Терапевтические антитела

Терапевтические антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Изобретение относится к области терапевтических антител.

Уровень техники

Протеолиз каждого из белков комплемента С3-С5 приводит к образованию аминоконцевых катионных фрагментов с сигнальными молекулами, которые называются анафилотоксинами. Наиболее мощный из них, С5а, вызывает самые обширные ответы. Учитывая компоненты воспалительной реакции, такие как маргинация (краевое стояние) и инфильтрация лейкоцитов, высвобождение связанных с гранулами протеолитических ферментов, образование активированного кислорода и радикалов-производных азота, изменения в кровотоке и капиллярная утечка, а также способность гладких мышц сокращаться, молекула С5а является «полным» провоспалительным медиатором. На уровнях от субнаномолярного до наномолярного молекула С5а вызывает хемотаксис всех миелоидных линий (нейтрофилов, эозинофилов и базофилов, макрофагов и моноцитов) и сосудистую проницаемость, которая заметно усиливается простагландинами и циркулирующими лейкоцитами. Более высокие наномолярные концентрации вызывают дегрануляцию и активацию NADPH-оксидазы. Эта широта биологической активности контрастирует с другими медиаторами воспаления. С5а участвует в патогенезе различных заболеваний, включая ревматоидный артрит, псориаз, сепсис, реперфузионное повреждение и респираторный дистресс-синдром взрослых (Gerard and Gerard, 1994; Murdoch and Finn, 2000).

Активности С5а опосредованы связыванием С5а с его рецептором (C5aR). C5aR принадлежит семейству рецепторов, связанных с G-белком, с семью трансмембранными доменами. C5aR является высокоаффинным рецептором к С5а с Kd примерно 1 нМ и располагается на нескольких различных типах клеток, включая лейкоциты. Число рецепторов на каждой клетке является чрезвычайно высоким, до 200000 сайтов на одном лейкоците. Биологическая активация рецептора происходит в диапазоне, насыщающем связывание.

Структура C5aR соответствует семейству рецепторов с семью трансмембранными доменами, где за внеклеточным N-концом следуют семь трансмембранных спиралей, соединенных межспиральными доменами, которые чередуются как внутриклеточные и внеклеточные петли, заканчиваясь внутриклеточным С-концевым доменом. C5aR содержит расширенный N-концевой внеклеточный домен. Этот большой N-концевой домен является типичным для рецепторов, связанных с G-белками, которые связывают пептиды, включая семейства рецепторов IL-8 и fMet-Leu-Phe (FMLP).

Ингибирование ответов С5а антагонистами C5aR снижает острый воспалительный ответ, опосредованный через С5а, не затрагивая другие компоненты комплемента. С этой целью пептидные антагонисты C5aR и антитела против рецептора С5а были описаны ранее (Watanabe et al., 1995; Pellas et al., 1998; Konteatis et al., 1994; Kaneko et al., 1995; Morgan et al., 1993). Например, WO 95/00164 описывает антитела, направленные против М-концевого пептида (остатки 9-29) C5aR. WO 03/062278 также описывает антитела, направленные против C5aR. Три из этих мышиных антител были названы 7F3, 6С12 и 12D4. Было показано, что эти антитела обладают превосходными свойствами, такими как очень эффективное блокирование связывания С5а с его рецептором, остановка С5а-направленной миграции нейтрофилов in vitro и профилактика воспаления на животных моделях. Для контроля хронических заболеваний может быть необходимым введение антитела в повторных отборах в течение нескольких месяцев или лет.Тем не менее, одним недостатком введения мышиных антител является то, что иммунная система человека может образовывать свои собственные антитела, направленные против мышиного антитела (НАМА-реакция). НАМА-ответ может нейтрализовать мышиные антитела путем быстрого удаления их из крови, тем самым предотвращая связывание мышиного антитела с его мишенью. Чтобы избежать развития НАМА-реакции, была принята одна стратегия для «гуманизации» («очеловечивания») мышиного антитела путем замены «чужих» остатков на участках, не связывающих эпитоп, на человеческие последовательности.

