Стабильное при хранении жидкое моющее или чистящее средство, содержащее протеазу и амилазу

Стабильное при хранении жидкое моющее или чистящее средство, содержащее протеазу и амилазу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области жидких моющих и чистящих средств. Изобретение предпочтительно относится к содержащим ферменты жидким моющим и чистящим средствам, которые содержат некоторые протеазы в комбинации с амилазой, и, кроме того, относится к способам, в которых используют такие средства. Изобретение относится также к применению некоторых протеаз в жидких моющих или чистящих средствах, содержащих амилазу.

В моющих и чистящих средствах предпочтительно применяют протеазы субтилизинового типа. Источником протеаз, применяемых в моющих или чистящих средствах, известных в предшествующем уровне техники, первоначально являются микроорганизмы, например, видов Bacillus, Streptomyces, Humicola, Thermomyces или Pseudomonas, и/или их производят по существу известными биотехнологическими способами с помощью приемлемых микроорганизмов, например с помощью трансгенных экспрессирующих организмов вида Bacillus или с помощью мицелиальных грибов.

В частности, в современных жидких моющих средствах все в большей степени содержатся другие ферменты, в данном случае предпочтительно амилазы. Амилаза представляет собой фермент, который катализирует гидролиз гликозидных связей, в частности, в полисахаридах, таких, как крахмал. Из числа амилаз в моющих и чистящих средствах часто применяют α-амилазы, которые гидролизуют α-(1-4)-гликозидные соединения амилозы. Согласно классификации ферментов КФ, представляющей собой числовую систему классификации ферментов, α-амилазы кодируются шифром КФ (от английского "Enzyme Commission number" ("шифр по классификации Комиссии по ферментам") 3.2.1.1 и относятся, следовательно, к третьему из шести главных классов ферментов, т.е. к гидролазам (E.C. 3.-.-.-), в данном случае к гликозилазам (E.C. 3.2.-.-) и также к гликозидазам (E.C. 3.2.1.-), т.е. к ферментам, которые гидролизуют O- и/или S-гликозильные соединения. При разложении крахмала α-амилазами образуются декстрины, из которых образуются мальтоза, глюкоза и разветвленные олигосахариды. Следовательно, амилазы при очистке предпочтительно действуют против крахмалсодержащих остатков и катализируют их гидролиз.

В международных заявках WO 95/23221 и WO 92/21760 описаны варианты щелочной протеазы, происходящей из Bacillus lentus DSM 5483, которые являются приемлемыми для применения в моющих или чистящих средствах, а также моющие и чистящие средства, содержащие протеазы такого типа. Кроме того, в международной заявке WO 2011/032988 описаны моющие и чистящие средства, которые также содержат варианты щелочной протеазы, происходящей из Bacillus lentus DSM 5483. Раскрытые в этих описаниях варианты протеаз наряду с другими положениями могут иметь замены в положениях 3, 4, 99 и 199 соответственно системе нумерации щелочной протеазы, происходящей из Bacillus lentus DSM 5483, и, например, в указанных положениях могут содержать аминокислоты 3T, 4I, 99D, 99E или 199I. Кроме того, описано, что моющее средство может содержать другие ферменты, в данном случае амилазу. Моющие средства могут быть твердыми или жидкими. Однако из этого описания непосредственно и однозначно не следует определение жидкого моющего средства, содержащего амилазу в комбинации с протеазой, которая характеризуется комбинациями этих изменений соответственно описанному далее.

Недостаток содержащих протеазу и амилазу жидких моющих и чистящих средств предшествующего уровня техники состоит в том, что они не являются достаточно стабильными при хранении и, следовательно, уже через короткое время в значительной мере утрачивают ферментативную, в частности амилолитическую и/или протеолитическую, активность. Присутствие протеазы часто ведет к потере амилолитической активности, так как протеаза инактивирует амилазу. Вследствие этого моющее или чистящее средство не показывает оптимальной эффективности очистки.

