Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации

Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации

Реферат

Изобретение относится к акушерству и касается прогнозирования угрозы невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации.

Известно, что при физиологически протекающей беременности происходит супрессия адаптивного иммунитета, сопровождающаяся активацией врожденного иммунитета. (Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет, Москва, «ГЭОТАР-Медиа», 2007, с. 176). Иммунологический баланс беременной женщины ограждает от иммунной агрессии полуаллогенный плод, при этом сохраняя защиту от инфекционных агентов.

При недостаточной активации врожденного иммунитета при беременности организм становится более уязвимым для инфекции, что влечет за собой внутриутробное инфицирования и невынашивание беременности. Доказано, что урогенитальная инфекция - частая причина прерывания беременности. На данный момент основными причинами невынашивания считаются инфекции, передаваемые половым путем, и иммунные нарушения в организме женщины (Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. Москва. Триада-Х, 2000, с. 50).

Последние несколько лет ведущую роль при физиологически протекающей беременности и ее патологии занимает система врожденного иммунитета. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета - Toll-подобные рецепторы - это семейство сигнальных молекул, распознающих консервативные молекулярные паттерны патогенов, включая бактерии, вирусы, грибы (Abrahams Vikki М. Toll-like receptors in the cycling reproductive tract and during pregnancy. Current Woman,s Health Reviews, 2005, 1. p. 37).

Известно, что Toll-подобные рецепторы высоко экспрессируются лейкоцитами крови.

На данный момент известен способ прогнозирования выкидыша на ранних сроках гестации путем определения уровня экспрессии Toll-подобных рецепторов - TLR1-10 клетками эндометрия при состоявшемся выкидыше инфекционно-воспалительного генеза на сроке 6-10 недель у пациенток (Лебедева О.П., Пахомов С.П., Ивашова О.Н., Старцева Н.Ю., Чурносов М.И. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета в индукции апоптоза при невынашивании беременности ранних сроков. Акушерство и гинекология. №2 / 2015). Данный способ выбран нами в качестве прототипа. Недостатком данного способа является выявление маркеров невынашивания уже после выкидыша, а также то, что в качестве биологического материала для исследования были выбраны клетки эндометрия, полученные при выскабливании полости матки. Следовательно, подобная диагностика неприменима при угрозе невынашивания в I триместре, т.к. может спровоцировать выкидыш.

Нами была поставлена задача поиска маркеров прогнозирования угрозы невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации, связанных с показателями системы врожденного иммунитета.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является профилактика осложнений, обусловленных инвазивностью исследования (исключение забора биологического материала клеток эндометрия) при одновременном обеспечении точности прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации за счет использования в качестве биологического материала лейкоцитов периферической крови.

На первом этапе была обследована группа женщин с физиологически протекающей беременностью в I триместре и определены показатели системы врожденного иммунитета (установлена норма экспрессии генов TLR4, TLR9 и HBD1) в лейкоцитах периферической крови (Табл. 1).

При исследовании группы женщин с угрозой прерывания беременности инфекционного генеза ранних сроков гестации нами впервые было выявлено, что снижение экспрессии генов TLR4, TLR9 и HBD1, по меньшей мере, в 2,5 раза ассоциировано с выкидышем в первом триместре (Табл. 1). Угроза выкидыша происходит, по-видимому, за счет низкой активации врожденного иммунитета, приводящей к неспособности своевременно распознать и уничтожить патогены, что в дальнейшем ведет к развитию выкидыша.

Выявленные нами прогностические признаки оказались пригодными для клинических целей - прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации и, соответственно, своевременной коррекции ведения беременных.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации в лейкоцитах периферической крови беременной на 5-11 неделе гестации с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяют уровни экспрессии генов Toll-подобных рецепторов TLR4 и TLR9, гена противомикробного пептида HBD1. При одновременном снижении определяемых показателей, по меньшей мере, в 2,5 раза по сравнению с их уровнем, установленным при физиологически протекающей беременности, прогнозируют угрозу выкидыша в первом триместре гестации.

Способ осуществляется следующим образом.

