Способ регулирования полового поведения и контрацепции самок млекопитающих

Способ регулирования полового поведения и контрацепции самок млекопитающих

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способу временного блокирования половых функций самок млекопитающих, включая поведенческие феномены (поиск партнера, вокализация, и т.п.). Способ предполагает одно/двухкратное введение животному фармацевтической композиции, включающей в качестве действующих веществ α-адреноблокатор, тропный к задним ядрам гипоталамуса, мелатонин и стероидное соединение с гестагенной активностью. Способ позволяет при минимальной дозе опасного для здоровья животных стероидного гормона блокировать половое поведение самок животного на срок от 2-х месяцев до полугода (в зависимости от продолжительности светового дня). Фармацевтическая композиция предназначена для трансдермального введения. Фармацевтическая композиция может быть также использована в гуманной медицине для эффективной и безопасной контрацепции, в виде удобных для применения трансдермальных дозированных спреев.

Уровень техники

Фармацевтическое воздействие на половые функции самок животных (млекопитающих) с целью достижения как контрацептивного воздействия, так и в большей степени блокады полового поведения (поиска партнера, вокализации, беспокойного поведения, агрессивности), имеет в ветеринарии большое значение. Следует заметить, что задачи фармацевтического воздействия при регуляции половых функций в ветеринарии и гуманной медицине не совпадают. Если в ветеринарии преобладает желание оказать блокирующее действие на сексуальное поведение животных, дискомфортное для их хозяев, и опосредованно при этом достигается предохранение от нежелательных беременностей; то в гуманной медицине, напротив, стараются получить эффективную контрацепцию при возможно меньших влияниях на психику женщин. К тому же, в ветеринарии большой проблемой является оральное введение препаратов возбужденным животным, зачастую вообще отказывающихся от пищи. Принудительное оральное введение препаратов часто вызывает агрессию животных, интенсивную саливацию и рвоту у животных. Поэтому в ветеринарии не получили применение популярные в гуманной медицине «многофазные» комбинации эстроген/гестаген, требующие для обеспечения надежной контрацепции ежедневного приема по определенной схеме. Наиболее широко в ветеринарии мелких домашних животных применяются хирургические методы - стерилизация, однако в отношении самок этот метод имеет ряд недостатков:

1. Полостная операция у самок травматична, сложна и небезопасна, часты осложнения, в том числе с летальными исходами; период реконвалесценции весьма велик;

2. Воздействие на организм животного необратимо, в дальнейшем получение потомства невозможно;

3. После операции в той или иной степени нежелательно изменяется поведение животного и обмен веществ в его организме. Животное становится менее активным, снижается игровая и позновательная активность, появляется склонность к ожирению и ряду сопутствующих заболеваний.

Широко применяемая в гуманной медицине при лечении гормонозависимых онкозаболеваний обратимая химическая кастрация самок млекопитающих путем введения гипоталамических релизинг-гормонов (гозерелин, бусерелин и др.) в ветеринарии мелких домашних животных практически не используется по причине сложных схем введения при отсутствии удобных ветеринарных фармацевтических форм и высокой цены процедуры, значительно превышающей цену хирургической кастрации.

Наибольшее распространение в качестве регуляторов половых функций самок животных в ветеринарии мелких домашних животных получили гестагены - в особенности те из них, которые способны оказать непосредственное и сильное влияние на гипоталамические и гипофизарные структуры, в результате чего подавляется продукция гонадотропинов и, как следствие, достигается как контрацепция, так и определенное воздействие на поведенческие феномены полового поведения самок животных. Прогестагенные соединения, способные сохранять беременность у животных после овариоэктомии и вызвать секрецию желез эндометрия, были идентифицированы, выделены в чистом виде и в конечном итоге синтезированы в первой половине 20-го века. В 1930-х годах было установлено, что внутримышечные инъекции прогестерона способны блокировать овуляцию у кроликов. Скрининг, проведенный среди прогестероноподобных соединений, способных регулировать репродуктивный цикл, привел к синтезу множества новых соединений, от которых ожидали проявления противозачаточной активности. Среди них были медроксипрогестерона ацетат (ΜΠΑ), мелен гесте рол а ацетат, мегестрола ацетат и многие другие. Многие производные прогестерона были изучены на мелких животных.