В основе настоящего изобретения лежит задача преодоления указанного недостатка и разработки, содержащих протеазу и амилазу жидких моющих или чистящих средств, которые являются в достаточной или повышенной степени стабильными при хранении, в частности, в отношении их ферментативной и предпочтительно их амилолитической и/или протеолитической активности.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является жидкое моющее или чистящее средство, содержащее:

(a) протеазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 70% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99E или R99D в комбинации по меньшей мере с двумя другими заменами аминокислот, выбранных из группы, в которую входят S3T, V4I и V199I, и

(b) амилазу.

Неожиданно было обнаружено, что жидкое моющее или чистящее средство, содержащее комбинацию такой протеазы с амилазой, является в благоприятной степени стабильным при хранении. В частности, оно характеризуется улучшенной эффективностью очистки, в частности улучшенной амилолитической и/или протеолитической эффективностью очистки, после хранения по сравнению с моющим или чистящим средством, которое отличается от средства по настоящему изобретению только наличием в соответствующем средстве протеазы, причем в сравниваемых средствах протеаза на начало хранения содержится в равной концентрации в пересчете на активный фермент. Таким образом, протеаза, предусмотренная по настоящему изобретению, ведет к пониженной инактивации амилазы и характеризуется также уменьшенной потерей собственной эффективности. Однако уменьшение инактивации амилазы и/или протеазы благодаря протеазе, предусмотренной по настоящему изобретению, не связано с недостаточной эффективностью и/или активностью протеазы.

В связи с этим средство по настоящему изобретению предпочтительно характеризуется хорошей, особенно благоприятной эффективностью очистки от загрязнений, чувствительных к протеазе. Таким образом, такое средство обеспечивает удовлетворительное или улучшенное удаление по меньшей мере одного вида и предпочтительно нескольких видов чувствительных к протеазе загрязнений с текстильных изделий и/или с твердых поверхностей, например с посуды. В выбранных вариантах осуществления настоящего изобретения такая эффективность очистки в отношении по меньшей мере одного вида чувствительных к протеазе загрязнений проявляется, в частности, также при низкой температуре, например в интервале от 10 до 50ºC, от 10 до 40ºC или от 20 до 40ºC.

Таким образом, в связи с ранее указанными международными заявками WO 95/23221, WO 92/21760 и WO 2011/032988 в случае настоящего изобретения речь идет об особенно предпочтительном выборе, ведущем к получению жидкого моющего средства, которое является эффективным и стабильным при хранении, в частности, в отношении протеолитической и/или амилолитической эффективности очистки средства после хранения и/или в отношении протеолитической, и/или амилолитической активности средства после хранения.

Под эффективностью очистки в рамках настоящего изобретения понимают способность моющего или чистящего средства при его применении удалять имеющееся загрязнение частично или полностью. В случае загрязнений белья эта способность предпочтительно представляет собой отбеливающую способность в отношении одного или нескольких видов загрязнений текстильных изделий. Примерами загрязнений белья являются следы "кровь-молоко/тушь" на хлопке, следы "яичный желток с белком/пигмент" на хлопке, следы "шоколад-молоко/тушь" на хлопке, следы "арахисовое масло-пигмент/тушь" на ткани из смеси "полиэфирное волокно/хлопок", следы травы на хлопке или следы какао на хлопке. В случае средств для мытья посуды под эффективностью очистки понимают способность средства для мытья посуды удалять загрязнения, имеющиеся на твердой поверхности посуды. Примеры загрязнений посуды представляют собой молоко, мясной фарш, яичный желток, овсяные хлопья и крахмал. В рамках настоящего изобретения как моющее или чистящее средство, содержащее протеазу и амилазу, или моющий раствор, образованный этим средством, так и собственно протеаза или амилаза обладают соответствующей очищающей эффективностью. Таким образом, очищающая эффективность ферментов вносит свой вклад в очищающую эффективность средства или моющего раствора, образованного средством. Амилолитическая эффективность очистки означает эффективность очистки от загрязнений, чувствительных к амилазе. Протеолитическая эффективность очистки означает эффективность очистки от загрязнений, чувствительных к протеазе. Эффективность очистки определяют общепринятым в данной области техники способом, предпочтительно способом, указанным далее.

