Селективная элиминация эрозийных клеток

Селективная элиминация эрозийных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение относится к лечению эрозии кости и разрушения хряща. В частности, к лечению заболеваний с разрушением костной и хрящевой ткани с использованием биологических препаратов, таких как, например, антитела.

Уровень техники

Натуральные киллеры (NK) представляют собой лимфоциты, происходящие из костного мозга, которые необходимы для защиты организма хозяина от некоторых инфекций и опухолей. После активации они быстро продуцируют ряд цитокинов и могут опосредовать цитотоксические ответы против инфицированных, поврежденных или онкогенных клеток. Роль NK-клеток в хронических воспалительных заболеваниях исследуется, и становится все более понятным, что NK-клетки могут играть важную роль в модуляции Т и В-клеточных ответов через их способность содействовать дифференцировке и созреванию дендритных клеток (DC) и последующей поляризации Т-клеточных ответов (см., например, Cooper et al. (2004) Trends Immunol. 25: 47-52; Zhang et al. (2007) Blood Oct 1; 110(7):2484-93). Кроме того, исследования показали, что NK-клетки обладают способностью непосредственно элиминировать субпопуляции активированных Т-клеток с помощью клеточно-опосредованных цитотоксических реакций (Lu et al. (2007) Immunity. 26: 593-604). Активность NK-клеток регулируется сложным механизмом, в который вовлечены и активирующие, и ингибиторные сигналы (см., например, Moretta et al. (2001) Annu Rev Immunol 19:197-223; Moretta et al. (2003) EMBOj EPub Dec 18; Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89; Zambello et al. (2003) Blood 102:1797-805; Moretta et al: (1997) Curr Opin Immunol 9:694-

Было идентифицировано несколько различных NK-специфических рецепторов, которые участвуют в опосредованном NK-клетками распознавании и уничтожении клеток-мишеней, дефицитных по HLA класса I. Одним важным ингибиторным рецептором NK-клеток является CD94/NKG2A, который взаимодействуете неклассической МНС-молекулой класса I HLA-E (см., например, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Lee et al. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance et al. (2002) PNAS 99:868-873; Brooks et al. (199) J Immunol 162:305-313; Miller et al. (2003) J Immunol 171:1369-75; Brooks et al. (1997) J Esp Med 185:795-800; Van Beneden et al. (2001) 4302-4311; патентные заявки US 20030095965).

CD94/NKG2A является ингибиторным рецептором, который находится на субпопуляциях NK-, NKT- и Т-клеток, что ограничивает уничтожение ими клеток, экспрессирующих С094/ NKG2A-лиганд HLA-E, несущий небольшие пептиды, обычно полученные из лидерной последовательности других молекул МНС класса 1 (см., например, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799).

В данной области были описаны различные антитела против NKG2A. Например, Sivori et al. (Eur j Immunol 1996:26:2487) относится к мышиному анти-NKG2A-антителу Z270; Carretero et al. (J Exp Med 1999:190:1801-12) относится к крысиному противомышиному NKG2A-aHTHTeny 20D5; патентная заявка США, опубликованная как US20030095965, описывает мышиное антитело 3S9, которое связывается с NKG2A, NKG2C и NKG2E, патентная заявка WO 06070286 раскрывает моноклональные антитела против NKG2A, а патентная заявка WO 2008/009545 описывает гуманизированное антитело humZ270 и другие анти-NKG2A-aHTHTena с вариабельной тяжелой цепью и/или вариабельной легкой цепью, практически идентичной таковым в Z270.

Краткое описание

Ревматоидный артрит (RA) является хроническим воспалительным заболеванием, при котором активация медиаторов воспаления, производимых несколькими клеточными субпопуляциями, в конечном итоге приводит к разрушению суставного хряща и кости. Принято считать, что основными клеточными субпопуляциями, ответственными за деструкцию хрящевой и костной ткани при RA, являются фибробластоподобные синовиоциты (FLS) и остеокласты, соответственно. Экспрессирующие CD94-NKG2A Т-клетки и NK-клетки могут подавлять воспаление, уничтожая активированные провоспалительные клетки. Активацию этих клеток можно получить с помощью ряда различных клеток и молекул, включая макрофаги, активированные CD4⁺-T-клетки и В-клетки/плазматические клетки. Тем не менее, эта регуляторная противовоспалительная активность подавляется, когда CD94-NKG2A-penenTopbi заняты их HLA-E-лигандом на поверхности провоспалительных клеток. Блокируя CD94-NKG2A-penenTopbi и предотвращая их ингибиторный сигналинг, NNC141-0100 усиливает противовоспалительные активности регуляторных CD94-NKG2A⁺-Т-клеток и NK-клеток, повышая их способность элиминировать, например, активированные провоспалительные CD4⁺-T-клетки и фибробластоподобные синовиоциты (FLS). Терапия, которая специфически элиминирует агрессивные эрозирующие хрящ FLS и подавляет образование костных эрозийных остеокластов, не влияя при этом на остальные клетки, может иметь существенное преимущество по сравнению с текущей терапией RA и потенциально также может использоваться для лечения пациентов с остеоартритом (ОА) и псориатическим артритом (PsA).

