Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс полимерного носителя и переносимого вещества и по меньшей мере один белковый или пептидный антиген

Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс полимерного носителя и переносимого вещества и по меньшей мере один белковый или пептидный антиген

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей комплекс полимерного носителя и переносимого вещества и по меньшей мере один антиген. Комплекс полимерного носителя и переносимого вещества предпочтительно содержит носитель и переносимое вещество, при этом носитель представляет собой поперечно сшитый дисульфидом катионный компонент, а переносимое вещество - по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты. По меньшей мере один антиген предпочтительно выбран из антигена, полученного из патогена, ассоциированного с инфекционной болезнью, антигена, ассоциированного с аллергией или аллергическим заболеванием, антигена, ассоциированного с аутоиммунным заболеванием, или антигена, ассоциированного с раком или опухолевым заболеванием, или в каждом случае из фрагмента, варианта и/или производного указанного антигена. Такая фармацевтическая композиция согласно изобретению может представлять собой, например, вакцину, в которой комплекс полимерного носителя и переносимого вещества может служить в качестве адъюванта для поддержания иммунного ответа на антиген. Соответственно, такая фармацевтическая композиция позволяет эффективно индуцировать адаптивный иммунный ответ, направленный против по меньшей мере одного антигена, входящего в состав такой композиции, в частности, иммунного ответа со сдвигом в сторону Th1.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к наборам или наборам частей, содержащим компоненты фармацевтической композиции согласно изобретению, а также к применению фармацевтической композиции согласно изобретению или набора или набора частей согласно изобретению в качестве вакцины, в частности, для лечения инфекционных болезней, аллергии, аутоиммунных заболеваний и опухолевых или раковых заболеваний. Кроме того, изобретение относится к: (a) комплексу полимерного носителя и переносимого вещества для применения в терапии в сочетании с по меньшей мере одним антигеном или его фрагментом, вариантом и/или производным; и (b) по меньшей мере одному антигену или его фрагменту, варианту и/или производному для применения в терапии в сочетании с комплексом полимерного носителя и переносимого вещества, при этом в каждом случае (a) и (b), в частности, для применения в терапии инфекционных болезней, аллергий, аутоиммунных заболеваний и опухолевых или раковых заболеваний.

В настоящее время в случае множества заболеваний требуется введение адъювантов, чтобы обеспечить поддержание на основе врожденного иммунного ответа адаптивного иммунного ответа, в частности, в контексте вакцинаций. Некоторые, но не обязательно все, такие заболевания дополнительно или альтернативно требуют введения лекарственных средств, основанных на пептидах, белках и нуклеиновых кислотах, например, трансфекции нуклеиновых кислот в клетки или ткани. Такие требования обычно означают разные аспекты лечения таких заболеваний и обычно их трудно рассматривать в одном подходе. Как следствие, в предшествующем уровне техники такие аспекты обычно рассматривали, используя отдельные подходы.

В указанном выше контексте, в общем, полагают, что вакцинация является одним из наиболее эффективных и экономичных путей профилактики или лечения заболеваний. Тем не менее, оказалось, что несколько проблем в разработке вакцины трудно решить: вакцины часто бывают неэффективными в случае очень молодых и очень пожилых людей; в случае многих вакцин требуется введение несколько раз, и защита, которую они придают, ослабевает с течением времени, что требует ревакцинации, и в случае некоторых заболеваний, таких как ВИЧ-инфекция, разработка эффективных вакцин является экстренной необходимостью. Общепринято, что многие такие вакцины могут быть разрешены или усовершенствованы, если они могут вызывать более сильный и более продолжительный иммунный ответ.

Соответственно, разработка новых эффективных и безопасных фармацевтических композиций, которые содержат адъюванты, в целях вакцинации, которая поддерживает индукцию и сохранение адаптивного иммунного ответа за счет инициации или стимуляции параллельного врожденного иммунного ответа, представляет собой основную сложную проблему.

