Биспецифическое одноцепочечное антитело к psmaxcd3 с межвидовой специфичностью

Биспецифическое одноцепочечное антитело к psmaxcd3 с межвидовой специфичностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к молекуле биспецифического одноцепочечного антитела, содержащего первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3 эпсилон-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, где указанный эпитоп представляет собой часть аминокислотной последовательности, входящую в группу, состоящую из SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8, и второй связывающий домен, способный связываться со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA). В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанную молекулу биспецифического одноцепочечного антитела, а также векторы и клетки-хозяева и способ его получения. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанную молекулу биспецифического одноцепочечного антитела, и медицинским применениям указанной молекулы биспецифического одноцепочечного антитела.

Т-клеточное распознавание опосредуется клонотипически распределенными альфа/бета и гамма/дельта рецепторами Т-клеток (TcR), которые взаимодействуют с пептид-нагруженными молекулами (комплекса) пептид-МНС (главный комплекс гистосовместимости) (рМНС) (Davis & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). Антиген-специфические цепи TcR не имеют доменов для сигнализации, но вместо этого соединены с консервативным мультисубъединичным сигнальным аппаратом CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967-979, Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7-27). Механизм, посредством которого лигирование TcR непосредственно обеспечивает связь с сигнальным аппаратом, остается фундаментальным вопросом в Т-клеточной биологии (Alarcon, там же; Davis, Cell 110 (2002), 285-287). Кажется очевидным, что устойчивые Т-клеточные ответы вовлекают взаимодействие корецепторов, олигомеризацию TcR и расположение комплексов TcR-pMHC более высокого порядка в иммунологическом синапсе (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224). Однако очень ранняя передача сигнала с TcR происходит в отсутствие этих событий и может вовлекать лиганд-индуцированное конформационное изменение в CD3-эпсилон (Alarcon, там же, Davis (2002), там же, Gil. J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179, Gil, Cell 109 (2002), 901-912). Эпсилон-, гамма-, дельта- и дзета-субъединицы сигнального комплекса ассоциируют друг с другом с образованием CD3-эпсилон-гамма гетеродимера, CD3-эпсилон-дельта. гетеродимера и CD3-дзета-дзета гомодимера (Call, там же). Различные исследования показали, что молекулы CD3 важны для правильной клеточно-поверхностной экспрессии альфа/бета-TcR и нормального развития Т-клеток (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447). Структура эктодоменных фрагментов мышиного CD3-эпсилон-гамма гетеродимера в растворе показала, что обе эпсилон-гамма-субъединицы представляют собой С2-подобные (C2-set) lg-домены, которые взаимодействуют друг с другом с образованием необычной димерной конфигурации по типу "side-to-side" (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Хотя цистеин-богатый стебель (stalk), по-видимому, играет важную роль в управлении димеризации CD3 (Su, там же, Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), взаимодействие с помощью внеклеточных доменов CD3-эпсилон и CD3-гамма является достаточным для сборки этих белков с TcR-бета (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92, Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). Хотя до сих пор до конца неясно, доминирующая стехиометрия TcR, скорее всего, содержит один альфа-бета TcR, один CD3-эпсилон-гамма гетеродимер, один CD3-эпсилон-дельта гетеродимер и один CD3-дзета-дзета гомородимер (Call, там же). Учитывая центральную роль человеческого CD3-эпсилон-гамма гетеродимера в иммунном ответе, недавно была выяснена кристаллическая структура этого комплекса, связанного с терапевтическим антителом OKT3 (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680).

Многие терапевтические стратегии модулируют Т-клеточный иммунитет посредством нацеливания на TcR-сигнальный путь, в частности, моноклональные антитела (mAbs) против человеческого CD3, которые широко используются клинически в иммуносупрессивных режимах. CD3-специфическое мышиное mAb OKT3 было первым mAb, лицензированным для применения у людей (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) и широко использовалось в клинике в качестве иммуносупрессивного агента при трансплантации (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430. Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), диабете 1 типа (Chatenoud (2003), там же) и псориазе (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913). Более того, анти-CD3 mAbs могут индуцировать частичную Т-клеточную сигнализацию и клональную толерантность (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). OKT3 было описано в литературе в качестве мощного Т-клеточного митогена (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18), а также мощного Т-клеточного киллера (Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). OKT3 демонстрирует обе эти активности в зависимости от времени; после ранней активации Т-клеток, приводящей к высвобождению цитокина, при дальнейшем введении OKT3 впоследствии блокирует все известные Т-клеточные функции. Именно благодаря этому позднему блокированию Т-клеточной функции, OKT3 нашло такое широкое применение в качестве иммунодепрессанта в терапевтических режимах для снижения или даже отмены реакции отторжения тканевого аллотрансплантата.