Под моющим раствором понимают рабочий раствор, который содержит моющее или чистящее средство, действует на текстильные изделия или ткани, или твердые поверхности и, таким образом, приходит в контакт с загрязнениями, имеющимися на текстильных изделиях или тканях, или твердых поверхностях. Как правило, моющий раствор образуется тогда, когда начинается процесс стирки или очистки и моющее или чистящее средство разбавляют водой, например, в посудомоечной машине, стиральной машине или в другом приемлемом сосуде.

Стабильность при хранении в смысле настоящего изобретения проявляется, в частности, в том, что моющее или чистящее средство по настоящему изобретению имеет после хранения более высокую эффективность очистки по сравнению с контрольной композицией, которая отличается от моющего или чистящего средства по настоящему изобретению только протеазой, содержащейся в контрольной композиции. При этом оба из сравниваемых средств на начало хранения характеризуются равными значениями количества или концентрации амилазы и/или исходной амилолитической активности. Кроме того, в обоих средствах на начало хранения протеаза содержится в равных концентрациях в пересчете на активный фермент и с обоими средствами обращаются одинаковым образом, в частности, в отношении условий хранения и определения ферментативной активности. Более предпочтительно хранение осуществляют в течение по меньшей мере 24 часов, 48 часов, 72 часов, 5 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель или 4 недель. При этом хранение предпочтительно осуществляют при температуре 20ºC, 30ºC или 40ºC и более предпочтительно при 40ºC.

В связи с этим определение ферментативной активности может быть осуществлено - в зависимости от соответствующего типа фермента - общепринятым в данной области техники способом. Способы определения активности известны специалистам в области технологии ферментов и применяются ими в установленном порядке. Способы определения активности протеазы описаны, например, в Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132. Кроме того, протеолитическая активность может быть определена по высвобождению хромофора в виде пара-нитроанилина (pNA) из субстрата suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-п-нитроанилид (suc-AAPF-pNA). Протеаза расщепляет субстрат и высвобождает pNA. Высвобождение pNA вызывает повышение поглощения при 410 нм, изменение которого во времени представляет собой меру ферментативной активности (см. Del Mar et al., 1979). Измерение осуществляют при температуре 25ºC, при pH=8,6 и при длине волны 410 нм. Время измерения составляет 5 минут при интервале измерения от 20 до 60 с. Активность протеазы предпочтительно указывают в единицах PE (протеазные единицы).

Активность амилазы определяют общепринятым в данной области техники способом. Активность амилазы предпочтительно определяют соответственно указанному далее. Амилазы превращают крахмал в глюкозу. Исследуемую пробу, содержащую 0,67% крахмала (растворимого, предварительно обработанного по методу Зулковского (обработанного глицерином при 190ºC)), инкубируют в определенных условиях реакции (трис-малеинатный буферный раствор, pH=6,5, 50ºC, 15 мин). Динитросалициловая кислота после ее прибавления и нагревания при 100ºC в щелочных условиях восстанавливается глюкозой и другими восстанавливающими сахарами до оранжево-красного красителя, который после окончания реакции определяют фотометрически при 540 нм. При этом количество высвобожденных сахаров, соответствующее окрашиванию, представляет собой меру ферментативной активности (см. Sumner et al., J. Biol. Chem., 1921, 47 & 1924, 62).

Более предпочтительно выявляют наличие ферментной стабилизации в смысле настоящего изобретения соответственно указанному ранее при применении содержащего протеазу и амилазу жидкого моющего или чистящего средства, которое хранят в течение четырех недель при температуре 40ºC, причем протеолитическую активность определяют по высвобождению хромофора в виде пара-нитроанилина (pNA) из субстрата suc-AAPF-pNA, а амилолитическую активность определяют соответственно указанному ранее.