Адъюванты обычно определяют как соединения, которые могут повышать и/или модулировать иммуногенность, присущую антигену. Чтобы уменьшить негативные побочные эффекты, новые вакцины имеют более определенный состав, что часто приводит к более низкой иммуногенности по сравнению с предыдущими вакцинами, основанными на целых клетках или вирусах. Таким образом, адъюванты необходимы для того, чтобы они помогали новым вакцинам индуцировать сильные и устойчивые иммунные ответы с дополнительным преимуществом, которое заключается в том, что требуется меньше антигена и меньше инъекций. В настоящее время ясно, что адаптивный иммунный ответ зависит, главным образом, от уровня и специфичности начальных сигналов опасности, распознаваемых присущими организму иммунными клетками после инфекции или вакцинации (Guy, B. (2007), Nat. Rev. Microbiol. 5(7): 505-17). В частности, в случае кандидатов, которые могут стать вакцинами нового поколения, которые будут содержать все больше и больше высоко очищенных рекомбинантных белков и, несмотря на высокую степень безопасности, будут слабо иммуногенными, эффективные адъюванты будут становиться все более необходимыми.

К сожалению, до сих пор доступно только несколько разрешенных к применению адъювантов. Наиболее известными являются квасцы, которые, как известно, являются безопасными, но также представляют собой очень слабый адъювант. Было разработано много дополнительных адъювантов, например, включая введение патогенов, CpG-нуклеотидов и т.д. Однако большинство таких новых или «разработанных» адъювантов еще не удовлетворяют указанным выше требованиям, так как необходимо рассмотреть и решить множество новых возникающих проблем. Такие проблемы, наряду с прочими, включают новые и вновь возникающие инфекционные болезни, многократные введения, угрозу пандемии гриппа и т.д.

Кроме того, новые мишени для вакцин обычно труднее разработать и - вследствие специально заданных иммунных ответов - они требуют более сильных адъювантов для обеспечения успеха. Кроме того, существует значительное количество важных патогенов, для которых в настоящее время у нас даже нет эффективных вакцин. Это является очень сложной целью в будущем. Чтобы обеспечить возможность разработки вакцин против таких мишеней, будут необходимы более эффективные фармацевтические композиции, которые включают в себя адъюванты и такие мишени. Таким образом, в таких композициях будут необходимы новые адъюванты, обеспечивающие определенные преимущества, включая более гетерологичные гуморальные ответы, охватывающие разнообразные патогены, индукцию эффективных функциональных гуморальных ответов, обеспечение гибели или нейтрализации патогенов и индукцию более эффективных T-клеточных ответов для того, чтобы прямо и опосредованно вызвать гибель патогенов, в частности, индукцию цитотоксических T-клеток, которые являются частью иммунного Th1-ответа. Кроме того, адъюванты могут быть необходимы для достижения более прагматичных эффектов, включая снижение дозы антигена и преодоление конкуренции между антигенами в комбинированных вакцинах. Кроме того, на фоне старения популяции, которая становится все более чувствительной к инфекционным болезням, новые адъюванты будут необходимы для преодоления естественного ухудшения иммунного ответа с возрастом (O'Hagan, D. T. and E. De Gregorio (2009), Drug Discov. Today 14(11-12): 541-51).

В обзоре O'Hagan (2009; выше) суммированы некоторые причины острой необходимости в новых эффективных адъювантах, например, необходимость в более низкой дозе антигена в вакцинах, необходимость увеличения широты иммунного ответа и гетерологичной активности, получения сложных комбинированных вакцин и преодоления конкуренции между антигенами, преодоления ограниченного иммунного ответа у некоторых групп населения, таких как пожилые люди, маленькие дети и дети грудного возраста, пациенты с хроническими заболеваниями и нарушенным иммунитетом, повышения ответа эффекторных T-клеток и титра антител, более быстрой индукции защитных ответов, а также увеличения продолжительности ответа за счет усиления ответов B- и T-клеток памяти.

Суммируя вышесказанное, следует отметить, что требуются новые эффективные и безопасные фармацевтические композиции, которые включают в себя иммуностимулирующие средства или адъюванты, которые предпочтительно являются эффективными в индукции врожденного иммунного ответа, в частности, в индукции противовирусного цитокина IFN-альфа; и которые также эффективны в поддержании адаптивного иммунного ответа; безопасны, т.е. не ассоциированы с какими-либо длительными эффектами; которые хорошо переносимы; которые могут быть получены путем простого синтеза; которым нужны недорогие условия хранения (в частности, возможная лиофилизация); которые требуют простых и недорогих компонентов; которые являются биологически разрушаемыми; которые совместимы со многими разными видами вакцинных антигенов; которые можно доставлять совместно с антигеном и иммуностимулятором, и т.д.