OKT3 обращает реакцию отторжения аллотрансплантата ткани, скорее всего, благодаря блокированию функции всех Т-клеток, которые играют главную роль в острой реакции отторжения. OKT3 реагирует и блокирует функцию CD3-комплекса в мембране человеческих Т-клеток, который ассоциирован с антиген-распознающей структурой Т-клеток (TCR) и имеет важное значение для трансдукции сигнала. Какая субъединица TCR/CD3 связывается OKT3, является предметом многочисленных исследований. Некоторые доказательства указали на специфичность OKT3 в отношении эпсилон-субъединицы комплекса TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). Дополнительные доказательства показали, что OKT3 связывание комплекса TCR/CD3 требует присутствия других субъединиц этого комплекса (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

Другие хорошо известные антитела, специфичные в отношении молекулы CD3, перечислены в Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50. Как указано выше, такие CD3-специфические антитела способны индуцировать различные Т-клеточные ответы, такие как продукция лимфокинов (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337), пролиферация (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) и индукция супрессора Т-клеток (Kunicka, в "Lymphocyte Typing II" 1 (1986), 223). То есть, в зависимости от условий эксперимента, CD3-специфическое моноклональное антитело может либо ингибировать, либо индуцировать цитотоксичность (Leewenberg, J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

Хотя многие из CD3 антител, описанных в данной области техники, как сообщается, распознают CD3-эпсилон субъединицу CD3-комплекса, многие из них связываются фактически с конформационными эпитопами и, таким образом, распознают только CD3-эпсилон в нативном окружении TCR. Конформационные эпитопы характеризуются наличием двух или более отдельных аминокислотных остатков, которые разделены в первичной последовательности, но собираются вместе на поверхности молекулы, когда полипептид сворачивается в нативный белок/антиген (Sela, (1969) Science 166, 1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Конформационные эпитопы, связывающиеся CD3-эпсилон антителами, описанными в данной области техники, можно разделить на две группы. В основной группе указанные эпитопы образуются двумя субъединицами CD3, например, CD3-эпсилон цепью и CD3-гамма или CD3-дельта цепью. Например, в нескольких исследованиях было обнаружено, что наиболее широко используемые CD3-эпсилон моноклональные антитела OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 и Leu-4 не связываются с клетками, однократно трансфицированными CD3-эпсилон цепью. Однако эти антитела окрашивали клетки, трансфицированные комбинацией CD3-эпсилон плюс либо CD3-гамма, либо CD3-дельта (Tunnacliffe, там же; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). Во второй меньшей группе конформационный эпитоп образуется в пределах самой CD3-эпсилон-субъединицы. Членом этой группы является, например, mAb АРА 1/1, которое было получено против денатурированной CD3-эпсилон (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Взятые вместе, большинство CD3-эпсилон антител, описанных в данной области техники, распознают Конформационные эпитопы, локализованные на двух или более субъединицах CD3. Отдельные аминокислотные остатки, образующие третичную структуру этих эпитопов, таким образом, могут быть локализованы либо на самой CD3-эпсилон-субъединице, либо на CD3-эпсилон-субъединице и других субъединицах CD3, таких как CD3-гамма или CD3-дельта.

Другая проблема в отношении CD3 антител заключается в том, что многие CD3 антитела, как было обнаружено, являются видоспецифическими. Анти-CD3 моноклональные антитела - что справедливо для любых других моноклональных антител - функционируют путем высокоспецифического распознавания их целевых молекул. Они распознают только один сайт или эпитоп на их целевой молекуле CD3. Например, одним из наиболее широко используемых и лучше всего охарактеризованных моноклональных антител, специфичных в отношении CD3-комплекса, является OKT-3. Это антитело взаимодействует с CD3 шимпанзе, но не с гомологом CD3 других приматов, таких как макаки или с CD3 собаки (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). Аналогично, в WO 2005/118635 или WO 2007/033230 описаны моноклональные антитела к CD3-эпсилон человека, которые взаимодействуют с CD3-эпсилон человека, но не с CD3-эпсилон мыши, крысы, кролика или приматов, не являющихся шимпанзе, таких как макак-резус, яванский макак или бабуин. Анти-CD3 моноклональное антитело UCHT-1 также реагирует с CD3 шимпанзе, но не с CD3 макаков (собственные данные). С другой стороны, существуют также примеры моноклональных антител, которые распознают антигены макаков, но не их человеческие аналоги. Одним примером из этой группы является моноклональное антитело FN-18, направленное на CD3 макак (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). Примечательно, что, как обнаружили, лимфоциты периферической крови от примерно 12% яванских макаков лишены способности взаимодействовать с моноклональным антителом (FN-18) против CD3 макака-резуса из-за полиморфизма антигена CD3 у макак. Uda и др. описали замену двух аминокислот в последовательности CD3 яванских макак, которые не взаимодействуют с антителами FN-18, по сравнению с CD3, происходящими от других животных, которые взаимодействуют с антителами FN-18 (Uda et al., J Med. Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J. Med. Primatol. 33 (2004), 34-7).

