субъединицы А.

Для активации фактора XIII необходимы тромбин и Са²⁺. Тромбин разрезает субъединицы А по Arg37 (в С-концевом положении по отношению к нему), таким образом, отщепляя пептид активации (остатки 1-37 субъединицы А) и субъединицы В с образованием активной формы димера А₂. Активированная субъединица FXIII А₂ (FXMIa) является каталитически активной формой FXIII.

Фермент FXIII является ферментом коагуляционного каскада, активация которого происходит в последнюю очередь, а его функция состоит в поперечном связывании α- и γ-цепей фибрина, что в результате приводит к образованию прочного тромба с повышенной устойчивостью к фибринолизу. Кроме того, к тромбу присоединяются ряд антифибринолитических, прокоагуляционных и адгезивных белков, что придает фибрину структурную прочность и повышенную механическую устойчивость к растворению под действием плазмина и других протеолитических ферментов.

В коммерчески доступные очищенные или частично очищенные препараты трансглутаминазы, или фактора XIII, во многих случаях добавляют стабилизаторы, такие как альбумин сыворотки человека (HSA). Применение белковых стабилизаторов может быть связано с проблемами, поскольку приводит к снижению специфической активности белка, повышает содержание белка при введении пациентам и может мешать определению степени чистоты препарата. Кроме того, это может стать причиной иммуногенности белкового препарата. Эти недостатки белковых стабилизаторов делают их применение особенно нежелательным для стабилизации высокоочищенных белков, таких как рекомбинантные белки. Кроме того, применение белковых стабилизаторов может стать причиной контаминации вирусными антигенами, например, когда добавляется альбумин.

FXIII, выделенный из плаценты или плазмы, или находящийся в форме свежезамороженной плазмы, применяли в течение многих лет для лечения дефицита XIII фактора. Однако недостатком таких препаратов является присутствие в них чужеродных белков и все связанные с этим проблемы, такие как нежелательная иммуногенность.

В настоящее время возможно получать трансглутаминазы и фактор XIII с применением технологии рекомбинантных ДНК. В данном описании rFXIII означает рекомбинантный фактор XIII. Однако до настоящего времени на рынке не существует коммерчески доступного продукта rFXIII.

Композиция и активность белковых препаратов, применяемых для терапии, должны быть стабильны в течение относительно долгих периодов времени. Такие продукты зачастую поступают на рынок в сухой форме по той причине, что добиться такой стабильности для растворов удается только изредка. Сублимационная сушка в мягких условиях (лиофилизация) является одним из способов выбора для высушивания таких продуктов. Однако, даже при применении такого способа, трудно получить стабильные препараты, соответствующие требованиям по своей надежности и долговечности.

Сублимационная сушка растворов трансглутаминазы или фактора XIII может, например, привести к выраженному снижению активности и потере чистоты. Еще одна проблема сублимационной сушки, например, фактора XIII, связана с продуктом деградации фактора XIII, так называемыми активированными непротеолитическим путем формами (FXIIIa⁰), также обозначаемым преактивированным фактором XIII. Считается, что FXIIIa⁰ представляет высокий риск токсичности и его инъекции могут приводить к возможным нежелательным побочным эффектам. Таким образом, желательно стабилизировать препараты трансглутаминазы, или фактора XIII, предотвращая формирование активированных непротеолитическим путем продуктов.

Известны различные аналоги сухих композиций FXIII. Ниже приводятся примеры описаний лиофилизированных композиций FXIII. В WO 2002/36155 показано, что лиофилизированная композиция FXIII может быть приготовлена с добавлением 1 мМ EDTA, 10 мМ глицина, 2% сахарозы в воде или 20 мМ гистидина, 3% (вес/объем) сахарозы, 2 мМ глицина и 0,01% (вес/объем) полисорбата, pH 8,0. US 6204036 (Aventis Behring) касается стабильного лиофилизированного препарата трансглутаминазы, содержащего по меньшей мере одну добавку, выбранную из группы D- и L-аминокислот и их солей, производных, гомологов и димеров, углеводов и многоатомных спиртов, поверхностно активных компонентов и восстанавливающих агентов с той оговоркой, что добавка не является глицином или аргинином, причем препарат не содержит белкового стабилизатора и причем указанный препарат растворяется без появления мутности в водном растворителе, подходящем для парентерального введения.