Основной проблемой процедур гуманизации была потеря аффинности к антигену (Jones et al., 1986), в некоторых случаях в 10 раз или более, особенно когда антиген является белком (Verhoeyen et al., 1988). Потеря любой аффинности, конечно, крайне нежелательна. По меньшей мере это означает, что в организм пациента должно быть введено большее количество гуманизированного антитела при более высокой стоимости и более высоком риске побочных эффектов. Еще более важно, что антитело со сниженной аффинностью может иметь более слабые биологические функции, такие как лизис комплемента, антителозависимая клеточная цитотоксичность или нейтрализация вируса. Не смотря на эти трудности, успешная гуманизация антител против человеческого C5aR была описана в WO 2009/103113.

На протяжении многих лет было разработано множество стратегий для дальнейшего снижения риска любых нежелательных побочных реакций от введения пациентам антител, включая снижение вероятности образования антител против лекарства у пациентов путем создания «полностью» человеческих антител.

Даже сегодня идентификация антител, пригодных для терапевтического применения, является сложной задачей. Поэтому альтернативные и/или улучшенные антагонисты C5aR, которые могут быть использованы в диагностических и/или терапевтических способах, сохраняют большой интерес.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к анти-C5aR-антителам и их применению в диагностических и/или терапевтических способах. Изобретатели выявили ряд антител, связывающих человеческий C5aR, которые в нескольких аспектах функционально превосходят антитела к C5aR, описанные ранее.

Как показано в данном документе, изобретатели выявили ряд человеческих антител, которые связываются с человеческим C5aR (hC5aR) и могут вытеснять hC5a, связанный с hC5aR, и ингибировать hC5a-опосредованную миграцию нейтрофилов. Кроме того, изобретатели успешно преобразовали нечеловеческие остатки, присутствующие в каркасной области одного из этих анти-hC5aP-антител, в остатки зародышевой линии человека без влияния на активность антитела.

Кроме того, изменяя Fc-область, изобретатели создали анти-hC5aP-антитело, которое не вызывает фагоцитоз, ADCC или CDC in vitro. Детали изобретения будут очевидны из описания примерных воплощений.

Аспект данного изобретения относится к антителу, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные последовательности CDR включают одну из следующих групп последовательностей: SEQ ID 1, 2 и 3, SEQ ID 9, 10 и 11, SEQ ID 17, 18 и 19, SEQ ID 25, 26 и 27, или варианты каждой из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты замещены другими аминокислотными остатками.

Аспект данного изобретения относится к антителу, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные последовательности CDR включают одну из следующих групп последовательностей: SEQ ID 5, 6 и 7, SEQ ID 13, 14 и 15, SEQ ID 21, 22 и 23, SEQ ID 29, 30 и 31, или варианты каждой из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты замещены другими аминокислотными остатками.

Аспект данного изобретения относится к человеческому антителу, специфически связывающемуся с hC5aR, где указанное антитело связывает предпочтительно вторую внеклеточную петлю hC5aR.

Аспект данного изобретения относится к антителу, специфически связывающемуся с hC5aR, где Fc-область антитела была модифицирована по сравнению с IgG1, IgG2, IgG4 и референсными последовательностями IgG4/G2 для уменьшения способности антител индуцировать фагоцитоз, ADCC и/или CDC через взаимодействие с рецептором Fcgamma (FcγR). В конкретном воплощении Fc-область антитела представляет собой IgG1, а в другом конкретном воплощении Fc-область содержит одну или более чем одну из следующих групп точечных мутаций:

I) N297Q и/или

II) L234A и L235E и/или

III) G236R и L328R и/или

IV) N297Q, L234A и L235E и/или

V) N297Q, L234A, L235E и G237A и/или

VI) L234A, L235E, G237A, АЗЗО и P331S

В другом аспекте изобретение относится к применению антител в соответствии с изобретением для лечения иммунологического заболевания или нарушения.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтического количества антитела, описанного в данном документе.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения или профилактики нарушения у субъекта, причем способ включает введение субъекту антитела изобретения. В одном воплощении нарушение представляет собой иммунопатологическое нарушение, такое как аутоиммунное заболевание.

Другие аспекты и воплощения изобретения будут очевидны из приведенного здесь описания, включая примерные воплощения. Как следует из описания, изобретение предусматривает новые терапевтические антитела с различными выгодами и преимуществами, охарактеризованными в данном документе.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 показаны выравнивания вариабельных областей выбранных моноклональных антител, выделенных и охарактеризованных в приложении.