К соединениям, наиболее широко применяемым в Северной Америке, Европе и Австралии/Новой Зеландии относятся медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат и пролигестон. Реже используются и менее доступны в некоторых европейских странах коммерческие препараты таких соединений, как делмадинона ацетат.

В российской ветеринарной фармацевтике в качестве контрацептивных препаратов для мелких домашних животных наибольшее распространение получили фармацевтические композиции на основе мегестрола ацетата. Так, в патенте RU 2163809, опубл. 10.03.2001 предлагается композиция, включающая микронизированный мегестрола ацетат с размером частиц 2-30 мкм и полиэтиленгликоль-400; концентрация мегестрола ацетата в смеси от 20 до 90 г/л. Мегестрола ацетат был разработан в качестве препарата с более коротким действием, чем ΜΠΑ. Ускоренный метаболизм делает препарат более подходящим для краткосрочной, временной задержки течки и ее подавления. Побочные эффекты мегестрола ацетата со стороны матки, молочных желез и обмена веществ аналогичны таковым любого другого прогестина.

В RU 2233586, опубл. 10.08.2004 предложено применение в качестве противозачаточного (контрацептивного средства) для животных модифицированного (синтетического) гестагена в сочетании с центральным холинолитиком или адреноблокатором, в качестве последнего предложен пророксан. Однако достигаемый эффект мал (коэффициент контрацепции 55%), используемый синтетический гестаген недоступен на рынке и препарат должен вводиться орально или инъекционно длительно по сложной схеме.

Из уровня техники известно, что для мелатонина обнаружено комплексное регулирующее действие на половую сферу. В патентах RU 2067001, опубл. 27.09.1996, RU 2114621 опубл. 10.07.1998, US 4855305, опубл. 08.08.1989 предложено для достижения контрацептивного эффекта использовать сочетания мелатонин и гестаген или(и) эстроген. В этом случае сводятся к минимуму описанные выше побочные эффекты стероидных гормонов. Однако предложенные препараты требуют сложных схем применения, часто инъекционного введения, что мало приемлемо для ветеринарного использования.

Задачей предлагаемого изобретения является нахождение максимально безопасного и удобного в применении способа временного блокирования половых функций самок млекопитающих, включая поведенческие феномены (поиск партнера, вокализация, и т.п.). Технический результат данного изобретения заключается в получении высоко эффективной фармацевтической композиции для нанесения «Спот-он» в любой период полового цикла, которая позволяет легко решить вопросы изменения полового поведения самок млекопитающих.

Раскрытие изобретения

При исследовании контрацептивных эффектов сочетания мелатонина и прогестагенов с целью получения, по меньшей мере, эффекта подавления агрессивных реакций у животных, находящихся в состоянии течки, нами был дополнительно введен известный неселективный α-адреноблокатор пророксан [Машковский М.Д. Лекарственный средства / M: Новая волна. 2012], для которого описано специфическое накопление в задних ядрах гипоталамуса, сопровождающееся подавлением агрессивности и т.п. благоприятных эффектов, без проявления седативных явлений и значимых побочных эффектов. Неожиданно было обнаружено, что в этом случае течка у животных обрывается после одного/двух применений описанного выше сочетания биологически активных веществ и блокируется на срок свыше 2-х месяцев при длинном световом дне (весна) до 6-8 месяцев при воздействии на животное при коротком световом дне (осень). Параллельно подавлению течки одновременно и быстро блокируются поведенческие феномены полового поведения - поиск партнера, вокализация, агрессивность, возбуждение и т.п. Эффект развивается через 2-4 часа, что не позволяет говорить о вкладе в него используемых доз гестагена и мелатонина. Отмечено, что поведение животных приобретает ярко выраженные ювенильные особенности - активируется игровое и исследовательское поведение, животное становится дружелюбным и активным.

В качестве неселективного α-адреноблокатора можно использовать близкие по свойствам пророксан или(и) бутироксан, но несколько больший и быстрый эффект вызвал пророксан. Другие проверенные селективные и неселективные адреноблокаторы (см. пример 35) описанный эффект не вызывали.