Такие препараты, упомянутые выше, тем не менее, могут иметь описанный выше недостаток, а именно высокий уровень активированного непротеолитическим путем фактора XIII, что считается препятствием для возможности клинической и коммерческой реализации этих препаратов. Таким образом, очевидно, что существует большая потребность в стабильных сухих препаратах трансглутаминазы и фактора XIII с низким уровнем активированных непротеолитическим путем продуктов. Более того, такие препараты не должны нуждаться в добавлении белковых стабилизаторов, например, HSA.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что соли, например моновалентные соли, оказывают существенный стабилизирующий эффект на сухую трансглутаминазу, например на композиции фактора XIII, в отношении степени ее чистоты и формирования преактивированной трансглутаминазы. Показано, что данный эффект является специфичным для сухого состояния и имеет особенную значимость для получения стабильного коммерческого продукта.

В одном аспекте данного изобретения предлагается сухая композиция трансглутаминазы, которая может быть получена посредством лиофилизации или высушивания распылением водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ.

В других аспектах данного изобретения предлагается способ получения указанной сухой композиции трансглутаминазы, восстановленного раствора, фармацевтической композиции и способ лечения.

Иные предметы, признаки и преимущества данного изобретения станут более понятны из следующего подробного описания. Однако следует иметь в виду, что подробное описание и конкретные примеры, указывающие на предпочтительные воплощения изобретения, приводятся только в иллюстративных целях, поскольку специалистам будут очевидны различные изменения и модификации, остающиеся в рамках изобретения, исходящие из этого подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: Оценка уровня сахарозы и NaCl. Анализ влияния 25 мМ NaCl на степень чистоты образцов, хранившихся при 40°С, определяемую посредством анионообменной ВЭЖХ, выполненный в программе Modde.

Фиг. 2: Полный факторный анализ уровней NaCl и гистидина. Анализ данных, полученных для rFXIIIa° при 25°С, выполненный в программе Modde.

Фиг. 3: Полный факторный анализ уровней NaCI и гистидина. Анализ данных, полученных при определении степени чистоты при помощи анионообменной ВЭЖХ, выполненный в программе Modde.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термины "преактивированная" или "активированная непротеолитическим путем" трансглутаминаза, в отношении данного изобретения, означает трансглутаминазу, которая подверглась непротеолитической активации, например, в случае, когда фактор XIII становится активированным в отсутствии тромбина (тромбин обладает способностью протеолитически расщеплять FXIII), говорят, что произошла его непротеолитическая активация; см., например, Polgar J., et al. Biochem J 1990; 267: 557-60. Muszbek L, et al. Thrombosis Research 94 (1999) 271-305. Активированный непротеолитическим путем фактор XIII (FXIII°), который представляет собой продукт деградации FXIII, представляет собой опасность для фармацевтической композиции FXIII, поскольку считается продуктом деградации с высоким риском токсичности.

Термин "биологически активный" здесь означает обладающий активностью в живом организме, например, важный в медицинских, сельскохозяйственных или косметических целях.

Термин "водная композиция" в отношении данного изобретения означает композицию, содержащую воду в жидком состоянии. Такая композиция обычно представляет собой раствор или суспензию. Термин "водная композиция", употребляемый в контексте данного изобретения, относится к препарату, содержащему по меньшей мере 50% воды в весовом отношении (вес/вес).

Термин "разбавитель" в отношении данного изобретения относится к жидкому раствору или суспензии. Термин "разбавитель", употребляемый в контексте данного изобретения, обозначает раствор или суспензию, содержащие по меньшей мере 50% воды в весовом отношении (вес./вес.). В контексте данного изобретения разбавитель применяют для растворения («восстановления») сухой композиции трансглутаминазы.

Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитируемые здесь, включены сюда во всей полноте посредством ссылки, в той же степени, как если бы для каждой ссылки отдельно и специально было указано, что она включена сюда во всей своей полноте путем ссылки (в наибольшей степени, допустимой существующим законодательством).

Все заголовки и подзаголовки использованы здесь только для удобства и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение каким-либо образом.

Применение каждого и любого из примеров или примеров формулировок (например, "такой как") в данном описании предназначено попросту для лучшего разъяснения изобретения и не ограничивает рамки изобретения, если это не указано иначе. Ни одна формулировка в описании не должна рассматриваться как указание на то, что какой-либо незаявленный элемент является незаменимым для осуществления изобретения.

Упоминание и включение посредством ссылки патентных документов здесь производится только для удобства и не отражает никоим образом действительность, патентоспособность и/или законность таких патентных документов.

Данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, упомянутые в прилагаемых пунктах формулы изобретения, согласно существующему законодательству.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предлагаются композиции трансглутаминазы, в частности, стабильные лиофилизированные или высушенные распылением композиции трансглутаминаз, например, XIII фактора свертывания крови (FXIII). В изобретении также предлагаются способы изготовления упомянутых сухих композиций трансглутаминазы, восстановленных растворов, фармацевтических композиций и способы лечения.

В данном изобретении предлагается продукт, содержащий трансглутаминазу, например, фактор XIII, имеющий уровень чистоты и уровень преактивации, остающиеся приемлемыми в течение всего производственного процесса, хранения и периода применения продукта трансглутаминазы.

Композиции по настоящему изобретению, обеспечивающие улучшенную стабильность в отношении уровня преактивации и общей чистоты, содержат сухую композицию трансглутаминазы, причем указанную композицию можно получать посредством лиофилизации или высушивания распылением водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ.

В одном воплощении сухая композиция по данному изобретению содержит сухую композицию трансглутаминазы, указанную композицию можно получать посредством лиофилизации или высушивания распылением водной композиции, содержащей трансглутаминазу, соль и по меньшей мере один из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из углевода, аминокислоты и буфера, причем концентрация соли в водной композиции находится в диапазоне от 5 до 100 мМ, с той оговоркой, что композиция не является сухой композицией фактора XIII, полученной посредством лиофилизации раствора фактора XIII, содержащего 0,5% NaCl и 2,25% глицина.

В одном воплощении сухая композиция по данному изобретению не содержит каких-либо белковых стабилизаторов, таких как альбумин.

Описанные ниже воплощения и примеры главным образом описывают и раскрывают композиции рекомбинантного FXIII (rFXIII), но данное изобретение не ограничивается этими воплощениями и примерами, но может также относиться к композициям любых трансглутаминаз, известных в настоящее время или тех, что будут открыты в будущем.

Компоненты композиции

Композиция по данному изобретению содержит трансглутаминазу. Примеры трансглутаминаз, которые могут быть стабилизированы препаратами по данному изобретению, включают фактор XIII, эпидермальные трансглутаминазы, трансглутаминазы II типа (трансглутаминазы тканевого типа, трансглутаминазы печени) и трансглутаминазы I типа (трансглутаминазы кератиноцитов), но не ограничиваются ими.

Фактор XIII

В одном воплощении водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, содержит соединение фактора XIII. Соединение фактора XIII может, например, быть естественным путем образованным фактором XIII дикого типа и естественным путем образованными аллельными вариантами фактора XIII. Эти соединения FXIII могут иметь, например, человеческое или животное происхождение, например, быть человеческим FXIII, свиным FXIII и бычьим FXIII. Последовательности человеческого фактора XIII дикого типа могут быть найдены, например, в ЕР 268772 и ЕР 236978. Соединение фактора XIII по данному изобретению включает тетрамер зимогена полного фактора XIII (А₂В₂) и фактор ХIIIа, а также их субъединицы, включая субъединицу А и димеры А₂.

Соединение фактора XIII по данному изобретению, может, например, представлять собой биологически активные фрагменты, производные или варианты фактора XIII, сохраняющие по меньшей мере часть характерной активности фактора XIII дикого типа, обеспечивающей поперечное сшивание. Такая активность, обеспечивающая поперечное сшивание, может быть измерена способами, известными в данной области техники.

В некоторых воплощениях биологически активные фрагменты, производные или варианты фактора XIII сохраняют 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% обеспечивающей поперечное сшивание активности фактора XIII дикого типа.