На фиг.2 показана специфичность связывания выбранных антител м мышиными/человеческими химерами C5aR. Связывание 32F3A6, 35F12A2 и 35F32A3 с химерным человеческим/мышиным C5aR по сравнению со связыванием референсного антитела Q. Химерные рецепторы показаны схематично. Области, полученные из человеческого и мышиного C5aR, показаны тонкой линией и жирной линией, соответственно.

На фиг.3 показаны выравнивания вариабельных областей из одного антитела с тяжелой и легкой вариабельными последовательностями ближайшего антитела человеческой зародышевой линии. «/» обозначает «разрыв в последовательности», например, между V-, D- или J-сегментами.

Фиг.4. Клинические показатели для трех групп испытуемых, получающих однократную нагрузочную дозу (стрелка) 0,5, 1,5 или 10 мг/кг внутрибрюшинно через 5 дней после установленного воспаления, на модели с переносом сыворотки K/BxN-hC5aR-KO/KI, с последующим введением 9 ежедневных доз 0,25, 0,5 или 2 мг/кг, соответственно, со столбцами ошибок, представляющими ±SD. За контроли принимали IgG1 3G12.

Фиг.5. Экспрессия белка С5а в синовиальной жидкости пациентов с псориатическим артритом и остеоартритом (контроли). Уровень С5а был значительно повышен в группе пациентов с псориатическим артритом (р=0,001; критерий Манна-Уитни).

Фиг.6. Полуколичественный анализ экспрессии белка C5aR при болезни Крона и язвенном колите. Экспрессия белка C5aR была исследована с помощью иммуногистохимии и проанализирована с помощью теста Крускала-Уоллиса с последующим множественным сравнением с помощью критерия Данна в GraphPad Prism 5, и Р<0,05 считали значимым. Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.

Определения

Если не указано иное, то рекомбинантный белок, клеточная культура и иммунологические методики, используемые в данном изобретении, являются стандартными процедурами, хорошо известными специалистам в данной области. Такие методики описаны и разъяснены в литературе в таких источниках как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 и 1996), и F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols в Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience (1988, включая все обновления вплоть до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols в Immunology, John Wiley and Sons (включая все обновления вплоть до настоящего времени).

Используемые в данном документе термины «С5а-рецептор», «C5aR», «C5aRI» или «человеческий C5aR» и их варианты относятся к человеческому рецептору 1 компонента комплемента 5, который также известен в данной области как рецептор анафилатоксина С5а и антиген CD88. C5aR принадлежит к семейству рецепторов, связанных с G-белком, с семью трансмембранными доменами, и связывает С5а (Gerard and Gerard, 1991). Пример аминокислотной последовательности человеческого C5aR представлен в SEQ ID №41, тем не менее, специалисту в данной области будет ясно, что в природе существуют аллельные варианты этой молекулы, которые также охватываются термином «C5aR». Различные домены человеческого C5aR определены следующим образом:

аминокислоты 1-37: N-конец внеклеточного домена,

аминокислоты 38-61: трансмембранный домен,

аминокислоты 62-71: внутриклеточный домен,

аминокислоты 72-94: трансмембранный домен,

аминокислоты 95-110: внеклеточный домен - внеклеточная петля 1,

аминокислоты 111-132: трансмембранный домен,

аминокислоты 133-149: внутриклеточный домен,

аминокислоты 150-174: трансмембранный домен,

аминокислоты 175-206: внеклеточный домен - внеклеточная петля 2,

аминокислоты 207-227: трансмембранный домен,

аминокислоты 228-242: внутриклеточный домен,

аминокислоты 243-264: трансмембранный домен,

аминокислоты 265-283: внеклеточный домен - внеклеточная петля 3,

аминокислоты 284-307: трансмембранный домен,

аминокислоты 308-350: - С-конец внутриклеточного домена.