Это изобретение описывает, как анти-NKG2A-антитело ослабляет два основных патогенных пути при RA, т.е. эрозию кости и хряща, благодаря его способности уменьшать образование разрушающих кость остеокластов и благодаря селективно повышенной элиминации разрушающих хрящ FLS, соответственно.

Существующие терапевтические средства, направленные на RA, воздействуют непосредственно на отдельные компоненты воспалительного каскада, и их эффективность в отношении костной эрозии вторична по отношению к их противовоспалительному эффекту. Анти-NKG2A-МКА способны ингибировать связывание HLA-E или неконкурентно могут блокировать функцию CD94/NKG2A и стимулировать эндогенный иммунно-регуляторный механизм NK-клеток, вызывая селективную элиминацию клеток, которые способствуют деградации хряща, эрозии кости и сокращению цитокина IL-6, который, как известно, способствует воспалению. Таким образом, терапевтическое лечение анти-NKG2A-МКА может напрямую влиять на патогенез в заболеваниях, характеризующихся костной эрозией или деструкцией хряща.

Данное изобретение раскрывает применение анти-NKG2A-антитела или его фрагмента, способного лечить разрушение хряща и/или эрозию кости.

Данное изобретение раскрывает применение анти-NKG2A-антитела для лечения заболевания или нарушения, которое характеризуется разрушением хряща и/или эрозией кости.

Данное изобретение раскрывает применение анти-NKG2A-антитела для лечения деструкции хряща и/или эрозии кости, где анти-NKG2A-антитело стимулирует селективное удаление активированных клеток, которые способствуют разрушению хряща или эрозии кости. В одном воплощении данного изобретения клетки, разрушающие хрящ, являются фибробластоподобными синовиоцитами (FLS). В одном воплощении клетки, вызывающие эрозию кости, являются эрозийными остеокластами.

Данное изобретение раскрывает применение анти-NKG2A-антитела для лечения заболевания или нарушения, которое характеризуется разрушением хряща и/или эрозией кости, где анти-NKG2A-антитело стимулирует селективное удаление активированных клеток, которые способствуют разрушению хряща или эрозии кости. В одном воплощении данного изобретения клетки, разрушающие хрящ, являются фибробластоподобными синовиоцитами (FLS). В одном воплощении клетки, вызывающие эрозию кости, являются эрозийными остеокластами.

NKG2A-антитела, используемые в данном изобретении, могут быть любыми подходящими анти-NKG2A-антителами. В одном воплощении антитело представляет собой моноклональное анти-NKG2A-антитело. В одном воплощении антитело является гуманизированным анти-NKG2A-антителом. В одном воплощении антитело представляет собой полностью человеческое анти-NKG2A-антитело. В одном воплощении антитело представляет собой анти-NKG2A-антитело, описанное в WO 2008/009545. В одном воплощении моноклональное анти-NKG2A-антитело представляет собой humZ270, описанное в патентной публикации WO 2008/009545. В одном воплощении анти-NKG2A-антитело представляет собой моноклональное анти-NKG2A-антитело, описанное в патентной публикации WO 09092805. В одном воплощении анти-NKG2A-антитело представляет собой humZ199, описанное в патентной публикации WO 09092805.

(Краткое описание графических материалов)

Фиг.1 показывает профиль экспрессии группы молекул клеточной поверхности, экспрессированных созданными in vitro фибробластоподобными синовиоцитами, полученными из синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом (RA).

- Фиг.1А. показывает, что фибробластоподобные синовиоциты (FLS), полученные от пациентов RA, экспрессируют CD55 (правая накладывающаяся гистограмма), но не имеют CD68 (левая накладывающаяся гистограмма).