Протеаза, содержащаяся в моющем или чистящем средстве по настоящему изобретению, содержит аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 70% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99E или R99D в комбинации по меньшей мере с двумя другими заменами аминокислот, выбранных из группы, в которую входят S3T, V4I и V199I.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99E в комбинации по меньшей мере с двумя другими заменами аминокислот, выбранных из группы, в которую входят S3T, V4I и V199I.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99D в комбинации по меньшей мере с двумя другими заменами аминокислот, выбранных из группы, в которую входят S3T, V4I и V199I.

SEQ ID NO. 1 представляет собой последовательность зрелой (находящейся в состоянии зрелости) щелочной протеазы, происходящей из Bacillus lentus DSM 5483 и описанной в международной заявке WO 92/21760, на описание которой в настоящем тексте дается прямая ссылка.

Особенно предпочтительными по настоящему изобретению протеазами являются:

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99E в комбинации с заменами аминокислот S3T и V4I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот S3T, V4I и R99E;

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99E в комбинации с заменами аминокислот S3T и V199I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот S3T, R99E и V199I;

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99E в комбинации с заменами аминокислот V4I и V199I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот V4I, R99E и V199I;

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99D в комбинации с заменами аминокислот S3T и V4I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот S3T, V4I и R99D;

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99D в комбинации с заменами аминокислот S3T и V199I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот S3T, R99D и V199I;

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 и 98,8% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99D в комбинации с заменами аминокислот V4I и V199I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот V4I, R99D и V199I.

Другие, особенно предпочтительные варианты протеаз по настоящему изобретению отличаются тем, что в них имеются замены аминокислоты R99E или R99D в комбинации с тремя другими заменами аминокислот S3T, V4I и V199I. В связи с этим наиболее предпочтительными являются следующие протеазы:

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90,5, 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98 и 98,5% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99E в комбинации с заменами аминокислот S3T, V4I и V199I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот S3T, V4I, R99E и V199I. Протеаза такого типа указана в SEQ ID NO. 2;

протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 1, в отношении ее общей длины по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98% и 98,5% является идентичной и имеет в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 замену аминокислоты R99D в комбинации с заменами аминокислот S3T, V4I и V199I, предпочтительно протеаза соответственно SEQ ID NO. 1 с заменами аминокислот S3T, V4I, R99D и V199I. Протеаза такого типа указана в SEQ ID NO. 3.

Другие, особенно предпочтительные протеазы представляют собой протеазы соответственно описанному ранее, которые, кроме того, в положении 211 в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1 содержат аминокислоту лейцин (L).

Положения аминокислот по настоящему изобретению определяют посредством выравнивания аминокислотной последовательности применяемой протеазы с аминокислотной последовательностью протеазы, происходящей из Bacillus lentus, соответственно указанному в SEQ ID NO. 1. Так как протеаза, происходящая из Bacillus lentus, на предшествующем уровне техники представляет собой важное сравнительное соединение для описания протеаз и замен аминокислот, то при идентификации положений аминокислот следует предпочтительно принимать во внимание перечень последовательности протеазы, происходящей из Bacillus lentus (SEQ ID NO. 1). В дальнейшем перечень последовательности выверяется по зрелому (находящемуся в состоянии зрелости) белку. Эту идентификацию следует применять, в частности, также тогда, когда в аминокислотную последовательность применяемой протеазы входит большее число аминокислотных остатков по сравнению с протеазой, происходящей из Bacillus lentus, соответственно SEQ ID NO. 1. Исходя из указанных положений в аминокислотной последовательности протеазы, происходящей из Bacillus lentus, положения аминокислот в протеазе, применяемой по настоящему изобретению, соответствуют положениям, которые соотнесены именно с этими положениями при выравнивании.