Для изучения экспрессии генов TLR4, TLR9 и HBD1 используют следующую методику, которая включала в себя несколько последовательных этапов: забор венозной крови путем пункции локтевой вены, выделение лейкомассы из периферической крови, выделение из полученных клеток РНК, проведение реакции обратной транскрипции для синтеза на матрице РНК копии кДНК и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Взятие венозной крови проводят общепринятым способом и транспортируют в пробирке с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) для предотвращения свертывания крови. Далее берут 5 мл крови и 1 мл 6% раствора декстрана, после чего пробирки с кровью и декстраном помещают в термостат под углом 45° и инкубируют 30 минут при температуре 37°С. После инкубации надосадочную жидкость (около 3 мл), содержащую лейкоциты, собирают в отдельные пробирки и отмывают от декстрана в среде 199 с солями Хенкса.

Для этого к 3 мл лейкомассы добавляют 1 мл питательной среды и ресуспензируют в ней клетки, потом центрифугируют 15 минут при 200g. Далее сливают надосадочную жидкость, а к осажденным клеткам снова добавляют 1 мл среды, ресуспензируют, центрифугируют 15 минут при 200g в центрифуге. Данную процедуру повторяют 2 раза. После последней отмывки к клеткам добавляют 1 мл среды 199.

Для выделения РНК из полученных лейкоцитов используют набор реактивов для выделения ДНК/РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля «АмплиПРАИМ Рибо-сорб» (ИнтерЛабСервис, РФ) строго в соответствии с протоколом. В пробирки на 1,5 мл вносят 450 мкл прогретого до 60°С лизирующего буфера и 100 мкл лейкомассы. Содержимое перемешивают и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 сек. В пробирку вносят 25 мкл ресуспензированного сорбента, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 секунд, после чего надосадочную жидкость удаляют. Затем в пробирки добавляют 400 мкл раствора для отмывки 1, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин 30 секунд и удаляют надосадочную жидкость. Далее добавляют 500 мкл раствора для отмывки 3, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин 30 секунд и удаляют надосадочную жидкость. Данную отмывку производят дважды. Потом в пробирку вносят 400 мкл раствора для отмывки 4, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин 30 секунд, удаляют надосадочную жидкость. Осадившийся в пробирках сорбент подсушивают в термостате при температуре 60°С 15 минут с открытыми крышками. Затем в пробирку вносят 50 мкл РНК-буфера, перемешивают и помещают в термостат на 3 минуты при температуре 60°С, потом снова перемешивают и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 1 минуты. Надосадочную жидкость переносят в отдельную пробирку, не захватывая сорбент, и хранят при -70°С.

В реакции обратной транскрипции (ОТ) используют 5 мкл РНК. ОТ проводят с использованием наборов реактивов для проведения реакции обратной транскрипции (Синтол, РФ) для синтеза кДНК на матрице РНК. Реакционная смесь содержит: 1 мкл праймера Random с концентрацией 0,5 ОЕ/мл (Синтол, РФ), 1 мкл праймера Oligo(dT) с концентрацией 15 ОЕ/мл (Синтол, РФ) и 3 мкл деионизированной воды. Проводят отжиг Random гексамеров и праймера Oligo(dT) на матрице мРНК при температуре 75°С в течение 3 минут. После этого в пробирку вносят 10 мкл 2,5х реакционной смеси, 1 мкл ревертазы MMLV-RT с концентрацией 50 ед/мкл при температуре +4°С и инкубируют 40 минут при температуре 37°С. Далее инактивацию ревертазы проводят при 95°С в течение 5 минут. Полученную кДНК хранят при -70°С.

В качестве контроля прохождения реакции ОТ и для стандартизации метода используют ПЦР-систему на определение экспрессии гена β-актина.

ПЦР в реальном времени ставят с использованием наборов реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол, РФ) и специфических праймеров. В готовую смесь добавляют 3 мкл кДНК, полученной при реакции ОТ. Условия прохождения ГЩР со специфическими праймерами к гену β-актина, гену TLR4, гену TLR9 и гену HBD1 были смоделированы с помощью программы VectorNTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК, опубликованными в базе данных Gene Bank. Отрицательным контролем служит проба с реакционной смесью, не содержащая мРНК. ПЦР в реальном времени проводят на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, РФ) по следующей схеме: денатурация - 95°С - 5 минут, отжиг и элонгация (94°С - 20 сек, 62°С - 40 сек) - 40 циклов. Полученные результаты анализируют с помощью программы, прилагающейся к прибору ДТ-96. Расчет количества копий кДНК гена β-актина, TLR4, TLR9 и HBD1 проводят относительно разработанных ранее калибровочных прямых. Количество копий кДНК гена HBD1 определяют относительно 1×10³ копий кДНК гена β-актина, а значение копий кДНК генов TLR4 и TLR9 - относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина.