Термин «лечение», используемый в данном документе, относится к медикаментозной терапии любого человека или животного, нуждающегося в этом. Ожидается, что указанный субъект прошел медицинский осмотр врачом или ветеринаром, который поставил предварительный или окончательный диагноз, который указывал бы, что применение указанного специфического лечения будет полезно для здоровья указанного человека или животного. Сроки и цель указанного лечения могут варьировать от одного лица к другому в зависимости от состояния здоровья субъекта. Таким образом, указанное лечение может быть профилактическим, паллиативным, симптоматическим и/или терапевтическим. С точки зрения данного изобретения профилактическое, паллиативное, симптоматическое и/или терапевтическое лечение может представлять отдельные аспекты изобретения.

В отношении терапевтического лечения термин «субъект», используемый в данном документе, означает любых животных, в частности млекопитающих, таких как люди, лошади, коровы, собаки и кошки, и может, при необходимости, быть использовано взаимозаменяемо с термином «пациент». Предпочтительно субъектом является человек. Используемые в данном документе термины «лечение», «лечить» или «леченный» и их вариации включают введение терапевтически эффективного количества антитела изобретения, достаточного для снижения или устранения по меньшей мере одного симптома заболевания.

Используемые в данном документе термины «профилактический» или «профилактика» или их вариации относятся к защите субъекта от развития по меньшей мере одного симптома заболевания, или к снижению тяжести симптомов нарушения.

Используемый в данном документе термин «воздействие на клетку» относится к такому предоставлению антитела, чтобы оно могло контактировать/связывать человеческий C5aR при условии, что C5aR присутствует на клетке.

Термин «50 процентов эффективной концентрации» (сокращенно «ЕС50») представляет собой концентрацию антитела изобретения, которая требуется для 50 процентов данного эффекта молекулы, на которую нацелено антитело (например, ингибирующее/замещающее связывание человеческого С5а с человеческим C5aR). Специалисту в данной области следует понимать, что более низкое значение ЕС50 соответствует более сильному антителу.

Используемый в данном документе термин «ингибирование» относится к значительному снижению и, возможно, полной отмене определенной активности. Предпочтительно, определенная активность снижается или ингибируется по меньшей мере на 50 процентов, более предпочтительно по меньшей мере на 75 процентов и даже более предпочтительно по меньшей мере на 90 процентов.

В данном описании слово «содержат» или его вариации, такие как «содержит» или «содержащий», следует понимать как включающие указанный элемент, число или этап, или группу элементов, чисел или этапов, но не исключающее любой другой элемент, число или этап, или группу элементов, чисел или этапов.

В одном воплощении молекула состоит по существу из определенной последовательности.

В другом воплощении молекула состоит из определенной последовательности.

В одном воплощении молекула, такая как последовательность антитела или ДНК, является выделенной молекулой. Термин «выделенное антитело» относится к антителу, которое было отделено и/или извлечено из другого/других компонента(ов) его природной среды и/или очищено из смеси компонентов в его природной среде.

Термин «антитело», используемый в данном документе, включает целые антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты (т.е. «антигенсвязывающую часть») или их одинарные цепи. Антитела полной длины (или целые антитела) содержат четыре полипептидные цепи, две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), связанные друг с другом дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенной в данном документе как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH- и VL-области также могут быть подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR, complementarity determining region), которые перемежаются более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR, framework region).

Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Используемый в данном документе термин «антитело» используется для описания целых антител или их антигенсвязывающих фрагментов (т.е. «антигенсвязывающей части») или их одиночных цепей, которые специфически связываются с соответствующим антигеном. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (как правило, VL- и VH-домены одной ветви антитела), одноцепочечный Fv (scFv; см., например, Bird et al., Science 1988; 242:423-426; и Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (как правило, VH- и СН1-домен) и dAb (как правило, VH-домен); VH-, VL-, VhH- и V-NAR-домены; моновалентные молекулы, содержащие одиночную VH- и одиночную VL-цепь; миниантитела, двух-, трех-, четырехвалентные антитела и каппа-антитела (см., например, III et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); верблюжий IgG; IgNAR; a также один или более чем один выделенный CDR или функциональный паратоп, где изолированные CDR или антигенсвязывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны друг с другом с тем, чтобы сформировать функциональный фрагмент антитела. Различные типы фрагментов антител были описаны и рассмотрены, например, в Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005:23, 1126-1136; WO 2005040219, и в опубликованных патентных заявках США 20050238646 и 20020161201.