Как уже объяснялось выше, адъюванты или иммуностимуляторы обычно действуют благодаря их способности индуцировать врожденный иммунный ответ. Врожденная иммунная система образует преобладающую систему защиты хозяина в большинстве организмов и включает в себя такие барьеры, как гуморальный и химические барьеры, включая, например, воспаление, систему комплемента и клеточные барьеры. Врожденная иммунная система обычно основана на небольшом количестве рецепторов, называемых рецепторами распознавания картины. Они распознают консервативные молекулярные картины, которые позволяют отличать чужеродные организмы, подобные вирусам, бактериям, грибам и паразитам, от клеток хозяина. Такие ассоциированные с патогенами молекулярные картины (PAMP) включают вирусные нуклеиновые кислоты, компоненты бактериальных стенок и стенок грибов, флагеллярные белки и другое. Первым подробно исследованным семейством рецепторов распознавания картины (PAMP-рецепторов) было семейство Toll-подобных рецепторов (TLR). TLR являются трансмембранными белками, которые распознают лиганды во внеклеточной среде или в просвете эндосом. После связывания лиганда они трансдуцируют сигнал через цитоплазматические адаптерные белки, что приводит к запуску защитной реакции хозяина и влечет за собой продуцирование противомикробных пептидов, провоспалительных хемокинов и цитокинов, противовирусных цитокинов и т.д. (смотри, например, Meylan, E., J. Tschopp, et al. (2006), Nature 442 (7098): 39-44). Дальнейшие соответствующие компоненты иммунной системы включают, например, TLR эндосом, цитоплазматические рецепторы, интерфероны типа I и цитоплазматические рецепторы. Таким образом, иммуностимулирующие средства или адъюванты предпочтительно определяют в настоящем описании как индукторы врожденного иммунного ответа, которые активируют рецепторы распознавания картины (PAMP-рецепторы). Таким образом, запускается каскад сигналов, который, например, может приводить к высвобождению цитокинов (например, IFN-альфа), поддерживающих врожденный иммунный ответ. Соответственно, предпочтительным признаком иммуностимулирующего средства или адъюванта является связывание с такими рецепторами и активация таких PAMP-рецепторов. В идеале, такое средство или адъювант дополнительно поддерживает адаптивный иммунный ответ, например, в результате сдвига иммунного ответа таким образом, чтобы был активирован предпочтительный класс Th-клеток. В зависимости от заболевания или расстройства, подвергаемого лечению, может быть предпочтительным сдвиг в сторону иммунного ответа, основанного на Th1, или в других случаях может быть предпочтительным сдвиг в сторону Th2-иммунного ответа.

В известном уровне техники существуют некоторые многообещающие кандидаты для использования в качестве адъювантов, которые удовлетворяют по меньшей мере некоторым, но не всем, определенным выше необходимым характеристикам.

В качестве примера, среди указанных выше новых разработанных адъювантов можно назвать некоторые нуклеиновые кислоты, подобные CpG-ДНК-олигонуклеотидам или исРНК (иммуностимулирующие РНК), которые оказались многообещающими кандидатами для новых иммуностимулирующих средств или адъювантов, так как они позволяют осуществлять терапевтическую или профилактическую индукцию врожденного иммунного ответа. Понятно, что такие основанные на нуклеиновых кислотах адъюванты обычно требуется эффективно доставлять к месту действия, чтобы обеспечить индукцию эффективного врожденного иммунного ответа без излишней потери активности адъюванта и, в некоторых случаях, без необходимости увеличивать вводимый объем выше переносимых системой уровней.

Одним из способов решить такую проблему может быть трансфекция клеток, которые являются частью врожденной иммунной системы (например, дендритных клеток, плазмацитоидных дендритных клеток (pDC)) иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами, которые являются лигандами PAMP-рецепторов (например, Toll-подобных рецепторов (TLR)), что таким образом может привести к иммуностимуляции лигандами, представляющими собой нуклеиновые кислоты. Дополнительным способом может быть прямая трансфекция основанными на нуклеиновых кислотах адъювантами. Однако все указанные способы обычно ухудшаются в результате неэффективной доставки нуклеиновой кислоты и в связи с этим пониженной активности адъюванта, в частности, при местном введении.