- Фиг.1 В. показывает, что клеточная поверхность RA-FLS экспрессирует несколько лигандов для активации NK-клеточных рецепторов (например, MICA, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ICAM1, CD155, CD48), как указывает ниже каждая накладывающаяся гистограмма. Как показано, RA-FLS эффективно красятся гибридным NKp44-FC, подтверждая, что RA-FLS экспрессируют предполагаемый лиганд для МКр44.

- - Фиг.1C. показывает, что антитело против МКр44 дозозависимым образом предотвращает связывание растворимого гибридного МКр44-Рс-белка на RA-FLS, подтверждая, что RA-FLS экспрессируют лиганд, способный взаимодействовать с МКр44-рецептором.

- Фиг.1D. показывает, что RA-FLS экспрессируют лиганды МНС класса I HLA-E и HLA-G, которые, как известно, распознаются NK-клеточными рецепторами (например CD94/NKG2A и LIR-1, соответственно).

- Фиг.1Е. показывает, что RA-FLS экспрессируют рецептор смерти 5 (DR5), но не DR4, которые известны как рецепторы, которые связывают TRAIL.

Фиг.2 показывает,.что NKG2A-экспрессирующие NK-клетки присутствуют в синовиальной оболочке RA и могут быть найдены в областях, содержащих RA-FLS, экспрессирующие HLA-E.

- Фиг.2А показывает синовиальные ткани RA, окрашенные антителом против человеческого NKp46. Темные окрашенные области являются NKp46-экспрессирующими клетками.

- Фиг.2В показывает прилегающий срез той же ткани, окрашенный антителом против человеческого NKG2A. Темные окрашенные области являются МКС2А-экспрессирующими клетками.

- Фиг.2С показывает срез прилегающей ткани, окрашенный изотипическим контрольным антителом.

- Фиг.2D показывает частоту NKG2A⁺-клеток/мм2 синовиальной ткани на графике против частоты NKp46⁺-клеток/мм2 синовиальной ткани при оценке путем количественного цифрового анализа изображений. Данные показывают, что большинство NKG2A⁺-клеток являются NK-клетками в воспаленной синовиальной ткани RA.

- Фиг.2Е показывает синовиальную ткань RA, окрашенную анти-HLA-E-антителом. Клетки в синовиальной оболочке, в том числе RA-FLS, экспрессируют HLA-E. Стрелка указывает на область темно окрашенных FLS-подобных клеток синовиальной оболочки, экспрессирующих HLA-E.

- Фиг.2F показывает, что инфильтрирующие иммунные клетки в синовиальной подложке экспрессируют HLA-E.

- Фиг.2G показывает синовиальную ткань RA, окрашенную изотипическим контрольным антителом.

- Фиг.2Н показывает, что эндотелиальные клетки сосудов экспрессируют HLA-E.

- Фиг.3 показывает, что NK-клетки, в том числе синовиальные NK-клетки, полученные от пациентов с RA, экспрессируют панель активирующих рецепторов, которые, как известно, связываются с лигандами, которые экспрессированы на RA-FLS.

Фиг.3А:

- Фиг.3А (i) показывает экспрессию NK-клеточного рецептора на гейтированных NK-клетках, полученных из SFMC репрезентативного пациента с RA. Синовиальные NK-клетки экспрессируют NKG2D, MKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2 В4, LFA-1 и TRAIL, но не экспрессируют или экспрессируют на очень низком уровне NKG2C, как указано в незаштрихованных накладывающаяся гистограммах.

- Фиг.3А (ii) показывает оставшиеся CD56-яркие NK-клетки полученные из РВМС репрезентативного здорового донора. CD56 яркие NK-клетки экспрессируют NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2 В4, LFA-1, и TRAIL, но не экспрессируют или экспрессируют на очень низком уровне NKG2C, как указано в незаштрихованных накладывающаяся гистограммах.

- Фиг.3А (iii) показывает Nishi NK-клетки. Nishi NK-клетки экспрессируют NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2В4, LFA-1, и TRAIL, но не экспрессируют или экспрессируют на очень низком уровне NKG2C, как указано в незаштрихованных накладывающаяся гистограммах.

- Фиг.3В показывает, что NK-клетки элиминируют прикрепленные RA-FLS in vitro:

- Фиг.3В (i) показывает, что NK-клетки, совместно культивированные с RA-FLS в течение ночи, приводят к элиминации прикрепленных RA-FLS дозозависимым образом.