В таблице приводится значение уровня экспрессии исследуемых генов при физиологическом течении гестации и при невынашивании беременности инфекционного генеза в I триместре. Данные представлены в виде: медиана (25%-75% квантили) относительно 1 млн копий гена β-актина для генов TLR4 и TLR9, относительно 1000 копий гена β-актина - для гена HBD1.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1

Беременная Ш., 25 лет. Наблюдается в женской консультации с диагнозом физиологически протекающая беременность, 8 недель. Данная беременность вторая, первая в 2011 г. закончилась срочными родами живой доношенной девочкой 3300 г, 51 см; menarche в 14 лет, установились сразу, по 5 дней, ч/з 30 дней, регулярные, умеренные, безболезненные. Гинекологические заболевания отрицает. Из анамнеза: в детстве - ветряная оспа. Результаты клинико-лабораторного обследования - в пределах нормы. АД - в пределах нормы. Соматических заболеваний не выявлено. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики - отрицательно. Было выполнено исследование (прогнозирование невынашивания беременности инфекционного генеза) по предлагаемому способу.

У данной пациентки число копий кДНК TLR4 составило 63 053 относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина; копий кДНК TLR9 - 20 777 относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина; число копий кДНК HBD1 - 9160 копий относительно 1×10³ копий кДНК гена β-актина.

Таким образом, у данной женщины с физиологическим течением беременности показатели экспрессии исследуемых генов находятся в пределах нормы. Невынашивания беременности не прогнозируется. Осложнений беременности в дальнейшем не выявлено.

Пример 2

Беременная, И. 27 лет, поступила в гинекологическое отделение 1ГКБ с диагнозом: Беременность 10-11 недель. Начавшийся самопроизвольный выкидыш. Предъявляла жалобы на тянущие боли внизу живота, кровяные выделения из половых путей. Из анамнеза: данная беременность вторая, на учете с 5-6 недели; первая беременность в 2013 г. закончилась самопроизвольным выкидышем на сроке 8-9 недель. Menarche в 15 лет, установились через 2 года, по 4 дня, ч/з 30 дней, регулярные, умеренные, безболезненные. В 2011 г. - лечение эктопии шейки матки методом криодеструкции. В 2012 - удаление кондиломы влагалища. Обследована на УТИ: обнаружен HPV 16⎪18, Herpes simplex. Из анамнеза: в детстве - краснуха, ветряная оспа; хронический гастродуоденит, хронический бронхит, хронический цистит. По результатам клинико-лабораторного обследования: снижение уровня АЛТ, ACT, креатенина; повышение уровня глюкозы; по УЗИ - Беременность 10 недель. Ретрохориальная гематома. Несмотря на терапию, направленную на пролонгирование беременности, через три дня после поступления пациентка отмечала усиление кровяных выделений, со сгустками, схваткообразные боли внизу живота, диагностирован аборт в ходу, произведено удаление остатков плодного яйца.

Количество копий кДНК TLR4 у данной пациентки составило 18 777 относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина; копий кДНК TLR9 - 1 570 относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина число копий кДНК HBD1 - 1431 относительно 1×10³ копий кДНК гена β-актина. Снижение уровня экспрессии генов TLR4, TLR9 и HBD-1 в 3.4, 11.8 и 4.5 раз соответственно.

Вывод: при сравнении полученных данных с показателями экспрессии исследуемых генов у женщин с физиологическим течением беременности можно сделать заключение о снижении показателей врожденного иммунитета у данной пациентки при наличии урогенитальной инфекции и прогнозировать развитие выкидыша на ранних сроках. В дальнейшем, через двое суток, у данной пациентки произошел выкидыш. Таким образом, наш прогноз был подтвержден.

Пример 3

Беременная, Н. 26 лет поступила в гинекологическое отделение 1ГКБ с диагнозом: Беременность 6-7 недель. Начавшийся самопроизвольный выкидыш. Предъявляла жалобы на тянущие боли внизу живота, кровяные выделения из половых путей. Из анамнеза: данная беременность вторая, на учете с 5-6 недель; первая беременность в 2012 г. закончилась самопроизвольным выкидышем на сроке 8-9 недель. Menarche (первая менструация) в 14 лет, установились через 2 года, по 4 дня, ч/з 30 дней, регулярные, умеренные, безболезненные. Обследована на УГИ: обнаружен CMV. Из анамнеза: в детстве - краснуха, ветряная оспа; хронический пиелонефрит. По УЗИ - беременность 6-7 недель. Гипертонус миометрия.