Наряду с положением 99 особенно предпочтительными положениями являются положения 3, 4, 199 и 211, идентифицируемые в выравнивании с SEQ ID NO. 1, и тем самым, в перечне последовательности соответственно SEQ ID NO. 1. В указанных положениях в молекуле протеазы естественного происхождения, происходящей из Bacillus lentus, находятся следующие аминокислотные остатки: S3, V4, V199 и L211. Таким образом, в зависимости от числа имеющихся случаев отклонения последовательности от SEQ ID NO. 1 различные максимальные степени идентичности, которыми может характеризоваться протеаза, применяемая по настоящему изобретению, по сравнению с SEQ ID NO. 1, достигаются собственно тогда, когда она по всем остальным аминокислотам должна совпадать с SEQ ID NO. 1. Это обстоятельство следует принимать во внимание в конкретном случае в отношении любой возможной комбинации изменений последовательности, предложенных по настоящему изобретению, и, кроме того, также в зависимости от длины аминокислотной последовательности протеазы. Например, максимальная идентичность при трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или девяти случаях изменения последовательности составляет 98,88, 98,51, 98,14, 97,77, 97,40, 97,03 или 96,65% в случае аминокислотной последовательности длиной в 269 аминокислот или 98,91, 98,55, 98,18, 97,82, 97,45, 97,09 или 96,73% в случае аминокислотной последовательности длиной в 275 аминокислот.

По настоящему изобретению оказалось, что благодаря добавке такой протеазы к жидкому моющему или чистящему средству, содержащему амилазу, получают жидкое моющее средство, являющееся особенно стабильным при хранении, в частности, в отношении его остаточной эффективности очистки после хранения, в частности, после хранения более предпочтительно в течение 24 часов, 48 часов, 72 часов, 5 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель или 4 недель.

Протеаза, содержащаяся в моющем или чистящем средстве по настоящему изобретению, обладает протеолитической активностью, т.е. она способна вызывать гидролиз пептидных связей полипептида или белка. Таким образом, она представляет собой фермент, который катализирует гидролиз пептидных связей и вследствие этого в состоянии расщеплять пептиды или белки. Она представляет собой предпочтительно субтилазу и более предпочтительно субтилизин.

Амилаза представляет собой фермент соответственно описанному ранее. В случае амилаз могут быть использованы синонимичные термины, например 1,4-альфа-D-глюканглюканогидролаза или гликогеназа. Приемлемые для расфасовки амилазы по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой α-амилазы. Решающим для этого является то, чтобы фермент представлял собой α-амилазу в смысле настоящего изобретения, обладающую способностью вызывать гидролиз α-(1-4)-гликозидных связей в амилозе крахмала.

Приемлемые для расфасовки амилазы по настоящему изобретению представляют собой, например, α-амилазы, происходящие из Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens или Bacillus stearothermophilus, и предпочтительно амилазы, представляющие собой при применении в моющих или чистящих средствах улучшенные дальнейшие варианты. Фермент, происходящий из Bacillus licheniformis, производится предприятием Novozymes под названием Termamyl^® и предприятием Danisco/Genencor под названием Purastar^®ST. Другие варианты этой α-амилазы производятся предприятием Novozymes под коммерческим названием Duramyl^® и Termamyl^®Ultra, предприятием Danisco/Genencor под названием Purastar^®OxAm и предприятием Daiwa Seiko Inc., Токио, Япония, в виде продукта Keistase^®. α-Амилаза, происходящая из Bacillus amyloliquefaciens, производится предприятием Novozymes под названием BAN^®, а производные варианты α-амилазы, происходящей из Bacillus stearothermophilus, под названиями BSG^® и Novamyl^® производятся также предприятием Novozymes. Приемлемой для этой цели следует отметить также α-амилазу, происходящую из Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), и циклодекстринглюканотрансферазу (CGT-азу), происходящую из Bacillus agaradherens (DSM 9948). Приемлемыми для применения являются также продукты слияния всех указанных соединений. Кроме того, приемлемыми являются другие варианты α-амилазы, происходящие из Aspergillus niger и A. oryzae и реализуемые предприятием Novozymes под коммерческим названием Fungamyl^®. Другие предпочтительно приемлемые для применения коммерческие продукты представляют собой, например, Amylase-LT^® и Stainzyme^® или Stainzyme ultra^®, или Stainzyme plus^®, причем последние производятся также предприятием Novozymes. По настоящему изобретению могут быть использованы также варианты этих ферментов, получаемые точечными мутациями. Особенно предпочтительные амилазы описаны в международных заявках WO 00/60060, WO 03/002711, WO 03/054177 и WO 07/079938, описание которых в связи с этим прямо рекомендуется и на содержание описания которых в связи с этим прямо приводятся ссылки в настоящей заявке.