- Фиг.3В (ii) показывает область лунок, покрытых прикрепленными RA-FLS при культивировании в одиночку или при совместном культивировании со сниженным числом NK-клеток в течение ночи, при анализе путем Immunospot image.

- Фиг.3С показывает, что в соответствии с измерением экспрессии CD107 а/b клеточной поверхности NK-клетки дегранулируют при совместном культивировании с RA-FLS, но не дегранулируют при культивировании в одиночку, что доказывает, что NK-клетки активно уничтожают RA-FLS.

- Фиг.3D показывает, что маскировка NKG2D, NKp44, NKp46, DNAM-1 или TRAIL, экспрессированных NK-клетками, приводит к значительному снижению уничтожения RA-FLS, что измеряется экспрессией CD107a/b на клеточной поверхности эффекторных NK-клеток.

Фиг.4 показывает, что RA-FLS защищены от цитотоксичности, опосредованной NK-клетками, путем экспрессии HLA-E, способного при лигировании ингибировать NK-клеточные рецепторы CD94-NKG2A.

- Фиг.4А показывает, что синовиальные NK-клетки RA (верхняя панель), здоровые PB-NK-клетки CD56bright (средняя панель) и NK-клетки Nishi (нижняя панель) экспрессируют на клеточной поверхности NKG2A (слева), но не имеют KIR (справа). Кроме того, Nishi-клетки экспрессируют LIR1 (средняя панель), а синовиальные NK-клетки или NK-клетки CD56bright его не экспрессируют.

- Фиг.4В показывает увеличение дегрануляции NK-клеток в соответствии с измерением экспрессии CD107 а/b клеточной поверхности при совместном культивировании с RA-FLS в присутствии анти-NKG2A (правая панель), но не в присутствии анти-LIRI (левая панель).

- Фиг.4С показывает повышенное удаление прикрепленных RA-FLS, зависимое от NK-клеток, при обработке анти-NKG2A (правое изображение) по сравнению с обработкой изотипическим контролем (среднее изображение). RA-FLS, культивированные в отсутствие NK-клеток, показаны на левом изображении.

- Фиг.4D показывает, что синовиальные NK-клетки дегранулируют при совместном культивировании с аутологичными RA-FLS (14%, вверху слева), и что маскировка NKG2A приводит к увеличению дегрануляции (44%, вверху справа). Аутологичные CD3* CD8⁺ Т-клетки значительно не дегранулируют при совместном культивировании с аутологичными RA-FLS в отсутствие анти-NKG2A (т.е. культуры, обработанные изотипическим контролем, внизу слева) или в присутствии анти-NKG2A (внизу справа).

- Фиг.4Е показывает, что недавно выделенные и нестимулированные РВ-NK-клетки CD56bright от здоровых доноров дегранулируют при совместном культивировании с RA-FLS в присутствии анти-NKG2A, но минимально при обработке изотипическим контрольным антителом. Верхняя панель показывает репрезентативный пример, а нижний график показывает % экспрессии CD107a/b на 5 отдельных донорских NK-клетках CD56bright, культивируемых совместно с RA-FLS в присутствии изотипа в сравнении с анти-NKG2A.

Фиг.5А показывает, что блокирование NKG2A с помощью NNC141-0100 (humZ270) приводит к повышенной элиминации RA-FLS, опосредованной NK-клетками, измеренной в анализе высвобождения ЛДГ. Эффекторные NKL-клетки показаны слева, а NK-клетки Nishi показаны справа от репрезентативной клетки-мишени RA-FLS.

Фиг.5В показывает, что блокирование NKG2A с помощью NNC14-0100 (humZ270) приводит к повышенному лизису репрезентативных RA-FLS (RA-FLS2), но не влияет на элиминацию клеточной линии нормальных фибробластов крайней плоти (FSK4).

Фиг.6 показывает, что NNC14-0100 (humZ270) ингибирует образование многоядерных остеокластов TRAP⁺:

- Фиг.6А показывает репрезентативный пример RA-SFMC, культивированных в течение 7 дней в присутствии изотипа humlgG4. Можно видеть несколько крупных многоядерных клеток TRAP⁺.

- Фиг.6В показывает, что обработка humZ270 приводит к резкому снижению числа крупных многоядерных клеток TRAP⁺.