В качестве гестагенного компонента можно использовать, любой из применяемых в практике гестагенов: мегестрола ацетат, или(и) прогестерон, или(и) оксипрогестеронакапронат, или(и) дидрогестерон, или(и) прегнин, или(и) норэтистерон, или(и) левоноргестрел, или(и) аллилэстренол, или(и) линестренол, или(и), гестоден, или(и) диеногест, или(и) дроспиренон, или(и) гестоноронакапронат, или(и) медроксипрогестерон, или(и) мепрегенола ацетат, или(и) бутират мепрегенола ацетата, или(и) гемисукцинатмепрегенола ацетат. Мегестрол ацетат имеет лишь то преимущество, что он хорошо известен в ветеринарии мелких домашних животных.

Для гестагена и α-адреноблокатора дозы не должны превышать обычно используемые терапевтические, т.к. в противном случае резко возрастает вероятность неблагоприятных побочных эффектов. Мелатонин же практически безопасен при очень значительном превышении доз.

Можно было ожидать, что мелатонин и пророксан в составе трансдермальных форм будут обладать хорошей транскутанной биодоступностью, а гестаген, количества которого в крови не критично для развития требуемого эффекта, также при определенном составе фармацевтической композиции, попадет в достаточном количестве в кровоток и окажет системное воздействие при минимальных местных эффектах. Была подобрана фармацевтическая композиция, предназначенная для трансдермального введения, содержащая (мас. %):

Гестаген	Терапевтические количества
Мелатонин	Терапевтические количества
α-Адреноблокатор, тропный к задним ядрам гипоталамуса	Терапевтические количества
N-метил-N-(1,2R,3R,4R,5S-пентагидроксигексил)-октадеканамид (Стеариламид меглюмина)	0,5
D-пантенол	0,5
полиоксиэтилированный α-токоферол	10
полиоксиэтилированный ланолин	1
3-(октадецилокси)-1,2-пропандиол (Батилол)	0,1
Карбоновая кислота	0,1÷1,1
N,N-диэтилтолуамид	15
1,2-изопропилиден глицерола	20
1,2,3-триацетоксипропан	До 100

которая обеспечила биологический эффект при введении «Спот-он», идентичный оральным способам введения, но применение препарата значительно более удобно. При этом не обнаруживается раздражения кожи, животные не ощущают момент нанесения и дискомфорт в зоне нанесения, поэтому отсутствует расчесывание и вылизывание.

Наилучшие результаты были отмечены при сочетании следующих компонентов:

Мегестрола ацетат	0,5÷2
Мелатонин	10÷20
Пророксан основание	1÷2
N-метил-N-(1,2R,3R,4R,5S-пентагидроксигексил)-октадеканамид	0,5
D-пантенол	0,5

полиоксиэтилированный α-токоферол	10
полиоксиэтилированный ланолин	1
3-(октадецилокси)-1,2-пропандиол	0,1
Стеариновая кислота	1,1
N,N-диэтилтолуамид	15
1,2-изопропилиден глицерола	20
1,2,3-триацетоксипропан	До 100

Нижние концентрации биологически активных веществ выбраны из условия минимальных количеств БАВ, вызывающих гарантированный эффект при технически допустимом объеме готовой лекарственной формы «Спот-он» для данного вида животного. Так, для кошек оптимальным является объем 0,5-2,0 мл, так как при большем объеме нанесенного «Спот-он» продукта он растекается на недопустимо большой площади и смачивает шерсть. Верхние пределы концентраций пророксана и мегестрола ацетата выбраны исходя из известных данных токсичности этих компонентов, при удобных количествах наносимой формы «Спот-он» и растворимости их в фармацевтической композиции. Верхний предел концентрации мелатонина диктуется растворимостью мелатонина в выбранном составе растворителей.

Важным также оказалось необходимость стабилизации значения pH композиции на уровне 4-6, т.к. при большем значении pH быстро разрушается БАВ (например, мегестрола ацетат), а при меньшем существует вероятность раздражения кожи животного (см. пример 38, 39). Данное значение pH легко получить необходимой добавкой при ионометрическом контроле подходящей карбоновой кислоты: глицирризиновой или(и) янтарной или(и) молочной, или(и) пировиноградной, или(и) лимонной, или(и) яблочной, или(и) винной, или(и) стеариновой, или(и) миристиновой, или(и) октановой или(и) лауриновой кислоты (см. примеры 23, 25, 31, 39 и др.) и др. Как показала практика необходимое количество карбоновой кислоты колеблется в зависимости от молекулярной массы и степени диссоциации от 0,1 до 1,1 масс %.