Несмотря на терапию, направленную на пролонгирование беременности, через два дня пациентка отмечала усиление схваткообразных болей внизу живота и кровяных выделений, со сгустками. Диагностирован аборт в ходу, произведено удаление остатков плодного яйца.

Количество копий кДНК TLR4 у данной пациентки составило 16 505 относительно 1×10⁶ копий к ДНК гена β-актина; копий кДНК TLR9 - 3676 относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина; число копий кДНК HBD1 - 1411 относительно 1×10 копий кДНК гена β-актина. Снижение уровня экспрессии генов TLR4, TLR9 и HBD-1 в 3.8, 5 и 4.5 раз соответственно.

Вывод: по сравнению с группой здоровых беременных женщин у пациентки Н. выявлено достоверное снижение показателей врожденного иммунитета при наличии урогенитальной инфекции. Было прогнозировано развитие выкидыша, который состоялся на 10 неделе гестации.

Пример 4

Беременная, З. 35 лет, поступила в гинекологическое отделение 1ГКБ с жалобами на головокружение, обильные кровяные выделения из половых путей, схваткообразные боли внизу живота. Выставлен диагноз: Аборт в ходу при беременности 9-10 недель. Привычное невынашивание. Произведено удаление остатков плодного яйца. Из анамнеза: беременность третья, протекала с угрозой прерывания, проводилась терапия, направленная на пролонгирование беременности (дюфастон, магнеВ6, валериана). В сроке 5-6 недель перенесла ОРВИ с повышением температуры до 37.2, лечилась народными средствами. Первая беременность в 2006 г. закончилась самопроизвольным выкидышем на сроке 8-9 недель. Вторая в 2007 г. - неразвивающаяся беременность на сроке 6-7 недель. Menarche в 13 лет, установились сразу, по 5 дней, ч/з 28 дней, регулярные, умеренные, безболезненные. Обследована на УГИ: обнаружена Ureaplasma urealiticum, лечение не проводилось. Из анамнеза: в детстве - краснуха, ветряная оспа; хронический тонзиллит.

Количество копий кДНК TLR4 у данной пациентки составило 6067 относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина; копий TLR9 - 4673 относительно 1×10⁶ копий кДНК гена β-актина; число копий кДНК HBD1 - 996 копий гена относительно 1×10³ копий кДНК гена β-актина. Снижение уровня экспрессии генов TLR4, TLR9 и HBD-1 в 10.4, 4 и 6.3 раз соответственно.

Вывод: у пациентки З. выявлено достоверное снижение показателей врожденного иммунитета по сравнению с группой здоровых беременных женщин. Был прогнозирован выкидыш. Данная беременность у пациентки прервалась на сроке гестации 12 недель.

В результате проведенных исследований по оценке показателей врожденного иммунитета в группе 18 беременных с угрозой прерывания беременности, мы прогнозируем развитие выкидыша с вероятностью 66,6%. Кроме того, 80% всех установленных выкидышей произошло на сроке 5-7 и 10-11 недель.

Таким образом, данный способ удобен и прост в применении, достаточно информативен и имеет высокую достоверность прогноза невынашивания беременности инфекционного генеза ранних сроков гестации. Заявленное изобретение позволяет решать важную практическую задачу раннего прогнозирования угрозы невынашивания беременности в I триместре, что важно в практическом отношении и основано на конкретных показателях. Использование данного способа будет способствовать более быстрой и безопасной диагностики угрозы прерывания беременности инфекционного генеза в I триместре.

Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации, отличающийся тем, что в лейкоцитах периферической крови беременной на 5-11 неделе гестации с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяют уровень экспрессии генов Toll-подобных рецепторов TLR4 и TLR9, гена противомикробного пептида HBD1 и при одновременном снижении уровней экспрессии указанных генов, по меньшей мере, в 2,5 раза по сравнению с их уровнем, установленным при физиологически протекающей беременности, прогнозируют выкидыш в первом триместре гестации.