- Фиг.6С показывает образование остеокластов в SFMC, полученных от пациентов с RA, культивируемых в среде или IL-15 в присутствии изотипического контроля, в сравнении с анти-NGC2A (humZ270, NNC14-0100), как указано. Маскировка NKG2A в культурах, стимулированных IL-15, приводит к снижению числа многоядерных клеток TRAP⁺.

- Фиг.6D показывает, что формирование остеокластов, вызывающих эрозию минералов кости, в SFMC, полученных от пациентов с RA, подавляется обработкой NNC14-0100. Показан репрезентативный пример эрозии минералов кости, наблюдаемый в культуре SFMC от пациента с RA №2357. SFMC выращивали на остеологических дисках в присутствии IL-15 и изотипического МКА (слева) в сравнении с анти-NKG2A (humZ270, справа). Диски окрашивали методикой фон Косса, и эродированные области анализировали с использованием ImmunoSpot S5 Analyzer и представляли белыми на темном фоне.

- Фиг.6Е. SFMC, полученные от пациентов с RA (n=5) культивировали в среде, дополненной 10 нг/мл IL-15. В начале анализа к культурам добавляли 20 мкг/мл человеческого изотипа IgG4 (белый столбец) или 20 мкг/мл NNC14-0100 (humZ270, черный столбец). С помощью ImmunoSpot S5 Analyzer количественно оценивали средний процент +/-SEM эродированной площади диска.

- Фиг.6F показывает, что HumZ270 подавляет эрозию минералов кости в культурах эксплантов синовиальной ткани RA. Фигура показывает пример, в котором стружку синовиальной ткани RA выращивали в трех лунках на костных минеральных дисках в присутствии только среды (контроль, вверху), изотипического контроля (второй сверху), инфликсимаба (IFX, третий сверху) или анти-NKG2A (humZ270, снизу). Светлые области представляют эрозию минералов кости.

- Фиг.6G показывает наблюдаемый процент эрозии минералов кости, определенный с помощью анализа с использованием ImmunoSpot.

Фиг.7:

- Фиг.7А. показывает модуляцию уровней цитокинов, измеренных через 24 часа в культурах SFMC in vitro, при обработке humZ270 (NNC14-0100, темно-серые столбцы) по сравнению с изотипическим контролем (светло-серые столбцы). При маскировке NKG2A наблюдается значительное снижение уровней IL6. Кроме того, наблюдается небольшое увеличение M-CSF.

- Фиг.7В показывает попарное сравнение уровней IL-6, полученных в присутствии анти-NKG2A (NNC14-0100, humZ270), в сравнении с изотипическим контролем в культурах RA-SFMC (n=11).

- Фиг.7С показывает, что анти-NKG2A ингибирует как базальную (т.е. только со средой), так и IL-15-стимулированную продукцию IL-6 в культурах SFMC ex vivo, полученных от пациентов с RA. Показаны средние значения и SD от двух репрезентативных пациентов с RA.

Фиг.8 показывает, что NK-клетки, присутствующие в синовиальной ткани RA, экспрессируют ингибиторный рецептор NKG2A и локализованы преимущественно в лимфоидных агрегатах, прилегающих к синовиоцитам, которые экспрессируют HLA-E, лиганд для CD94-NKG2A.

- 8А показывает синовиальную ткань RA от ID 1144-09, окрашенную на NK-клетки анти-NKp46-антителом.

- 8В показывает синовиальную ткань RA от ID 1591-08, окрашенную на NK-клетки анти-NKp46-антителом.

- 8С показывает синовиальную ткань RA от ID 1144-09, окрашенную на NKG2A Z199-антителом (анти-NKG2A-антителом).

- 8D показывает синовиальную ткань RA от ID 1591-08, окрашенную на NKG2A Z199-антителом (анти-NKG2A-антителом).

- 8Е показывает синовиальную ткань RA от ID 1144-09, окрашенную на HLA-Е 3D12-антителом.

- 8F показывает синовиальную ткань RA от ID 1591-08, окрашенную на HLA-Е 3D12-антителом.

- 8G показывает синовиальную ткань RA от ID 1144-09, окрашенную на Т-клетки анти-CDS-антителом.

- 8Н показывает синовиальную ткань RA от ID 1591-08, окрашенную на Т-клетки анти-CDS-антителом.

- 8I показывает синовиальную ткань RA от ID 1144-09, окрашенную изотипическим контрольным антителом IgG2b.