Приведенные биологические испытания (пример 2, 3, 35) показали, что разработанная фармацевтическая композиция при нанесении «Спот-он» в любой период полового цикла самки животного безотказно предотвращает или блокирует состояние течки и через 2-4 часа блокирует поведенческие феномены полового поведения, при этом в случае длинного светового дня (весна) эффект сохраняется не менее 2-х месяцев без повторного применения препарата, а в случае короткого светового дня (осень) - более шести месяцев, что позволяет свести к минимуму количество вводимого в организм животного стероидного гормона и, как следствие, снизить до минимума вероятность тяжелейших, часто летальных побочных эффектов, включая развитие гормонозависимых опухолей. Эффект не сопровождается проявлением «ложной беременности», что характерно для многих способов контрацепции в ветеринарии и что ведет к серьезным отклонениям в здоровье животного и требует лечения. Проявляющиеся после применения препарата ювенильные особенности поведения животного - игровое и познавательное поведение, отсутствие агрессивности - комфортно для владельцев животных.

Разработанная фармацевтическая композиция может быть применена в гуманной медицине для быстрой, безопасной и эффективной контрацепции, при этом препарат используется в виде удобного для применения трансдермального дозированного спрэя (пример 31). В отличие от известных контрацептивных средств не требуется ежедневное применение для прекоитальной контрацепции, исключается вероятность маточных кровотечений, частых при применении высокодозированных оральных посткоитальных гестагеновых контрацептивов; отсутствует вероятность развития тромбофлебитов. При этом эффект после однократного применения сохраняется не менее двух месяцев. Присутствующий в композиции мелатонин, по литературным данным [Катцунг Б.Г. Базисная и клиническая фармакология. Т. 2 / М.: Бином. 2008. 784 с], оказывает омолаживающее действие на организм женщин, улучшает эмоциональный фон, обладает сильным антиоксидантным и адаптогенным действием, нормализует сон.

Осуществление изобретения

Пример 1

В химический стакан объемом 2 л, снабженный мешалкой, вносят 394 г 1,2,3-триацетоксипропана, 150 г Ν,Ν-диэтилтолуамида, 200 г 1,2-изопропилиден глицерола, 100 г полиоксиэтилированного α-токоферола, 10 г полиоксиэтилированного ланолина, 5 г Д-пантенола, 5 г N-метил-N-(1,2R,3R,4R,5S-пентагидроксигексил)-октадеканамида и 1 г 3-(октадецилокси)-1,2-пропандиола. Перемешивают массу при подогреве до 60°С до полного растворения компонентов. Охлаждают при перемешивании до комнатной температуры. Доводят значение pH до 4,31 добавлением стеариновой кислоты при контроле ионометром с входным сопротивлением >2 ГОм. Оборачивают стакан непрозрачной фольгой. К полученному раствору добавляют 10 г пророксана, 100 г мелатонина и 10,0 г мегестрола ацетата. Перемешивают массу при подогреве до 40°С до полного растворения компонентов. Корректируют значение pH добавлением стеариновой кислоты до значения 4,34 при контроле ионометром с входным сопротивлением >2 ГОм. Общее количество стеариновой кислоты, затраченное на корректировку уровня pH, составило 11 г. При охлаждении до комнатной температуры раствор мутнеет. Получают 996 г трансдермальной композиции со следующими параметрами:

1. Описание - подвижная жидкая мутная масса желтого цвета;

2. Плотность - 1,13 г/см³;

3. pH 4,34;

4. Содержание мегестрола ацетата 11,12 мг/см³;

5. Содержание мелатонина 112,78 мг/см³;

6. Содержание пророксана 11,17 мг/см³

7. Вязкость - 4,6 сПз.

Препарат расфасовывают в пипетки из полипропилен-поливинилхлорида по 1 мл. Через два года хранения параметры препарата следующие:

1. Описание - подвижная мутная жидкая масса раствор светло-желтого цвета;

2. Плотность - 1,10 г/см³;

3. pH 4,28;

4. Содержание мегестрола ацетата 10,51 мг/см³;

5. Содержание мелатонина 111,02 мг/см³;

6. Содержание пророксана 10,67 мг/см³

7. Вязкость - 4,6 сПз.