Однако одним из основных недостатков таких основанных на нуклеиновых кислотах способов до настоящего времени является их ограниченная способность проходит через плазматическую мембрану клеток млекопитающих, что приводить к плохому доступу в клетки и неадекватной терапевтической эффективности. До настоящего времени такое затруднение является главной проблемой для применений, основанных на трансфекции нуклеиновыми кислотами, например, биомедицинских разработок и, соответственно, коммерческой успешности многих биофармацевтических средств (смотри, например, Foerg, C. and Merkle, H.P., J. Pharm. Sci. 97, 144-62 (2008).

Трансфекцию нуклеиновых кислот или генов в клетки или ткани исследовали вплоть до настоящего времени в контексте целей трансфекции in vitro и в контексте способов, основанных на генной терапии. Однако в настоящее время нет доступных адъювантов, которые основаны на такой методике доставки генов, которые были бы эффективными и безопасными, в частности, нет лицензированных адъювантов. По-видимому, это обусловлено сложными требованиями для адъювантов в целом в сочетании с проблемами, связанными со стабильностью, которые необходимо решать в случае основанных на нуклеиновых кислотах адъювантах.

Тем не менее, трансфекция нуклеиновых кислот или генов в клетки или ткани, для того чтобы вызвать (врожденный и/или адаптивный) иммунный ответ, по-видимому, обеспечивает многообещающий способ получения новых адъювантов.

Однако во многих из таких способов используют трансфекцию нуклеиновых кислот или генов в клетки или ткани, не имея намерения индуцировать врожденный иммунный ответ. Существуют даже некоторые способы генной терапии, при которых необходимо строго избегать индукции врожденного иммунного ответа. Даже в редких случаях, когда осуществляют вакцинацию с целью индукции адаптивного антигенспецифичного иммунного ответа с использованием введения нуклеиновых кислот, например, в случае противоопухолевых вакцинаций с использованием кодируемых ДНК или мРНК антигенов, индукцию адаптивного иммунного ответа обычно осуществляют в виде активной иммунизации против кодируемого антигена, но не в виде сопутствующей адъювантной терапии, и при этом может требоваться дополнительное введение отдельного адъюванта, чтобы индуцировать врожденный иммунный ответ.

Несмотря на то, что в данной области известно множество способов трансфекции, в настоящее время перенос или встраивание нуклеиновых кислот или генов в клетки индивидуума все еще представляет собой серьезную проблему и еще не найдено удовлетворительное решение. Для решения указанной сложной проблемы в последнее десятилетие разработаны разнообразные способы. Такие способы включают трансфекцию с использованием фосфата кальция, катионных липидов, катионных полимеров и липосом. Другими способами трансфекции являются электропорация и вирусная трансдукция.

Однако, как известно специалисту, системы для переноса или встраивания нуклеиновых кислот или генов должны удовлетворять нескольким требованиям для применений in vivo, которые включают эффективную доставку нуклеиновой кислоты в клетки индивидуума с высокой функциональностью, защиту нуклеиновой кислоты от повсеместно встречающихся нуклеаз, высвобождение нуклеиновой кислоты в клетку, отсутствие проблем, связанных с безопасностью, возможное производство в коммерчески приемлемой форме, масштаб которого можно наращивать, и стабильность при хранении при небольших затратах (например, возможная лиофилизация). Такие требования необходимо добавить к комплексу требований, предъявляемых к адъюванту, особенно когда он находится в форме нуклеиновой кислоты, которая описана выше.

Несколько успешных методик переноса или встраивания нуклеиновых кислот или генов, доступных в настоящее время, основаны на использовании вирусных векторов, таких как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы и вирусы герпеса. Вирусные векторы способны опосредовать перенос генов с высокой эффективностью и возможностью длительной экспрессии генов. Однако острая иммунная реакция («цитокиновая буря»), иммуногенность и основанный на инсерциях мутагенез, обнаруженные в клинических испытаниях генной терапии, вызвали серьезные опасения в отношении безопасности некоторых широко используемых вирусных векторов.