- 8J показывает синовиальную ткань RA от ID 1591-08, окрашенную изотипическим контрольным антителом IgG2b.

- 8K показывает фотографии высокого увеличения NKp46⁺ NK-клеток от ID 1595-08.

- 8L показывает фотографии высокого увеличения NKG2A⁺-клеток от ID 1595-08.

- 8М показывает цифровой анализ изображения для корреляции числа NKG2A⁺-клеток в синовиальной оболочке от 15 пациентов с RA и числа NKp46⁺NK-клеток.

Фиг.9 показывает, что NKG2A и его лиганд, HLA-E, экспрессированы в синовиальной оболочке у пациентов с остеоартритом (ОА).

- 9А изображает NKG2A⁺-клетки (Z199-антитело) среди инфильтрирующих лимфоцитов.

- 9В изображает экспрессию HLA-E (3D12-aHTHTeno) инфильтрирующими иммунными клетками, эндотелиальными клетками и синовиоцитами.

- 9С показывает цифровой анализ изображения для корреляции частоты NKG2A⁺-клеток с частотой NK-клеток в синовиальной оболочке пациентов с ОА.

Фиг.10 показывает, что лиганд CD94-NKG2A экспрессируется в воспаленной синовиальной оболочки не только у пациентов с RA и ОА, но также у пациентов с PsA.

- 10А изображает окрашивание образцов синовиальной ткани от пациента с RA.

- 10В изображает окрашивание образцов синовиальной ткани от пациента с PsA.

- 10С изображает окрашивание образцов синовиальной ткани от пациента с RO (ОА????)

- 10D изображает окрашивание образцов синовиальной ткани от нормального контроля.

Фиг.11 показывает аминокислотную последовательность:

- 11А: SEQ ID №1; humNKG2A,

- 11В: SEQ ID №2; вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела humZ270,

- 11С: SEQ ID №3; вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела humZ270,

- 11D; SEQ ID №4; вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела humZ199,

- 11Е: SEQ ID №5; вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела humZ199.

Подробное описание изобретения

Термин «антитело», используемый в данном документе, относится к полипептиду, полученному из зародышевой последовательности иммуноглобулина. Этот термин включает полноразмерные антитела и их любые антигенсвязывающие фрагменты или одиночные цепи. Термины «антитело», «моноклональное антитело» и «МКА», используемые в данном документе, используются для обозначения молекул иммуноглобулина и их фрагментов, которые обладают способностью специфически связываться с антигеном. Подкласс иммуноглобулинов, представляющий конкретный фармацевтический интерес, принадлежит семейству IgG, которое может быть поделено на изотипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Молекулы IgG состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой двумя или несколькими дисульфидными связями, и двух легких цепей, каждая из которых присоединена к тяжелой цепи дисульфидной связью. Тяжелая цепь IgG состоит из четырех Ig-доменов, в том числе вариабельного домена (VH) и трех константных доменов (СН1, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. VH- и VL-области могут быть разделены на участки гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые чередуются с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Константные области антител могут опосредовать связывание антитела с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками), Fc-рецепторами (FcR) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Связывание с FcR и C1q может опосредовать такие эффекты как ADCC или CDC.

Антитело изобретения может быть любым NKG2A-связывающим антителом, антителом humZ270 (SEQ ID №2 и SEQ ID №3) или антителом humZ199 (SEQ ID №4 и SEQ ID №5) или любым другим антителом изобретения или вариантом любого из этих антител.

Термин «гуманизированное Z270» или «humZ270» или «hZ270», используемый в данном документе, включает антитело, раскрытое в патентной заявке WO 08009545, включенной в данный документ посредством ссылки. Термин «гуманизированное Z199» или «humZ199», используемый в данном документе, включает антитело, раскрытое в патентной публикации W009092805, включенной в данный документ посредством ссылки.