Таким образом, препарат стабилен при хранении в естественных условиях в полимерных пипетках в течение 2-х лет.

Пример 2 (Эффекты: регулирующий половое поведение)

Испытания препарата, полученного по примеру 1, по определению регулирующего половое поведение животных, проводились на клинически здоровых фертильных кошках (в возрасте от 10 месяцев до 11 лет массой от 1,5 до 4,0 кг) и собаках (в возрасте от 10 месяцев до 10 лет массой от 4 до 27 кг)

Кошки/собаки были разделены на две группы: контрольная и опытная.

Препарат наносили однократно в вечернее время путем нанесения на сухую неповрежденную кожу в области спины между лопатками в дозе: 1 пипетка-капельница (1 мл) на животное массой менее 5 кг, 2 пипетки-капельницы - животным массой от 5 до 15 кг, 4 пипетки-капельницы животным массой 15-35 кг. При отсутствии должного эффекта в течение 24 часов, препарат наносили повторно в той же дозе. Особи контрольной группы никаких препаратов не получали.

При применении препарата побочных явлений и осложнений у животных не наблюдалось.

Результаты представлены в Таблице 1.

Пример 3 (изучение контрацептивного действия препарата)

Контрацептивное действие препарата, приготовленного по примеру 1, изучали на самках крыс, кошках и суках. Исследования проводились на базе Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства, г. Ставрополь в период со 2 июня по 30 июня 2014 г.

Самки крыс массой 200-220 г были разделены на 3 группы по 20 особей в каждой. Для исследования использовали животных клинически здоровых, предварительно выдержанных в 15-дневном карантине. Крысам первой группы препарат наносили на кожу спины в дозе 1 мл на животное 1 раз в день в течение двух суток. Через 5-7 дней к самкам подсаживали крыс-самцов. Оплодотворяемых животных определяли по наличию сперматозоидов во влагалищных мазках. В результате из 20 голов была осеменена 1 крыса. Эффект задержки охоты составил 95,0%.

Второй группе крыс с признаками течки препарат наносили в дозе 1 мл на крысу однократно. Через 5-7 суток к ним подсаживали самцов. Беременность устанавливали после вскрытия животных. Контрацептивную активность препарата рассчитывали по числу небеременных крыс из общего числа крыс, вступивших в спаривание. Из 20 крыс, установлена беременность у 1 крысы. Эффективность противозачаточного действия составила 95,0%.

Третьей группе крыс с признаками течки препарат применяли в дозе 1 мл на особь однократно. Через 2 дня после нанесения препарата к самкам подсаживали самцов. Беременность устанавливали после вскрытия животных. Контрацептивную активность препарата рассчитывали по числу небеременных крыс из общего числа крыс, вступивших в спаривание. Из 20 крыс у одной крысы установлена беременность. Эффективность противозачаточного действия составила 95,0%.

При исследовании контрацептивного действия у собак, препарат наносили однократно клинически здоровым сукам на первый/второй день проявления первых признаков половой охоты на спину вдоль позвоночника между лопатками в дозе 1 мл на 5 кг массы животного. Применение препарата привело к успокоению животных и прерыванию течки у одной собаки на 2-й день после нанесения, у двух собак - на 3-й день, у трех собак - на 5-е сутки.

При исследовании контрацептивного действия у кошек, препарат наносили однократно половозрелым клинически здоровым кошкам при первых проявлениях признаков течки на спину вдоль позвоночника между лопатками в дозе 1 мл на 5 кг массы животного. Применение препарата привело к успокоению животных и прерыванию течки у одной кошки на 3-й день после нанесения, у двух кошек - на 4-й день, у трех кошек - на 5-е сутки.

Вывод: Изучение контрацептивного действия препарата, приготовленного по примеру 1 на лабораторных животных (крысах), а также кошках и собаках, показало высокую эффективность применения данного средства для прерывания половой охоты у самок. Эффективность контрацептивного действия препарата составила 95,0%. Контрацептивный эффект препарата достаточно длителен и постоянен (группы 2 и 3 крыс); препарате целью контрацепции может применяться как до наступления течки (группа 1 крыс), так и при развитии течки (группы 2 и 3 крыс).