Термины «область, определяющая комплементарность» («CDR») или «гипервариабельная область», используемые в данном документе, относятся к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. CDR, как правило, состоят из аминокислотных остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, №публикации NIH 91-3242) и/или тех остатков из «гипервариабельной петли» (остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этой области осуществляется по способу, описанному Kabat et al., см. выше. Такие фразы, как «положение по Кабату», «остаток Кабата» и «в соответствии с Кабатом» в данном документе относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При использовании системы нумерации Кабата фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать аминокислотные вставки (остаток 52а, 52b и 52 с в соответствии с Кабатом) после остатка 52 в CDR H2, и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82 с и т.д. в соответствии с Кабатом) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Кабату.

Термины «остатки каркасной области» или «остатки FR» относятся к тем аминокислотным остаткам VH или VL, которые не входят в CDR, как они определены в данном документе.

Фрагмент антитела, способный к кристаллизации («Рс-область»/«Рс-домен»), представляет собой «хвостовую» область антитела, которая взаимодействует с рецепторами на клеточной поверхности, называемыми Fc-рецепторами, а также с некоторыми белками системы комплемента.

Моноклональные антитела обычно получают путем слияния клеток миеломы с клетками селезенки от мыши, которая была иммунизирована нужным антигеном. Человеческие моноклональные антитела могут быть получены от трансгенных животных (например, мышей или других подходящих видов), кодирующих человеческие антитела. Альтернативно, рекомбинантные моноклональные антитела могут быть сделаны с применением технологий, называемых клонированном репертуара или фаговым/дрожжевым дисплеем. Инженерия рекомбинантного антитела включает применение вирусов или дрожжей вместо мышей для создания антитела.

Термин «гуманизированное антитело», используемый в данном документе, относится к химерному человеческому/нечеловеческому антителу, которое содержит последовательности, обычно по меньшей мере минимальные области, определяющие комплементарность (CDR-последовательности), полученные из нечеловеческой зародышевой последовательности иммуноглобулина. Таким образом, гуманизированное антитело является человеческим иммуноглобулином (реципиентное антитело), в котором остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области нечеловеческого вида (донорного антитела), например мыши, крысы, кролика или примата, с нужной специфичностью, аффинностью и силой.

Гуманизированные антитела, которые содержат по меньшей мере CDR-области, не полученные из человеческих зародышевых последовательностей, также могут упоминаться как «химерные антитела», если гены легкой и тяжелой цепи антитела были сконструированы, как правило, путем генной инженерии, из генов вариабельной и константной области иммуноглобулина, полученного от других видов. Например, вариабельные сегменты генов из моноклонального мышиного антитела могут быть соединены с человеческими константными сегментами.

Термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых и каркасная область, и CDR-области получены из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Следует отметить, что такие антитела, тем не менее, могут включать аминокислотные остатки, которых нет в человеческих зародышевых иммуноглобулиновых последовательностях, в результате мутаций, происходящих при созревании in vivo или in vitro. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область также получена из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Человеческие антитела изобретения могут, тем не менее, включать аминокислотные остатки, не закодированные человеческими иммуноглобулиновыми зародышевыми последовательностями (например, мутации, введенные случайно или путем сайт-специфического мутагенеза in vitro или путем соматических мутаций in vivo). Тем не менее, термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, не включает антитела или альтернативные антигенсвязывающие области, в которых CDR-последовательности получены из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, и были привиты в человеческие каркасные последовательности (см. «гуманизированное антитело» выше). Человеческое антитело может быть человеческим моноклональным антителом. Такое человеческое моноклональное антитело может быть получено с помощью гибридомы, которая содержит В-клетку, полученную из трансгенного животного, например, из трансгенной мыши, имеющей геном с человеческим трансгеном тяжелой цепи и трансгеном легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой. Человеческие антитела могут быть выделены из библиотек последовательностей, построенных на подборке человеческих зародышевых последовательностей, также диверсифицированных с разнообразием природных и синтетических последовательностей. Человеческие антитела могут быть получены in vitro путем иммунизации лимфоцитов человека с последующей трансформацией лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр. Последовательность человеческого антитела может быть идентифицирована, что позволяет получать антитела с помощью рекомбинантных способов.