Используемый в данном документе термин «антитело» включает антитело или его фрагмент, который специфически связывается с соответствующим антигеном. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают Fab, Fabʺ, F(ab)₂, F(ab')₂, F(ab)S, Fv (как правило, VL- и VH-домены одной ветви антитела), одноцепочечный Fv (scFv; см., например, Bird et al., Science 1988; 242:428-426; и Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (как правило, VH- и СН1-домен) и dAb (как правило, VH-домен); VH-, VL-, VhH- и V-NAR-домены; моновалентные молекулы, содержащие одиночную VH- и одиночную VL-цепи; миниантитела, двух-, трех-, четырехвалентные антитела и каппа-антитела (см., например, III et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); верблюжий IgG; IgNAR; а также один или более чем один изолированный CDR или функциональный паратоп, где изолированные CDR или антигенсвязывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны друг с другом с тем, чтобы сформировать функциональный фрагмент антитела. Различные типы фрагментов антитела были описаны и рассмотрены, например, в Holligerand Hudson, Nat Biotechnol 2005:23, 1126-1136; WO 2005040219, и в опубликованных патентных заявках США 20050238646 и 20020161201.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к одному или более чем одному из фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, например с NKG2A или с другим белком-мишенью, описанным в данном документе. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть выполнена фрагментом полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают Fab-фрагмент, F(ab’)₂-фрагмент, Fab'-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, dAb-фрагмент и выделенную область, определяющую комплементарность (CDR). Одноцепочечные антитела, такие как scFv, и антитела тяжелой цепи, такие как VHH, и однодоменные верблюжьи антитела также могут быть охвачены термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Эти фрагменты антител могут быть получены с помощью обычных методик, известных специалистам в данной области, и фрагменты могут быть оценены на полезность тем же образом, что и интактные антитела.

«Fab»-фрагмент включает вариабельный домен и константный домен легкой цепи и вариабельный домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагмент включает одну или более чем одну цистеиновую карбокси-концевую связь с тяжелой или легкой цепями. F(ab')₂-фрагменты антитела содержат пару Fab-фрагментов, которые, как правило, ковалентно связаны вблизи их карбокси-концов шарнирными цистеинами. Другие химические связи фрагментов антитела также известны в данной области. Fab-фрагмент сохраняет способность родительского антитела связываться с его антигеном, потенциально с более низкой аффинностью. F(ab')₂-фрагменты способны к двухвалентному связыванию, тогда как Fab-фрагменты могут связываться только моновалентно. Как правило, Fab-фрагменты лишены константных СН2- и СН3-доменов, т.е. Fc-части, где будет происходить взаимодействие с Fc-рецепторами. Таким образом, Fab-фрагменты, как правило, лишены эффекторных функций.

«Fv»-фрагмент представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт, распознающий и связывающий антиген, и, как правило, содержит димер вариабельных доменов одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной ассоциации, которые могут быть ковалентными в природе, например, в одноцепочечном фрагменте вариабельного домена (scFv). Именно в этой конфигурации три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. Совместно шесть гипервариабельных областей или их подгруппа придают антителу специфичность связывания с антигеном. Тем не менее, даже одиночный вариабельный домен, содержащий только три гипервариабельные области, специфичные к антигену, обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания (Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996). Например, природные верблюжьи антитела, которые имеют только вариабельный домен тяжелой цепи (VHH), могут связывать антиген (Desmyteret al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655).

«Одноцепочечные Fv» или «scFv»-фрагменты антитела включают VH- и VL-домены антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, Fv-полипептид также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см. Pluckthun, 1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315.

Термин «двухвалентные антитела» относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же полипептидной цепи (VH и VL). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание двух вариабельных доменов на одной и той же цепи, вариабельные домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, создавая два антигенсвязывающих сайта. Двухвалентные антитела более подробно описаны, например, в ЕР 404097, WO 93/11161 и Hollingeretal., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448.

Выражение «линейные антитела» относится к антителам, которые описаны в Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8(10):1057-1062. Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных Fd-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

Термин «моноантитело», используемый в данном документе, относится к антигенсвязывающей молекуле с вариабельным доменом тяжелой цепи и без вариабельного домена легкой цепи. Моноантитело может связываться с антигеном в отсутствие легких цепей и, как правило, имеет три гипервариабельные области, например CDR, обозначенные как CDRH1, CDRH2 и CDRH3. Моноантитело с тяжелой цепью IgG имеет две антигенсвязывающие молекулы тяжелой цепи, связанные дисульфидной связью. Вариабельный домен тяжелой цепи содержит одну или более чем одну гипервариабельную область, предпочтительно CDRH3-или HVL-Н3-область.

Термин «гипервариабельная область», используемый в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность», или «CDR» (определенные последовательностью в виде остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), и/или эти остатки из «гипервариабельной петли» (с определенной структурой и отличающейся для каждого антитела; см., например, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987:196:901-917). В одном примере HVL-остатки могут включать 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи.