Пример 4 (острая токсичность)

Определение параметров острой токсичности препарата, приготовленного по примеру 1, проводили, руководствуясь «Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ», М.:«Минздрав», 2005. Параметры острой токсичности определяли на 34 белых крысах массой 180-200 г и 36 белых мышах массой 21-23 г. В опыт брали клинически здоровых животных, предварительно выдержанных в 15-дневном карантине. Статистические группы состояли из 6 животных. Препарат вводили животным внутрибрюшинно. За животными вели наблюдение в течение 2-х недель после введения, отмечая сроки гибели или выздоровления животных. Учитывали общее состояние животных, сохранение двигательных функций, аппетита, состояние шерстного покрова, дыхания, реакцию на внешние раздражители. Также проводилось изучение местного и кожно-резорбтивного действия препарата.

В опытах на мышах были испытаны дозы: 0,5; 1,0; 3,0; 5,0 и 6,0 г/кг. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Значение ЛД₅₀ составило 3,0±0,54 г/кг. С помощью графического метода анализа зависимости «доза-эффект» определили значение ЛД₁₆, ЛД₈₄ - 0,8 г/кг и 5,3 г/кг соответственно. Таким образом, согласно классификации ГОСТ 12.1.007-76 - препарат относится к умеренно токсичным соединениям (3 класс).

Аналогичный опыт проведен на белых беспородных крысах. Был испытан диапазон доз 3,0-14,0 г/кг массы тела. Результаты представлены в таблице 3

Значение ЛД₅₀ составило 9,8 г/кг. С помощью графического метода анализа зависимости «доза-эффект» определили значение ЛД₁₆ и ЛД₈₄, которое составило 6,8 г/кг и 12,3 г/кг соответственно. Таким образом, препарат можно отнести к малотоксичным соединениям (4 класс).

Полученные данные позволяют рассчитать коэффициент видовой чувствительности при однократном внутрижелудочном введении. Для исследуемого препарата коэффициент равен 3,1, что свидетельствует о средне выраженной чувствительности животных к токсическому действию препарата.

Клиническая картина отравления не зависит от вида подопытных животных и характеризуется выраженным угнетением животных, нарушением дыхания, координации движения. У животных наблюдается цианоз кожных покровов, отказ от пищи на протяжении 1-2 суток. Смерть наступала на фоне развившейся комы. Гибель животных регистрировали в течение первых двух дней. У выживших животных явления токсикоза постепенно исчезали, но шерсть оставалась неопрятной.

Кожно-резорбтивное токсическое действие препарата изучалось в однократном и повторном (в течение 5 дней) опытах на белых крысах.

Целью однократного опыта являлось определение смертельных доз и соответственно определение кожно-орального коэффициента. С этой целью препарат в объеме 1 мл (5 г/кг) наносился на выстриженный участок кожи спины крыс 2 раза в течение двух часов. Суммарная доза составила 10 г/кг. В результате клиническая картина интоксикации животных, получавших эту дозу, практически не отличалась от контроля. Животные были активны, подвижны, хорошо принимали корм. Гибели животных не отмечалось. Аналогичные опыты получены при нанесении препарата в течение пяти дней, где препарат наносился ежедневно в дозе 5,0 г/кг.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что препарат практически не обладает кожно-резорбтивной токсичностью. Не было отмечено и раздражающего действия препарата на кожу при однократном и многократном нанесении. Не наблюдалось покраснения кожи, расчесов, отека, утолщения кожной складки.

Пример 5 (переносимость препарата, собаки)

Исследование проводили на 9 суках разных пород (беспородные, колли, бультерьер, бульдог) в возрасте от 1 года до 3-х лет массой 2,0-3,5 кг. Испытуемые были поделены на три группы по три особи в каждой: одна группа контрольная, две группы - опытные. Препарат по примеру 1 наносили на кожу вдоль позвоночника животным опытных групп в дозе 1 пипетка-капельница (1 мл) на особь и 3 пипетки-капельницы (3 мл) на особь. Животные контрольной группы никаких препаратов не получали. Все животные в течение опыта содержались в одинаковых условиях. Клинические наблюдения проводили за сутки до нанесения препарата, затем через 1, 2 и 5 дней после его многократного (в течение 10 дней с перерывом третий и шестой дни) применения. Клиническое обследование животных включало измерение температуры тела, подсчета количества сердечных сокращений и дыхательных движений, визуальную оценку общего состояния и гематологические показатели. Из гематологических исследований определяли количество эритроцитов и лейкоцитов, гемоглобина. Кровь для исследований брали из подкожной вены голени. Клинические исследования и отбор крови осуществляли в одно и то же время - утром, до кормления животных.