Фрагменты, производные и варианты фактора XIII включают варианты с заменами, инсерциями и делециями. Варианты с инсерциями содержат сшивки по амино- и/или карбокси-концу, а также инсерции внутри последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Инсерции могут, например, быть произведены внутри зрелой кодирующей последовательности белка фактора XIII дикого типа. Варианты с делециями характеризуются удалением одного или нескольких аминокислотных остатков из белка фактора XIII дикого типа. Такие варианты обычно получают посредством сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов ДНК, кодирующей белок, таким образом, получая ДНК, кодирующую вариант, и затем экспрессируя ДНК в культуре рекомбинантных клеток. Однако, фрагменты вариантов белков могут также быть получены посредством синтеза in vitro. Тогда как сайт введения варианта аминокислотной последовательности обычно является предопределенным, сама мутация не обязательно должна быть предопределена. Например, с целью оптимизации внедрения мутации в заданном сайте может быть произведен случайный мутагенез целевого кодона или участка и проведен скрининг экспрессированных вариантов белков для выявления оптимальной комбинации желаемой активности. Методы для проведения замещающих мутаций в предопределенных сайтах ДНК с известной последовательностью хорошо известны, например, мутагенез с праймером М13. Варианты замен представляют собой те, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности был удален и на его место вставлен другой аминокислотный остаток. Аминокислотные замены, как правило, затрагивают один аминокислотный остаток; инсерции обычно составляют порядка от 1 до 10 аминокислотных остатков; а делеции варьируют в пределах от 1 до 30 аминокислотных остатков. Делеции или инсерции могут, например, выполняться в смежных парах, т.е. делеции 2 аминокислотных остатков или инсерции 2 аминокислотных остатков. Для получения окончательной конструкции можно комбинировать замены, делеции, инсерции или любые их сочетания. Очевидно, что мутации, которые будут выполнены в ДНК, кодирующей вариант белка, не должны помещать последовательность за пределы рамки считывания и предпочтительно не должны создавать комплементарные участки, которые могут вызывать формирование вторичной структуры мРНК. Примером варианта фактора XIII, полученного при помощи генетической инженерии, является вариант Val34Leu человеческого фактора XIII дикого типа (т.е. вариант, в котором остаток Val в положении 34 в аминокислотной последовательности человеческого фактора XIII дикого типа заменен на остаток лейцина).

Фактор XIII по данному изобретению может быть выделен из разнообразного биологического материала, включая лизаты, гомогенизаты или экстракты клеток, которые продуцируют фактор XIII естественным образом, но также из клеток, которые были генетически модифицированы для выработки фактора XIII, таких как дрожжи, трансформированные ДНК, кодирующей фактор XIII. Пример способа очистки фактора XIII описан в WO/2006/021584.

Фактор XIII по данному изобретению может, например, быть получен при помощи технологии рекомбинантных ДНК. Способы получения рекомбинантного фактора XIII известны в области техники. См., например, Davie et al., ЕР 268.772; Grundmann et al., AU-A-69896/87; Bishop et al., Biochemistry 1990, 29: 1861-1869; Board et al., Thromb. Haemost. 1990, 63: 235-240; Jagadeeswaran et al., Gene 1990, 86: 279-283; and Broker et al., FEBS Lett. 1989, 248: 105-110. В одном воплощении димер А₂ фактора XIII вырабатывается в цитоплазме дрожжей Saccharomyces cerevisiae, согласно описанию в заявке на патент США Ser. No. 07/741263. Клетки собирают и лизируют и получают просветленный лизат. Лизат фракционируют при помощи анионо-обменной хроматографии при значениях pH от нейтральных до слегка щелочных при помощи колонки с производными агарозы, такими как DEAE Fast-Flow Sepharose™ (Pharmacia) или им подобными. Затем фактор XIII осаждают из элюируемого с колонки материала путем концентрации элюата и доведения pH до 5,2-5,5, например, путем диафильтрации против буферного раствора сукцината аммония. Затем преципитат растворяют и выполняют дальнейшую очистку при помощи обычных хроматографических методов, таких как гель-фильтрация и хроматография гидрофобного взаимодействия.

В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой рекомбинантный фактор XIII. В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой человеческий фактор XIII. В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой рекомбинантный человеческий фактор XIII. В одном воплощении данного изобретения фактор XIII представляет собой димер А субъединиц.

Концентрация фактора XIII в водных композициях, подлежащих лиофилизации или высушиванию распылением, может, например, варьировать в широком диапазоне, и в одном воплощении находится в диапазоне 0,003-100 мг/мл, в другом воплощении в диапазоне 1-30 мг/мл, и в следующем воплощении в диапазоне 2-15 мг/мл.

Соли

Водная композиция по изобретению содержит соль или смесь солей. Соль применяют для улучшения стабильности сухой композиции в отношении преактивации и в отношении общей степени чистоты. Разбавитель по изобретению может, например, содержать соль или смесь солей. В некоторых воплощениях соль представляет собой моновалентную соль. Примеры моновалентных солей, которые могут применяться, включают, например, хлорид натрия, хлорид калия, ацетат натрия, сульфат натрия, глюконат натрия и их смеси, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях соль представляет собой дивалентную соль. В некоторых воплощениях соль представляет собой дивалентную соль, с той оговоркой, что дивалентная соль не является солью Са (II).