Предпочтительно приемлемыми для применения в средствах по настоящему изобретению являются варианты α-амилазы, такие, как α-амилаза AA560 соответственно SEQ ID NO. 4. Следующие варианты являются особенно предпочтительными.

(a) Вариант α-амилазы, которая по сравнению с α-амилазой AA560 соответственно SEQ ID NO. 4 содержит два, три, четыре, пять или шесть следующих изменений последовательности в перечне последовательности α-амилазы AA560: R118K, D183* (делеция), G184* (делеция), N195F, R320K, R458K. Более предпочтительно вариант α-амилазы содержит все шесть указанных изменений последовательности.

(b) Вариант α-амилазы, которая по сравнению с α-амилазой AA560 соответственно SEQ ID NO. 4, содержит следующие изменения последовательности (в перечне последовательности α-амилазы AA560):

(1) M9L/M202I;

(2) M9L/M202I/M323T;

(3) M9L/M202I/M323T/M382Y;

(4) M9L/M202I/Y295F/A339S;

(5) M9L/M202I/Y295F;

(6) M9L/M202I/A339S;

(7) M9L/M202I/Y295F/A339S;

(8) M9L/M202I/Y295F/A339S/E345R;

(9) M9L/G149A/M202I/Y295F/A339S/E345R;

(10) M9L/M202L;

(11) M9L/M202L/M323T;

(12) M9L/M202L/M323T/M382Y;

(13) M9L/M202L/Y295F/A339S;

(14) M9L/M202L/Y295F;

(15) M9L/M202L/A339S;

(16) M9L/M202L/Y295F/A339S;

(17) M9L/M202L/Y295F/A339S, E345R;

(18) M9L/G149A/M202L/Y295F/A339S/E345R;

(19) M9L/M202T;

(20) M9L/M202T/M323T;

(21) M9L/M202T/M323T/M382Y;

(22) M9L/M202T/Y295F/A339S;

(23) M9L/M202T/Y295F;

(24) M9L/M202T/A339S;

(25) M9L/M202T/Y295F/A339S;

(26) M9L/M202T/Y295F/A339S/E345R;

(27) M9L/G149A/M202T/Y295F/A339S/E345R;

(28) M9L/G149A/M202I/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R;

(29) M9L/G149A/M202L/V214I/Y295F/M323T/A339S/E345R/M382Y;

(30) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/V214I/Y295F/N299Y/M323T/A339S;

(31) M9L/G149A/G182T/G186A/M202L/T257I/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R;

(32) M9L/G149A/M202L/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R;

(33) M9L/G149A/M202I/V214I/Y295F/M323T/A339S/E345R/M382Y;

(34) M9L/G149A/G182T/G186A/M202L/V214I/Y295F/N299Y/M323T/A339S;

(35) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/T257I/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R;

(36) M9L/G149A/M202I/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R/N471E;

(37) M9L/G149A/M202L/V214I/Y295F/M323T/A339S/E345R/M382Y/N471E;

(38) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/V214I/Y295F/N299Y/M323T/A339S/N471E;

(39) M9L/G149A/G182T/G186A/M202L/T257I/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R/N471E;

(40) M202L/M105F/M208F;

(41) G133E/M202L/Q361E;

(42) G133E/M202L/R444E;

(43) M202L/Y295F;

(44) M202L/A339S;

(45) M202L/M323T;

(46) M202L/M323T/M309L;

(47) M202L/M323T/M430I;

(48) M202L/V214T/R444Y;

(49) M202L/N283D/Q361E;

(50) M202L/M382Y/K383R;

(51) M202L/K446R/N484Q;

(52) M202I/Y295F;

(53) M202I/A339S;

(54) M202I/M105F/M208F;

(55) G133E/M202I/Q361E;

(56) G133E/M202I/R444E;

(57) M202I/M323T;

(58) M202I/M323T/M309L;