Фрагменты антител могут быть получены с использованием обычных рекомбинантных методик или методик белковой инженерии, и фрагменты могут быть подвергнуты скринингу на связывание с NKG2A или на другую функцию, таким же образом, как интактные антитела.

Фрагменты антител изобретения могут быть получены путем усечения, например, путем удаления одной или более чем одной аминокислоты с N- и/или С-конца полипептида. Фрагменты также могут быть сформированы путем одной или более чем одной внутренней делеции.

Антитело изобретения может представлять собой или может содержать фрагмент любого анти-NKG2A-антитела, антитело humZ270 (SEQ ID №2 и SEQ ID №3) или антитело humZ199 (SEQ ID №4 и SEQ ID №5) или любое другое антитело изобретения или вариант любого из этих антител. Антитело изобретения может представлять собой или может содержать антигенсвязывающую часть одного из этих антител или их вариантов. Например, антитело изобретения может быть Fab-фрагментом одного из этих антител или их вариантов, или оно может быть одноцепочечным антителом, полученным из одного из этих антител или их вариантов.

Антитело изобретения может быть человеческим антителом или гуманизированным антителом. Термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых и каркасная область, и CDR-области получены из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область также получена из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Человеческие антитела изобретения могут включать аминокислотные остатки, не закодированные человеческими иммуноглобулиновыми зародышевыми последовательностями (например, мутации, введенные случайно или путем сайт-специфического мутагенеза in vitro или путем соматических мутаций in vivo). Тем не менее, термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, не включает антитела, в которых CDR-последовательности, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты в человеческие каркасные последовательности.

Такое человеческое антитело может быть человеческим моноклональным антителом. Такое человеческое моноклональное антитело может быть получено с помощью гибридомы, которая содержит В-клетку, полученную из трансгенного животного, отличного от человека, например, из трансгенной мыши, имеющей геном с человеческим трансгеном тяжелой цепи и трансгеном легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.

Человеческие антитела могут быть выделены из библиотек последовательностей, построенных на подборке человеческих зародышевых последовательностей, также диверсифицированных с разнообразием природных и синтетических последовательностей.

Человеческие антитела могут быть получены путем in vitro иммунизации лимфоцитов человека с последующей трансформацией лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр.

Термин «производные человеческого антитела» относится к любой модифицированной форме человеческого антитела, например к конъюгату антитела и другому агенту или антителу.

Термин «гуманизированное антитело», используемый в данном документе, относится к химерному антителу человек/нечеловек, которое содержит минимальную последовательность (CDR-области), полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Таким образом, гуманизированное антитело является человеческим иммуноглобулином (реципиентное антитело), в котором остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области нечеловеческого вида (донорное антитело), например мыши, крысы, кролика или примата, с нужной специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях FR-остатки человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Примером такой модификации является введение одной или более чем одной так называемой обратной мутации.

Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего уточнения характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного или, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таковым в нечеловеческом иммуноглобулине, и все или практически все FR-остатки принадлежат человеческой иммуноглобулиновой последовательности. Гуманизированное антитело, возможно, может также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина.

Термин «химерное антитело», используемый в данном документе, относится к антителу, в котором гены легкой и тяжелой цепей были сконструированы, как правило, путем генной инженерии, из генов вариабельных и константных областей иммуноглобулинов, происходящих из различных видов. Например, вариабельные сегменты генов из моноклонального мышиного антитела могут быть соединены с константными сегментами человека.

Кристаллизуемый фрагмент («Fc-область»/«Fc-домен») антитела представляет собой «хвостовую» область антитела, включающую константные СН2- и СН3-домены. Fc-домен может взаимодействовать с рецепторами клеточной поверхности, называемыми Fc-рецепторами, а также с некоторыми белками системы комплемента. Fc-область позволяет антителам активировать иммунную систему. В одном аспекте данного изобретения антитела могут быть сконструированы так, чтобы они включали модификации в пределах Fc-области, как правило, для изменения одного или более чем одного функционального свойства, такого как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, Fc-рецепторное связывание, стабильность белка и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность, или отсутствие таковых. Кроме того, антитело изобретения может быть химически модифицировано (например, к антителу может быть присоединена одна или более чем одна химическая группировка) или модифицировано для изменения его гликозилирования, снова для изменения одного или бо