Другое решение проблемы переноса или встраивания нуклеиновых кислот или генов можно найти, используя невирусные векторы. Хотя невирусные векторы не столь эффективны, как вирусные векторы, было разработано множество невирусных векторов для обеспечения безопасной альтернативы. Методики доставки невирусных нуклеиновых кислот были проанализированы с использованием физических (доставка нуклеиновых кислот без носителя) и химических способов (доставка нуклеиновых кислот на основе синтетических векторов). Физические способы обычно включают доставку с помощью инъекции через иглу, электропорации, генной пушки, обработки ультразвуком и гидродинамической доставки, с использованием физической силы, которая приводит к пермеабилизации клеточной мембраны и облегчает перенос генов внутрь клеток. В химических способах обычно используют синтетические или встречающиеся в природе соединения (например, катионные липиды, катионные полимеры, гибридные системы липид-полимер) в качестве носителей для доставки нуклеиновой кислоты в клетки. Хотя был достигнут значительный прогресс в фундаментальной науке и применениях различных невирусных систем доставки нуклеиновых кислот, большинство из способов, не основанных на использовании вирусов, все еще менее эффективны, чем вирусные векторы, особенно для доставки генов in vivo (смотри, например, Gao, X., Kim, K. and Liu, D., AAPSJ9, E92-104 (2007)).

Такие средства для трансфекции, которые определены выше, обычно были успешно использованы по отдельности в реакциях in vitro. Однако в случае применения нуклеиновых кислот in vivo, должны быть удовлетворены дополнительные требования. Например, комплексы, образованные между нуклеиновыми кислотами и средствами для трансфекции, должны быть стабильными в физиологических растворах соли в отношении агломерации. Кроме того, такие комплексы обычно не должны взаимодействовать с частями системы комплемента хозяина и, следовательно, не должны быть иммуногенными сами по себе, так как носитель сам по себе не должен индуцировать адаптивный иммунный ответ у индивидуума. Кроме того, комплекс должен защищать нуклеиновую кислоту от раннего внеклеточного разрушения повсеместно встречающимися нуклеазами.

В данной области доступно много реагентов для трансфекции, в частности катионные липиды, которые проявляют превосходную активность при трансфекции в культуре клеток. Однако большинство таких реагентов для трансфекции не могут хорошо работать в присутствии сыворотки, и только немногие активны in vivo. Происходит сильное изменение размера, поверхностного заряда и липидного состава в том случае, когда липоплексы подвергаются воздействию огромного количества отрицательно заряженных и часто амфипатических белков и полисахаридов, которые присутствуют в крови, слизистой, жидкости эпителиальной выстилки или тканевом матриксе. После введения in vivo липоплексы склонны взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами крови и образовывать крупные агрегаты, которые могут абсорбироваться на поверхности циркулирующих эритроцитов, улавливаться в густом слизистом слое или накапливаться в просветах микрососудов, что препятствует достижению ими целевых клеток в отдаленных местах. Некоторые даже подвергаются растворению после того, как они поступают в кровообращение (смотри, например, Gao, X., Kim, K. and Liu, D., AAPSJ9, E92-104 (2007)).

В одном из многообещающих способов используют катионные полимеры. Катионные полимеры оказались эффективными при трансфекции нуклеиновых кислот, так как они могут образовать прочные комплексы и конденсировать отрицательно заряженную нуклеиновую кислоту. Таким образом, был исследован ряд катионных полимеров в качестве носителей для доставки генов in vitro и in vivo. Такие катионные полимеры включают полиэтиленимин (PEI), полиамидоамин и дендримеры полипропиламина, полиаллиламин, катионный декстран, хитозан, катионные белки и катионные пептиды. Хотя большинство катионных полимеров обладают функцией конденсации ДНК в небольшие частицы и способствуют захвату клетками в результате эндоцитоза посредством взаимодействия зарядов с анионными участками на клеточной поверхности, их активность в трансфекции и токсичность сильно отличаются.

Только в одном способе, известном в данной области, описанном Fotin-Mleczek с соавторами (WO 2009/030481), было показано иммуностимулирующее действие РНК в комплексе с короткими катионными пептидами. Такие препараты, по-видимому, эффективно индуцируют продукцию цитокинов в иммунокомпетентных клетках. К сожалению, Fotin-Mleczek с соавторами не оценивали индукцию такими комплексами предпочтительного противовирусного цитокина IFN-α. Кроме того, такие комплексы оказались нестабильными во время лиофилизации.