Результаты исследования показали, что многократное нанесение препарата в терапевтической и превышающей ее в три раза дозах не вызывало никаких отклонений от нормы в физиологическом статусе животных. Температура тела варьировалась в диапазоне 38,0-38,5°С при норме 37,5-39,0°С. Частота пульса находилась в пределах колебаний от 70 до 77 ударов в минуту (норма 70-80 ударов в минуту). Количество дыхательных движений - от 15 до 30 дыхательных движений в минуту (норма 10-30). Общее состояние животных опытных групп не отличалось от состояния контрольных особей.

Исследования показали, что препарат по примеру 1 при многократном (в течение 10 дней, с перерывом на третий и шестой дни) нанесении сукам разных пород и возрастных групп в терапевтической дозе и превышающей терапевтическую дозу в три раза хорошо переносится животными, не оказывает отрицательного влияния на физиологическое состояние организма и гематологические показатели (таблица 4). Трехкратная доза нанесения препарата вызывает угнетение и отказ от корма в последние два дня применения препарата.

Вывод: препарат по примеру 1 в терапевтической, а также в 3 раза увеличенной дозе не оказывает отрицательного влияния на клиническое состояние и гематологические показатели сук.

Пример 6 (переносимость препарата, кошки)

С целью изучения переносимости препарата по примеру 1 были проведены испытания на 9 кошках длинношерстных и короткошерстных в возрасте от 15 месяцев до 3,5 лет массой 2,5-5,0 кг. Кошки были разделены на три группы по три особи в каждой: контрольная группа и две опытные. Животным первой опытной группе препарат наносили на кожу спины в дозе 1 пипетка-капельница (1 мл) на особь ежедневно в течение 8 дней с перерывом на третий и шестой дни; животным второй группы препарат наносили в дозе 3 пипетки-капельницы (3 мл) ежедневно в течение 8 дней с перерывом на третий и шестой дни. Кошкам контрольной группы никаких препаратов не применяли. Все животные в течение опыта содержались в одинаковых условиях.

Клинические наблюдения проводили за сутки до применения препарата, через 1, 6, 12 часов и 1, 2, 5 дней после окончания применения препарата. Обследование животных включало клинический осмотр, измерение температуры тела, частоты пульса и дыхания, а также гематологические и биохимические показатели крови. Из гематологических показателей определяли количество эритроцитов и лейкоцитов, гемоглобина, лейкоцитарную формулу. Кровь для исследований брали из подкожной вены голени. Клинические исследования и отбор крови осуществляли в одно и то же время - утром, до кормления животных.

Как показали результаты опытов, кошки хорошо переносят препарат при его многократном применении в терапевтической дозе и превышающей ее дозе в 3 раза. Никаких отклонений от нормы в физиологическом статусе животных не отмечалось, аппетит сохранен, температура тела варьировалась от 38,5 до 39,0°С, частота пульса находилась в пределах 100-110 ударов в минуту (норма 100-125), частота дыхания 20-25 дыхательных движений в минуту (норма 20-30). Общее состояние животных опытных групп не отличалось от состояния контрольных.

Препарат не вызывает изменений в гематологических и биохимических показателях крови кошек в терапевтической дозе. Трехкратное превышение терапевтической дозы приводит к незначительным изменениям в гематологических и биохимических показателях крови (см. Таблицы 5, 6).

Вывод: препарат по примеру 1 в терапевтической, а также в 3 раза увеличенной дозе не оказывает отрицательного влияния на клиническое состояние, гематологические и биохимические показатели крови кошек.