Концентрация применяемой соли, например, NaCI, может, например, варьировать в определенном диапазоне и в одном воплощении находится в диапазоне 5-100 мМ, в следующих воплощениях в диапазонах 5-99 мМ, 7-95 мМ, 8-90 мМ, 10-80 мМ, 15-70 мМ, 25-75 мМ и 20-60 мМ, а в других воплощениях в диапазоне 25-50 мМ.

Углеводы и многоатомные спирты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением содержит один или несколько углеводов или многоатомных спиртов. Разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, может, например, содержать один или несколько углеводов или многоатомных спиртов. Углеводы или многоатомные спирты могут применяться для стабилизации белков в сухой композиции по изобретению во время сублимационной сушки для предотвращения физических/химических дестабилизирующих эффектов (например, разворачивания). Примеры углеводов или многоатомных спиртов, которые могут применяться, включают, например, сахарозу, маннит, трегалозу, лактозу, мальтозу, сорбит, раффинозу, декстрины, циклодекстрины и их производные, гомологи и смеси, но не ограничиваются ими.

Концентрация применяемого углевода или многоатомного спирта может, например, варьировать в широком диапазоне, и в одном воплощении находится в диапазоне 0,1-15% (в объемном отношении), в следующих воплощениях в диапазоне 0,1-8,5% (в объемном отношении), а в других воплощениях в диапазоне 0,5-5,0% (в объемном отношении).

Аминокислоты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, содержит одну или несколько аминокислот. В некоторых воплощениях данного изобретения разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, может содержать одну или несколько аминокислот. Аминокислоты могут, например, применяться для улучшения стабильности лиофилизированной или высушенной распылением композиции. В одном воплощении одну или несколько аминокислот применяют для уменьшения формирования агрегатов трангслутаминазы, например, FXIII, во время хранения композиции. Примеры аминокислот, которые могут применяться, включают глицин, гистидин, аргинин, глутаминовую кислоту, метионин, треонин, лизин, аланин, изолейцин и цистеин (Gly, His, Arg, Glu, Met, Thr, Lys, Ala, Ilе и Cys) и их соли, производные, гомологи, димеры, олигомеры и их смеси, но не ограничиваются ими.

Подходящие производные и гомологи хорошо известны. Подходящие производные включают: эфиры, тиоэфиры и амиды карбоксильной группы; ацилированные производные аминогруппы, включая производные уретана; а также простые эфиры, амиды и сложные эфиры боковых функциональных групп, но не ограничиваются ими. Походящие гомологи включают, например, орнитин (гомолог лизина), гомосерин и α-аминобутировую кислоту. Физиологически приемлемые соли также хорошо известны в области техники и описаны, например, Remington’s Pharmaceutical Science: Drug Receptors and Receptor Theory, (18 th ed.), Mack Publishing Co., Easton Pa. (1990).

Концентрации применяемых аминокислот могут, например, находиться в диапазоне 0,01-10% (в объемном отношении), или в диапазоне 0,1-3% (в объемном отношении).

Буферы

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит буфер. Буфер представляет собой раствор, содержащий вещество, способное предупреждать существенные изменения pH растворов, к которому добавлены кислоты или основания в малых количествах, что таким образом поддерживает в значительной степени исходную степень кислотности или основности раствора. Буфер, как правило, содержит слабую кислоту или слабое основание и их соль.

pH водных композиций может быть в диапазоне от 2 до 10, в частности, между 7 и 8. Для получения буферного эффекта могут применяться аминокислоты, описанные выше, или буферы, имеющие pH в диапазоне от 2 до 10. Примеры буферов, которые могут применяться, включают, например, ацетатные буферы, карбонатные буферы, цитратные буферы, глицилглициновые буферы, гистидиновые буферы, глициновые буферы, лизиновые буферы, аргининовые буферы, фосфатные буферы (содержащие, например, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия или фосфат натрия), TRIS [трис(гидроксиметил)аминометановые] буферы, бициновые буферы, трициновые буферы, малатные буферы, сукцинатные буферы, малеатные буферы, фумарантые буферы, тартратные буферы, аспартатные буферы и их смеси, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях применяют цитратные буферы, гистидиновые буферы, натрий-фосфатные буферы, сукцинатные буферы и TRIS-буферы. В одном воплощении применяют гистидин.