В указанном выше контексте катионные полимеры проявляют повышенную эффективность в трансфекции по мере увеличения молекулярной массы. Однако увеличение молекулярной массы также приводит к повышению токсичности катионного полимера. В указанном выше контексте (высокомолекулярный) PEI является, пожалуй, наиболее активным и наиболее изученным полимером для трансфекции нуклеиновых кислот, в частности, в целях доставки генов. К сожалению, он имеет такой же недостаток вследствие его биологически не разрушаемой природы и токсичности. Кроме того, даже несмотря на то, что полиплексы, образованные высокомолекулярными полимерами, имеют улучшенную стабильность в физиологических условиях, полученные данные показали, что такие полимеры могут препятствовать распаковыванию вектора. Чтобы преодолеть такое негативное влияние, Read с соавторами (смотри Read, M.L. с соавторами, J. Gene Med. 5, 232-245 (2003); и Read, M.L. с соавторами, Nucleic Acids Res. 33, e86 (2005)) разработали новый тип синтетического вектора, основанного на линейном восстанавливаемом катионе (RPC), получаемом в результате окислительной поликонденсации пептида Cys-Lys₁₀-Cys. Такой пептид Cys-Lys₁₀-Cys может быть расщеплен во внутриклеточной среде, что способствует высвобождению нуклеиновых кислот. В данном контексте Read с соавторами (2003, выше) смогли показать, что полиплексы, образованные такими RPC, подвергаются дестабилизации в восстанавливающих условиях, обеспечивая эффективное высвобождение ДНК и мРНК. Однако исследование эффективности трансфекции in vitro, проведенное Read с соавторами (2003, выше), также показало, что отношения N/P (атомов азота к атомам фосфора), равные 2, были неудовлетворительными, и были необходимы более высокие отношения N/P для улучшения эффективности трансфекции. Кроме того, Read с соавторами (2003, выше) обнаружили, что дополнительно были необходимы хлорохин или катионный липид DOTAP для повышения эффективности трансфекции до адекватных уровней. В результате Read с соавторами (2005, выше) включили остатки гистидина в RPC, которые обладают известной буферной способностью в эндосомах, и показали, что такие обогащенные гистидином RPC могут расщепляться во внутриклеточной восстанавливающей среде. Такой способ позволил осуществить эффективную доставку в цитоплазму широкого диапазона нуклеиновых кислот, включая плазмидную ДНК, мРНК и молекулы миРНК, без необходимости в эндосомолитическом агенте хлорохине.

К сожалению, ни Read с соавторами (2003, выше), ни Read с соавторами (2005, выше) не оценивали, могут ли RPC непосредственно быть использованы в применениях in vivo. В их исследовании, проведенном в 2005 году, трансфекцию осуществляли в отсутствие сыворотки, чтобы избежать маскировки способности остатков гистидина усиливать перенос генов, которая могла возникнуть в результате связывания белков сыворотки с полиплексами, ограничивающего захват клетками. Однако предварительные эксперименты показали, что на трансфицирующие свойства полиплексов обогащенных гистидином RPC может влиять присутствие сывороточных белков, при этом происходит снижение на 50% количества GFP-позитивных клеток, наблюдаемое в случае 10% FCS. Для применения in vivo Read с соавторами (2005, выше) предложили модификации гидрофильным полимером поли-[N-(2-гидроксипропил)метакриламид]. К сожалению, они не смогли предотвратить агрегацию полиплексов и связывание поликатионных комплексов с сывороточными белками. Кроме того, образуются сильно заряженные катионные комплексы (положительный дзета-потенциал) при образовании комплексов нуклеиновой кислоты вследствие большого избытка катионного полимера, для которого характерно высокое соотношение N/P. Соответственно, такие комплексы имеют только ограниченное применение in vivo из-за их сильной тенденции к индуцируемой солью агломерации и взаимодействиям с содержимым сыворотки (опсонизации). Кроме того, такие (положительно заряженные) комплексы могут вызывать активацию комплемента при использовании в целях генной терапии. Также оказалось, что в случае таких положительно заряженных основанных на RPC комплексах наблюдается плохая трансляция переносимой нуклеиновой кислоты после местного введения в дерму.