(59) M202I/M323T/M430I;

(60) M202I/V214T/R444Y;

(61) M202I/N283D/Q361E;

(62) M202I/M382Y/K383R;

(63) M202I/K446R/N484Q;

(64) M202V/M105F/M208F;

(65) G133E/M202V/Q361E;

(66) G133E/M202V/R444E;

(67) M202V/M323T;

(68) M202V/M323T/M309L;

(69) M202V/M323T/M430I;

(70) M202V/M323T/M9L;

(71) M202V/V214T/R444Y;

(72) M202V/N283D/Q361E;

(73) M202V/M382Y/K383R;

(74) M202V/K446R/N484Q;

(75) M202T/M105F/M208F;

(76) G133E/M202T/Q361E;

(77) G133E/M202T/R444E;

(78) M202T/Y295F;

(79) M202T/A339S;

(80) M202T/M323T;

(81) M202T/M323T/M309L;

(82) M202T/M323T/M430I;

(83) M202T/M323T/M9L;

(84) M202T/V214T/R444Y;

(85) M202T/N283D/Q361E;

(86) M202T/A339S;

(87) M202T/Y295F;

(88) M202T/N299F,Y;

(89) M202T/M382Y/K383R или

(90) M202T/K446R/N484Q.

В данном случае наиболее предпочтительными являются следующие варианты α-амилазы:

(10) M9L/M202L4;

(28) M9L/G149A/M202I/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R;

(31) M9L/G149A/G182T/G186A/M202L/T257I/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R;

(35) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/T257I/Y295F/N299Y/M323T/;

(38) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/V214I/Y295F/N299Y/M323T/;

(39) M9L/G149A/G182T/G186A/M202L/T257I/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R/N471E;

(45) M202L/M323T;

(46) M202L/M323T/M309L;

(62) M202I/M382Y/K383R;

(68) M202V/M323T/M309L;

(73) M202V/M382Y/K383R;

(82) M202T/M323T/M430I или

(84) M202T/V214T/R444Y.

(c) Вариант α-амилазы соответственно пункта (b), который дополнительно содержит все шесть изменений последовательности, указанных в пункте (a), причем в данном случае наиболее предпочтительным является вариант 31 с шестью изменениями последовательности, указанными в пункте (a).

Наиболее предпочтительным по настоящему изобретению является указанный ранее в пункте (a) вариант α-амилазы, а также указанный в пункте (c) вариант α-амилазы 31 с шестью изменениями последовательности, указанными в пункте (a).

Определение идентичности последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей осуществляют посредством сравнения последовательностей. Такое сравнение осуществляют так, чтобы сопоставлять друг с другом похожие последовательности в нуклеотидных или аминокислотных последовательностях. Это сравнение последовательностей предпочтительно осуществляют в основе разработанного и традиционно используемого на предшествующем уровне техники алгоритма BLAST (см., например, Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool.", J. Mol. Biol. 215:403-410, и Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S. 3389-3402) и принципиально реализуют так, чтобы похожие последовательности нуклеотидов или аминокислот в последовательностях нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностях сопоставлять друг с другом. Представленное в виде таблицы сопоставление соответствующих положений называют выравниванием. Другой алгоритм, применяемый на предшествующем уровне техники, представляет собой алгоритм FASTA. Сравнения последовательностей (выравнивания), в частности множественные сравнения последовательностей, как правило, осуществляют, используя компьютерные программы. Например, часто используют программу серии Clustal (см., например, Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500), T-Coffee (см., например, Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) или программы, которые базируются на этих программах или алгоритмах. По настоящему изобретению сравнения и выравнивания последовательностей предпочтительно осуществляют, используя компьютерную программу Vector NTI^® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Фарадей авеню, Карлсбад, Калифорния, США) с заданными стандартными (типовыми) параметрами.