Концентрации применяемых буферов могут, например, быть в диапазоне 0-50 мМ, или в диапазоне 0-25 мМ.

Другие соединения

Водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, могут также иметь в своем составе один или несколько других соединений. Такие дополнительные ингредиенты включают неионные сурфактанты, восстанавливающие агенты, хелатирующие агенты, антиоксиданты, консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы, наполнители, модифицирующие тоничость агенты (агенты для регулирования тоничности), жировые основы, белки (например, альбумин сыворотки человека, желатин или другие белки) и амфотерные вещества (например, бетаин, таурин или аминокислоту, такую как аргинин, глицин, лизин или гистидин), но не ограничиваются ими. Такие дополнительные ингредиенты конечно не должны неблагоприятно влиять на общую стабильность водной композиции или сухой композиции по данному изобретению. С учетом этого приводится ссылка: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Неионные сурфактанты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит неионный сурфактант. Ионные сурфактанты представляют собой поверхностно-активные агенты, проявляющие свой эффект посредством защиты белков от контакта с критическими поверхностями (например, посредством их упаковки). Ионные сурфактанты могут, например, применяться для улучшения стабильности лиофилизированной или высушенной распылением композиции. Примеры неионных сурфактантов, которые могут применяться, включают, например, Твин 80, Твин 20, ПЭГ, ацетиловый спирт, PVP, PVA, ланолиновый спирт, сорбитан моноолеат, полоксамеры и алкилированные эфиры полиоксиэтилена, но не ограничиваются ими. В одном воплощении применяется Твин 20.

Концентрации применяемых неионных сурфактантов могут, например, быть в диапазоне 0,00001-5% (в объемном отношении), или в диапазоне 0,0002% и 0,1% (в объемном отношении).

Восстанавливающие агенты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит восстанавливающий агент. Восстанавливающие агенты, такие как антиоксиданты, применяют для удаления свободных радикалов, которые могут дестабилизировать белки. Примеры восстанавливающих агентов, которые могут применяться, включают, например, цистеин, N-ацетил-цистеин, тиоглицерол, сульфид натрия, токоферолы и глутатион, но не ограничиваются ими.

Хелатирующие агенты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит а хелатирующий агент. Хелатирующие агенты применяют для удаления из препарата металлов (железо, медь) и, как правило, это приводит к защите белков от реакций, катализируемых металлами. Примеры хелатирующих агентов, которые могут применяться, включают, например, соли ЭДТА, лимонную кислоту и аспарагиновую кислоту и их смеси, но не ограничиваются ими. В одном воплощении данного изобретения хелатирующий агент находится в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В одном воплощении данного изобретения хелатирующий агент находится в концентрации от 0,1 мг/мл до 2 мг/мл. В следующем воплощении данного изобретения хелатирующий агент находится в концентрации от 2 мг/мл до 5 мг/мл.

Антиоксиданты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит антиоксидант. В одном воплощении водная композиция содержит метионин (или другую серосодержащую аминокислоту или аналог аминокислоты) для ингибирования окисления остатков метионина в форму их сульфоксида, в случаях когда трансглутаминаза, например, FXIII, представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток метионина, подверженный такому окислению. Термин "ингибировать окисление" употребляется для обозначения уменьшения накопления окисленных форм (метионина) с течением времени. Ингибирование окисления метионина приводит к лучшему сохранению полипептида в надлежащей молекулярной форме. Может применяться любой стереоизомер метионина (например, L, D или изомер DL) или их сочетания. Добавляемое количество должно быть количеством, достаточным для ингибирования окисления остатков метионина, так чтобы количество метионина в форме сульфоксида было приемлемым, согласно требованиям регулятивных органов. Как правило, это означает, что композиция содержит не более чем приблизительно от 10% до приблизительно 30% метионина в форме сульфоксида. В общем, этого можно добиться путем добавления метионина так, чтобы молярное соотношение добавленного метионина к остаткам метионина варьировало от приблизительно 1:1 до приблизительно 1000:1, например, от 10:1 до приблизительно 100:1.