Кроме того, гуманизированные, человеческие и полностью человеческие антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти изменения сделаны для дальнейшего улучшения производительности антител.

Термин «производные антитела» относится к любой модифицированной форме антитела, например, к конъюгату антитела и другому агенту или антителу.

Термин «антиген» относится к молекулярной единице, используемой для иммунизации иммунокомпетентного позвоночного для производства антитела, которое распознает антиген. В данном описании термин «антиген» используется в более широком смысле и, как правило, включает молекулы-мишени, которые специфически распознаются антителом, таким образом, включает фрагменты или имитирующие молекулы, используемые в процессе иммунизации для повышения антитела, или такие молекулы, которые используются для скрининга после иммунизации, а также молекулы, используемые для скрининга в тех случаях, когда антитела получены альтернативными способами, такими как скрининг фагового дисплея.

Термин «эпитоп» используется в данном документе в контексте молекулярного взаимодействия между «антигенсвязывающим полипептидом», таким как антитело, и соответствующим ему «антигеном». Как правило, «эпитоп» относится к области или участку на антигене, с которым специфически связывается антитело, т.е. к области или участку, который физически контактирует с антителом. Белковый эпитоп может включать аминокислотные остатки на антигене, которые непосредственно участвуют в связывании с антителом (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, такие как аминокислотные остатков антигена, которые эффективно блокируются антителом (другими словами, аминокислотный остаток на «поверхности исключенного из растворителя объема» и/или «посадочное место» антитела). Данный антиген может содержать ряд различных эпитопов, которые могут включать, без ограничения, линейные пептидные антигенные детерминанты, конформационные антигенные детерминанты, которые состоят из одной или более несмежных аминокислот, расположенных рядом друг с другом в нативной (зрелой) конформации; и посттрансляционные антигенные детерминанты, которые состоят, полностью или частично, из молекулярных структур, ковалентно присоединенных к антигену, таких как углеводные группы.

Из того факта, что описания и определения эпитопов в зависимости от используемой методики картирования эпитопов получают с различными уровнями детализации, следует, что сравнение эпитопов для различных антител на одном и том же антигене может проводиться на различных уровнях детализации.

Термины «связывание», «специфическое связывание» и «специфичность связывания» используются в данном документе для описания селективности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Антитела в соответствии с изобретением могут специфически связывать C5aR, что указывает, что антитело имеет значительно более низкую аффинность к другим антигенам, где значительное снижение может быть снижением аффинности по меньшей мере в 2 раза, или в 5 раз, или в 10 раз. Антитело также может быть видоспецифичным, например, антителом, которое специфически связывается с высокой аффинностью с человеческим C5aR, но не с мышиным C5aR.

Термин «аффинность связывания» в данном документе используется для обозначения силы нековалентного взаимодействия двух молекул, например антитела или его фрагмента и антигена. Термин «аффинность связывания» используется для описания одновалентных взаимодействий (внутренняя активность). Аффинность связывания двух молекул, например антитела или его фрагмента и антигена, через моновалентное взаимодействие может быть количественно оценена путем определения константы диссоциации (K_D). В свою очередь, K_D может быть определена путем измерения кинетики формирования и диссоциации комплекса, например способом SPR. Константы скоростей, соответствующие ассоциации и диссоциации одновалентного комплекса, называются константой скорости ассоциации k_a (или k_on) и константой скорости диссоциации k_d (или k_off), соответственно. K_D связана с k_a и k_d через уравнение K_D=k_d/k_a.

Кроме того, «аффинность» относится к силе связывания между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и лигандом (например, антигеном). Аффинность молекулы Х к лиганду Y представлена константой диссоциации (K_d), которая представляет собой концентрацию Y, которая потребуется, чтобы занять сочетающие участки половины молекул X, присутствующих в растворе. Меньший Кд указывает на более сильное или более аффинное взаимодействие, и для заполнения сайтов необходима меньшая концентрация лиганда. Аналогичным образом, специфичность взаимодействия можно оценить путем определения и сравнения значений K_D для взаимодействия, представляющего интерес, например для специфического взаимодействия между антителом и антигеном, со значением K_D для взаимодействия, не представляющего интерес.