В одном способе, подобном способу Read с соавторами, McKenzie с соавторами (McKenzie, D. L, K. Y. Kwok, et al. (2000), J. Biol. Chem. 275(14): 9970-7 и McKenzie, D. L, E. Smiley, et al. (2000), Bioconjug. Chem. 11(6): 901-9), разработали поперечно сшивающие пептиды в качестве средств доставки путем встраивания множества цистеинов в короткие синтетические пептиды. В своих исследованиях они изучали оптимальное образование комплексов с ДНК, и в результате они смогли показать, что соотношение N/P, составляющее по меньшей мере 2, необходимо для полностью образованных конденсатов пептид-ДНК. Таким образом, только положительно заряженные комплексы, по-видимому, демонстрируют оптимальную конденсацию ДНК. В противоположность таким данным они предложили разработку отрицательно заряженных комплексов для доставки генов in vivo, так как в предыдущих исследованиях было показано, что внутривенное применение электроположительных конденсатов ДНК приводит к быстрой опсонизации и неспецифичному биораспределению в легкие и печень (Collard, W. T., Evers, D. L, McKenzie, D. L, and Rice, K. G. (2000), Carbohydr. Res. 323, 176-184). Таким образом, McKenzie с соавторами (2000; выше) предложили дериватизацию носителей полиэтиленгликолем и направленными к мишени лигандами. Следует отметить, что способ McKenzie с соавторами (2000, выше) является дополнительным объектом патента (US 6770740 B1), в котором, в частности, раскрыта трансфекция кодирующих нуклеиновых кислот, антисмысловых нуклеиновых кислот и рибозимов.

Таким образом, применение нуклеиновых кислот in vivo, по-видимому, остается до сих пор одной из наиболее сложных проблем, так как белки плазмы с анионными зарядами могут неспецифично связываться с положительно заряженными комплексами и быстро удалять их, например, через ретикулоэндотелиальную систему. Опсонизация и активация системы комплемента катионными комплексами является дополнительным физиологическим явлением, которое может участвовать в снижении эффективности вводимых in vivo катионных комплексов. Это особенно применимо к введению основанных на нуклеиновых кислотах лекарственных средств, например, к трансфекции нуклеиновых кислот в клетки и ткани, особенно если предполагается экспрессия кодируемого белка или пептида или транскрипция РНК с трансфицируемой нуклеиновой кислоты.

Суммируя вышесказанное, следует сказать, что известный уровень техники не обеспечил возможные средства или способы, которые позволяют получить эффективные и безопасные фармацевтические композиции, которые содержат адъюванты, для целей вакцинации, особенно если требуется сдвинутый в сторону Th1 иммунный ответ.

Соответственно, целью настоящего изобретения является предоставление таких средств или способов, которые решают одну из нескольких указанных проблем.

Основополагающая цель настоящего изобретения решается за счет объекта настоящего изобретения, предпочтительно объекта, указанного в прилагаемой формуле изобретения.

Для ясности и четкости приведены следующие определения. Любые технические признаки, раскрываемые таким образом, могут быть частью всех без исключения вариантов осуществления изобретения. Дополнительные определения и пояснения могут быть приведены в контексте настоящего описания.

Нуклеиновая кислота: Термин «нуклеиновая кислота» обычно означает любую ДНК- или РНК-молекулу и используется как синоним термина «полинуклеотид». Кроме того, модификации или производные нуклеиновой кислоты, которая определена в настоящем описании, однозначно включены в общий термин «нуклеиновая кислота». Например, PNA также включена в термин «нуклеиновая кислота».

Моноцистронная РНК: Моноцистронная РНК обычно может представлять собой РНК, предпочтительно мРНК, которая кодирует только одну открытую рамку считывания. Открытая рамка считывания в данном контексте представляет собой последовательность нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которые могут быть транслированы в пептид или белок.

Би-/полицистронная РНК: РНК, предпочтительно мРНК, которая обычно может иметь две (бицистронная) или более (полицистронная) открытых рамок считывания (ORF). Открытая рамка считывания в данном контексте представляет собой последовательность нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которая может быть транслирована в пептид или белок.