Такое сравнение позволяет сделать оценку идентичности сравненных последовательностей относительно друг друга. Она указывается, как правило, в процентах идентичности, т.е. в доле идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков в одних и тех же положениях или в положениях, соответствующих относительно друг друга в выравнивании. Принятый далее термин "гомология" относится в случае аминокислотных последовательностей к консервативным заменам аминокислот, т.е. одной или нескольких аминокислот с похожими свойствами, так как внутри белка они отвечают большей частью за похожую активность или функции. В связи с этим идентичность сравненных последовательностей также может быть указана как процентная доля гомологичности или процентная доля идентичности. Данные по идентичности и/или гомологичности могут относиться к полипептидам или генам в целом или только к отдельным зонам. В связи с этим гомологичные или идентичные зоны различных последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей определяют по совпадениям в последовательностях. Часто они имеют одинаковые или похожие функции. Они могут иметь малый размер и содержать только немногие нуклеотиды или аминокислоты. Часто такие малые зоны исполняют функции, являющиеся существенными для общей активности белка. В связи с этим может быть рациональным связывание совпадений последовательностей только с отдельными по возможности малыми зонами. Если не указано иное, данные по идентичности или гомологичности, приведенные в настоящем описании, относятся к общей длине соответствующей указанной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения моющее или чистящее средство по настоящему изобретению, кроме того, отличается тем, что его эффективность очистки соответствует по меньшей мере эффективности моющего или чистящего средства, содержащего протеазу, которая содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO. 2 или SEQ ID NO. 3 и более предпочтительно в SEQ ID NO. 2. Эффективность очистки определяют в моющей системе, содержащей моющее средство, содержащее амилазу, с дозой в интервале от 4,0 до 11,0 г в литре моющего раствора и также протеазу, причем сравниваемые протеазы применяют с равной концентрацией (в пересчете на активный белок), а эффективность очистки от загрязнений мясным фаршем и/или яичным желтком на посуде оценивают посредством определения остатка соответствующего загрязнения после стадии мытья, причем стадию мытья осуществляют по меньшей мере в течение 30 минут, предпочтительно в течение 60 минут, при температуре 50ºC, а вода имеет жесткость в интервале от 15,5 до 16,5º dH (немецкие градусы жесткости).

В случае моющего средства для моющей системы предпочтительным является двухкомпонентное жидкое средство для машинного мытья посуды, имеющее приведенный далее состав (все данные указаны в процентах по массе).

(a) Ферментный компонент:

Основообразователь	15,0-20,0;
Cахарный спирт	8,0-12,0;
Неионогенное поверхностно-активное вещество (этоксилат жирного спирта C8-C10 с 22 звеньями EO)	3,0-5,0;
Щелочное соединение (основание)	3,0-4,0;
Борная кислота	2,5-3,5;
Фосфонат (HEDP)	1,5-2,5;
Амилаза	1,0-2,0;
Протеаза	см. текст;
Соль Ca	0,8-1,2;
Соль Zn	0,15-0,25;
Загуститель	0,8-1,2;
Краситель, отдушка, консервант	0,25-0,5;
Вода	до 100.

Амилаза предпочтительно представляет собой композицию варианта α-амилазы, которая по сравнению с α-амилазой AA560 соответственно SEQ ID NO. 4 содержит следующие изменения последовательности в перечне последовательности α-амилазы AA560: R118K, D183* (делеция), G184* (делеция), N195F, R320K, R458K (компания Novozymes).

(b) Щелочной компонент:

Основообразователь	7,5-12,5;
Карбонат натрия	7,5-12,5;
Сульфополимер	5,0-8,0;
Щелочное соединение (основание)	3,0-5,0;
Моноэтаноламин	2,0-4,0;
Фосфонат (HEDP)	2,0-5,0;
Загуститель	0,8-1,2;
Краситель, отдушка, консервант	0,25-0,5;
Вода	до 100.

Протеаза содержится в средстве с концентрацией 0,01-1% масс. и предпочтительно от 0,1 до 0,5% масс. в пересчете на активный белок. Для осуществления процесса мытья в посудомоечной машине оба компонента дозируют в равных частях (соответственно по 20 г каждого компонента). Мытье осуществляют при значениях pH в интервале от pH=9 до pH=10 в традиционной посудомоечной машине, например в посуд