Как правило, K_D антитела по отношению к мишени будет в 2 раза, предпочтительно в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз меньше, чем K_D по отношению к другим, не целевым, молекулам, таким как неродственный материал или сопроводительный материал в окружающей среде или контроле. Более предпочтительно Ко будет в 50 раз меньше, например в 100 раз меньше или в 200 раз меньше; еще более предпочтительно в 500 раз меньше, например в 1000 раз меньше или 10000 раз меньше.

Значение этой константы диссоциации можно определить напрямую с помощью хорошо известных способов и вычислить даже для сложных смесей с помощью таких способов, как изложенные, например, в Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984). Например, K_D может быть установлен в анализе связывания с использованием двойного нитроцеллюлозного фильтра, такого который описан в Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Для оценки связывающей способности лигандов, таких как антитела, с мишенями в данной области известны другие стандартные анализы, включая, например, ИФА, вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ и проточную цитометрию. Кинетику связывания и аффинность связывания антитела также можно оценить с помощью стандартных анализов, известных в данной области, таких как поверхностный плазменный резонанс (SPR).

Можно проводить анализ конкурентного связывания, в котором связывание антитела с мишенью сравнивают со связыванием мишени другим лигандом этой мишени, например другим антителом. Концентрация, при которой происходит 50% ингибирование, называется Ki. В идеальных условиях Ki эквивалентна K_D. Значение Ki никогда не будет меньше, чем K_D, поэтому измерение Ki можно удобно заменить получением верхнего предела K_D.

Как будет понятно специалисту в данной области, термин «авидность» относится к общей силе взаимодействия между двумя молекулами, такими как антитело и антиген. Авидность зависит как от аффинности, так и от валентности взаимодействий.

Дальнейшие анализы для определения функциональности данных антител могут включать анализ на основе клеток, которые являются специфическими для данного антигена и эффекта связывания антитела.

Термин «идентичность», известный в данной области, относится к взаимосвязи последовательностей двух или более полипептидов, определенной путем сравнения последовательностей. В данной области «идентичность» также означает степень аффинности полипептидных последовательностей, определенную по количеству совпадений между строками двух или более аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент совпадений в меньшей из двух или более последовательностей с пробелами для выравнивания (если таковые имеются), рассматриваемых определенной математической моделью или компьютерной программой (т.е. «алгоритмами»). Идентичность родственных полипептидов можно легко вычислить известными способами. Такие способы включают, но не ограничиваясь ими, те, которые описаны в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073(1988).

Предпочтительные способы определения идентичности разработаны так, чтобы получить самое большое совпадение анализируемых последовательностей. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности двух последовательностей включают программный пакет GCG, в том числе GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215. 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и в других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., см. выше). Для определения идентичности также может быть использован хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.

Например, с помощью компьютерного алгоритма GAP (Genetics Computer Group, Университет штата Висконсин, Мэдисон, Висконсин) два полипептида, для которых должен быть определен процент идентичности последовательностей, выравнивают для оптимального совпадения их соответствующих аминокислот («интервал совпадения», определенный с помощью алгоритма). В сочетании с алгоритмом используется штраф за открытие делеции (который рассчитывается как 3-кратная средняя диагональ; «средняя диагональ» является средним значением диагонали используемой матрицы сравнения; «диагональ» является оценкой или числом, присваиваемым каждому точному совпадению аминокислоты с конкретной матрицей сравнения) и штраф за удлинение делеции (который обычно равен {(1/10) части} штрафа за открытие делеции), а также матрица сравнения, такая как РАМ 250 или BLOSUM 62. Стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) for the РАМ 250 comparison matrix; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) также используется алгоритмом.

Предпочтительные параметры для сравнения пептидной последовательности являются следующими:

Алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48. 443-453 (1970); Матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); штраф за открытие делеции: 12, штраф за удлинение делеции: 4, порог подобия: 0.

Программа GAP используется с указанными выше параметрами. Вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения пептидов (наряду с отсутствием штрафа за концевые делеции) с использованием алгоритма GAP.

«Консервативная аминокислотная замена» может включать замену одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, так что это не сильно влияет или вообще не влияет на