Консерванты

В некоторых воплощениях данного изобретения водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением, и/или разбавитель, применяемый для растворения высушенной композиции, содержит консервант. Согласно нормативным требованиям, консерванты можно добавлять в контейнеры для многократного дозирования. Консерванты применяют в качестве противомикробных агентов для защиты от микробной контаминации во время многократного забора из флаконов при дозировании. Примеры консервантов, которые могут применяться, включают, например, фенол, о-крезол, m-крезол, р-крезол, хлоркрезол, метил р-гидроксибензоат, этил р-гидроксибензоат, пропил р-гидроксибензоат, бутил р-гидроксибензоат, 2-феноксиэтанол, 2-фенилэтанол, бензиловый спирт, хлоробутанол, тимеросал, бронопол, бензойную кислоту, имидомочевину, хлорогексидин, дегидроацетат натрия, бензетоний хлорид, хлорфенезин (3р-хлорфеноксипропан-1,2-диол) и их смеси, но не ограничиваются ими. Консервант может, например, находиться в концентрации от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. В одном воплощении данного изобретения консервант находится в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В следующем воплощении данного изобретения консервант находится в концентрации от 5 мг/мл до 10 мг/мл. В следующем воплощении данного изобретения консервант находится в концентрации от 10 мг/мл до 20 мг/мл.

Специалист сможет применить описанные ниже способы для анализа эффектов одного или нескольких компонентов, добавленных в сухую композицию или водную композицию по изобретению, на стабильность, преактивацию и степень чистоты в ходе обычных экспериментов.

Сухая композиция - порошок

После лиофилизации или высушивания распылением композиция по изобретению окажется в сухой форме. Сухая композиция по изобретению может, например, быть твердым, порошкообразным или гранулированным материалом. В одном воплощении сухая композиция по изобретению представляет собой порошок. Уровень остаточной влаги в этой сухой композиции имеет важное значение для стабильности сухой трансглутаминазы, например, FXIII, во время хранения. В одном воплощении изобретения сухая композиция содержит менее 3% остаточной влаги. В следующем воплощении сухая композиция содержит менее 1% остаточной влаги.

Способы высушивания и растворение

Лиофилизация и высушивание распылением водной композиции по данному изобретению может выполняться при помощи способов лиофилизации и высушивания распылением, хорошо известных специалистам: в отношении лиофилизации см., например, Williams and Polli (1984), J.Parenteral Sci. Technol. 38:48-59; в отношении высушивания распылением, см., например, Masters in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essex, U.K., 1991), pp.491-676; Broadhead etal. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; и Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20. Могут применяться также другие методы высушивания, такие как воздушная сушка, см. Carpenter and Crowe (1988), Cryobiology 25:459-470; и Roser(1991) Biopharm. 4:47-53.

В отношении данного изобретения, когда делается ссылка на лиофилизацию и высушивание распылением, также предполагается, что могут быть использованы и другие способы высушивания. Например, выражение "водная композиция, подлежащая лиофилизации или высушиванию распылением", в отношении данного изобретения также подразумевает "водную композицию, подлежащую высушиванию при помощи других способов высушивания".

В одном воплощении сухую композицию по данному изобретению получают посредством лиофилизации. Процесс лиофилизации обычно включает следующие этапы: этап замораживания, этап первичной сушки и этап вторичной сушки. На этапе замораживания водную композицию охлаждают. Температуру и длительность этапа замораживания выбирают таким образом, чтобы все компоненты композиции были полностью заморожены. Например, подходящая температура замораживания составляет приблизительно -40°С. На этапе первичной сушки лед, образовавшийся во время замораживания удаляют посредством сублимации под вакуумом при температурах ниже окружающей. Например, давление в камере, применяющееся для сублимации, может, например, составлять приблизительно от 40 миллиторр до 400 миллиторр, а температура может, например, составлять от -30°С до -5°С. После первичной сушки любое остаточное количество жидкости, которое не было удалено посредством сублимации, удаляется в ходе вторичной сушки, т.е. десорбции. Температура во время вторичной сушки приблизительно равна или выше температуры окружающей среды.

В одном воплощении изобретения в этап замораживания во время лиофилизации вводят отжиг (этап нагревания). Это нагревание выполняют до температур ниже точки замерзания препарата. Такой отжиг (этап нагревания) может способствовать дальнейшей стабилизации сухой композиции по изобретению.

Растворение (восстановление)

На желаемом этапе, например, когда пациенту требуется ввести трансглутаминазу, например FXIII, сухую композицию по изобретению можно растворить разбавителем. Растворение обычно происходит при температуре около 25°С для обеспечения полной гидрат