5'-кэп-структура: 5'-кэп обычно представляет собой модифицированный нуклеотид, в частности, гуаниновый нуклеотид, добавляемый к 5'-концу РНК-молекулы. Предпочтительно 5'-кэп добавляют, используя 5'-5'-трифосфатную связь.

Поли(C)-последовательность: Поли(C)-последовательность обычно представляет собой длинную последовательность цитозиновых нуклеотидов, обычно от примерно 10 до примерно 200 цитидиновых нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 цитидиновых нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 70 цитидиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно от примерно 20 до примерно 50 или даже от примерно 20 до примерно 30 цитидиновых нуклеотидов. Поли(C)-последовательность предпочтительно может быть локализована с 3'-стороны от кодирующей области, входящей в состав нуклеиновой кислоты.

Поли(A)-хвост: Поли(A)-хвост, также называемый «3'-поли(A)-хвостом», обычно представляет собой длинную последовательность адениновых нуклеотидов длиной примерно до 400 аденозиновых нуклеотидов, например, от примерно 25 до примерно 400, предпочтительно от примерно 50 до примерно 400, более предпочтительно от примерно 50 до примерно 300, еще более предпочтительно от примерно 50 до примерно 250, наиболее предпочтительно от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов, добавляемых к 3'-концу РНК.

Стабилизированная нуклеиновая кислота: Стабилизированная нуклеиновая кислота обычно может быть по существу резистентной к разрушению in vivo (например, разрушению экзо- или эндонуклеазой) и/или разрушению ex vivo (например, в процессе производства перед введением вакцины, например, в ходе приготовления раствора вакцины, который необходимо ввести). Стабилизация мРНК может быть достигнута, например, добавлением 5'-кэп-структуры, поли(A)-хвоста, поли(C)-хвоста или любой другой модификации UTR. Стабилизация также может быть достигнута за счет модификации остова или модификации G/C-содержания в нуклеиновой кислоте. В контексте изобретения допустимы различные другие способы.

Модификация нуклеиновой кислоты (модифицированная нуклеиновая кислота): Модификация молекулы нуклеиновой кислоты обычно может включать модификации остова, модификации сахара или модификации оснований. Модификация остова применительно к настоящему изобретению обычно представляет собой модификацию, при которой фосфаты остова из нуклеотидов, входящих в молекулу нуклеиновой кислоты, могут быть химически модифицированы. Модификация сахара применительно к настоящему изобретению обычно может представлять собой химическую модификацию сахара нуклеотидов в нуклеиновой кислоте. Кроме того, модификация оснований применительно к настоящему изобретению обычно может представлять собой химическую модификацию остатка основания нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. Таким образом, модифицированная нуклеиновая кислота также может быть определена в настоящем описании как молекула нуклеиновой кислоты, которая может содержать аналоги нуклеотидов. Кроме того, модификация молекулы нуклеиновой кислоты может включать модификацию липидами. Такая модифицированная липидами нуклеиновая кислота обычно может включать нуклеиновую кислоту, которая определена в настоящем описании. Такая модифицированная липидами молекула нуклеиновой кислоты обычно может дополнительно содержать по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с такой молекулой нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером. Альтернативно, модифицированная липидами молекула нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, которая определена в настоящем описании, и по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с такой молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно третьему альтернативному варианту модифицированная липидом молекула нуклеиновой кислоты может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, которая определена в настоящем описании, по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с такой молекулой нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером, а также по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с такой молекулой нуклеиновой кислоты.

Модификация нуклеиновой кислоты также может включать модификацию содержания G/C в кодирующей области молекулы нуклеиновой кислоты, особенно если молекула нуклеиновой кислоты находится в форме мРНК. В данном контексте особенно предпочтительно, чтобы содержание G/C в кодирующей области молекулы нуклеиновой кислоты было увеличено по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области конкретной кодирующей последовательности дикого типа, т.е. немодифицированной мРНК. Аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты, предпочтительно не модифицирована по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой конкретной мРНК дикого типа. Модификация G/C-содержания в молекуле нуклеиновой кислоты, особенно если молекула нуклеиновой кислоты находится в форме мРНК или кодирует мРНК, основана на том факте, что последовательность любой облас