Пример 7 (субхроническая токсичность, крысы)

Исследование субхронической токсичности препарата по примеру 1 проводили на 24 белых беспородных крысах-самках. Животные были разделены на три группы по 8 особей в каждой. Животным первой опытной группы препарат наносили накожно в область спины в течение 45 дней в дозе 1/100 от ЛД₅₀ массы животного (0,09 г/кг массы тела); животным второй опытной группы - по 1/1000 от ЛД₅₀ массы животного (0,009 г/кг). Крысам контрольной группы никаких препаратов не применяли. Все животные во время исследования содержались в одинаковых условиях. Обследование животных включало клинический осмотр, измерение массы тела, а также гематологические и биохимические показатели крови, анализ мочи животных. Из гематологических исследований определяли количество эритроцитов и лейкоцитов, гемоглобина. Кровь для исследований брали из хвостовой вены. Клинические исследования и отбор крови осуществляли в одно и то же время - утром, до кормления животных.

Результаты взвешивания животных представлены в таблице 7

При изучении гематологических показателей (таблица 8) количество эритроцитов, лейкоцитов и уровень гемоглобина у подопытных животных находились на одном уровне с контролем. Отбор крови провели перед убоем крыс на 45 день наблюдений.

В таблице 8 приведены биохимические показатели крови крыс, характеризующие функциональное состояние печени.

Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), общий белок, мочевая кислота и холинэстераза у животных подопытных групп достоверно не отличались от тех же показателей контрольных животных, однако биохимические показатели у крыс, получавших препарат в дозе 0,009 г/кг, были на нижнем уровне физиологической нормы.

Таким образом, нанесение препарата в дозе 1/100 и 1/1000 от ЛД₅₀ не выявило отклонений в морфологии и биохимии крови у подопытных животных по сравнению с контролем. Препарат не оказал влияния на свертываемость крови и на функциональную деятельность печени. Анализ мочи (суточный диурез составил 4,6±0,1-5,2±0,4 мл/сутки) животных показал, что ее среднее количество, выделяемое подопытными животными, не отличается от такового контрольной группы.

Вывод: длительное применение препарата по примеру 1 в дозах 1/100 и 1/1000 от ЛД₅₀ не вызывает интоксикации у лабораторных животных и не оказывает отрицательного действия на физиологические и биохимические показатели крови.

Пример 8 (минимум мегестрола)

В химический стакан объемом 2 л, снабженный мешалкой, вносят 394 г 1,2,3-триацетоксипропана, 150 г Ν,Ν-диэтилтолуамида, 200 г 1,2-изопропилиден глицерола, 100 г полиоксиэтилированного α-токоферола, 10 г полиоксиэтилированного ланолина, 5 г Д-пантенола, 5 г N-метил-N-(1,2R,3R,4R,5S-пентагидроксигексил)-октадеканамида и 1 г 3-(октадецилокси)-1,2-пропандиола. Перемешивают массу при подогреве до 60°С до полного растворения компонентов. Охлаждают при перемешивании до комнатной температуры. Доводят значение pH до 4,29 добавлением стеариновой кислоты при контроле ионометром с входным сопротивлением >2 ГОм. Оборачивают стакан непрозрачной фольгой. К полученному раствору добавляют 10 г пророксана, 100 г мелатонина и 5,0 г мегестрола ацетата. Перемешивают массу при подогреве до 40°С до полного растворения компонентов. Корректируют значение pH добавлением стеариновой кислоты до значения 4,32 при контроле ионометром с входным сопротивлением >2 ГОм. Общее количество стеариновой кислоты, затраченное на корректировку уровня pH, составило 11 г. При охлаждении до комнатной температуры раствор мутнеет. Получают 991 г трансдермальной композиции со следующими параметрами:

1. Описание - подвижная жидкая мутная масса желтого цвета;

2. Плотность - 1,10 г/см³;

3. pH 4,31;

4. Содержание мегестрола ацетата 5,42 мг/см³;

5. Содержание мелатонина 111,03 мг/см³;

6. Содержание пророксана 11,07 мг/см³

7. Вязкость - 4,5 сПз.

Препарат расфасовывают в пипетки из полипропилен-поливинилхлорида по 1 мл. Через 2 года хранения параметры препарата следующие:

1. Описание - подвижная мутная жидкая масса раствор светло-желтого цвета;

2. Плотность - 1,11 г/см³;

3. pH 4,29;

4. Содержание мегестрола ацетата 5,04 мг/см³;

5. Содержание мелатонина 110,89 мг/см³;

6. Содержание пророксана 10,98 мг/см³

7. Вязкость - 4,5 сПз.

Пример 9 (макс