Избирательная способность, т.е. видовая специфичность, свойственная не только моноклональным антителам (и их фрагментам) против CD3, но и моноклональным антителам в целом, является существенным препятствием для их разработки в качестве терапевтических агентов для лечения заболеваний человека. Для того чтобы получить разрешение на продажу, любое новое лекарственное средство-кандидат должно пройти через строгое тестирование. Это тестирование можно подразделить на доклиническую и клиническую фазы: в то время как последнюю, дополнительно подразделяемую на общеизвестные клинические фазы I, II и III, проводят на пациентах-людях, предшествующую проводят на животных. Цель доклинического тестирования заключается в доказательстве того, что лекарственное средство-кандидат обладает желаемой активностью и, что наиболее важно, является безопасным. Только после установления на животных безопасности и возможной эффективности лекарственного средства-кандидата в доклиническом тестировании, это лекарственное средство-кандидат будет одобрено соответствующим контролирующим органом для клинического тестирования на людях. Лекарственные средства-кандидаты могут быть протестированы в отношении безопасности на животных следующими тремя путями: (1) на релевантном виде, т.е. виде, у которого лекарственные средства-кандидаты могут распознавать ортологичные антигены, (2) на трансгенном животном, содержащем человеческие антигены, и (3) путем использования имитатора лекарственного средства-кандидата, который может связываться с ортологичными антигенами, присутствующими в животном. Ограничения, касающиеся трансгенных животных, заключаются в том, что эта технология обычно ограничивается грызунами. Между грызунами и человеком имеются существенные различия в физиологии и результаты по безопасности нельзя с легкостью экстраполировать на людей. Ограничения, касающиеся имитатора лекарственного средства-кандидата, заключаются в иной композиции вещества по сравнению с реальным лекарственным средством-кандидатом, и зачастую используемыми животными являются грызуны с тем ограничением, которое рассмотрено выше. Таким образом, доклинические результаты, полученные на грызунах, обладают ограниченной прогностической ценностью в отношении лекарственного средства-кандидата. Подход к выбору тестирования безопасности состоит в использовании релевантного вида, предпочтительно низшего примата. В настоящее время ограничение, касающееся моноклональных антител, подходящих для терапевтического вмешательства у людей и описанных в данной области техники, заключается в том, что релевантными видами являются высшие приматы, в частности, шимпанзе. Шимпанзе считаются вымирающим видом, и вследствие их человекоподобной природы, использование таких животных для тестирования безопасности лекарственных средств запрещено в Европе и строго ограничено в других странах. CD3 также был с успехом использован в качестве мишени для биспецифических одноцепочечных антител для того, чтобы перенаправить цитотоксические Т-клетки на патологические клетки, приводя к истощению больных клеток в соответствующем организме (WO 99/54440; WO 04/106380). Например, Bargou et al. (Science 321 (2008):974-7) недавно сообщил о клинической активности биспецифической антительной конструкции CD19xCD3, называемой блинатумомабом, которая обладает потенциалом к привлечению всех цитотоксических Т-клетков для лизиса раковых клеток у пациентов-людей. Дозы уже 0,005 миллиграммов на квадратный метр в сутки у больных с неходжкинской лимфомой приводили к ликвидации клеток-мишеней в крови. Частичная и полная регрессия опухоли впервые была обнаружена при дозовом уровне 0,015 миллиграммов, и все семь пациентов, которых лечили дозой 0,06 миллиграммов, испытали регрессию опухоли. Блинатумомаб также приводит к клиренсу опухолевых клеток из костного мозга и печени. Хотя это исследование обосновало клиническое доказательство концепции терапевтической эффективности формата биспецифического одноцепочечного антитела в лечении рака, происходящего из клеток крови, существует потребность в успешных концепциях лечения других типов рака.

В 2008 г. у 186320 мужчин будет впервые диагностирован рак предстательной железы в США и около 28660 мужчин умрут от этой болезни. Самый последний доклад о смертности от рака показал, что в 2004 г. общая смертность от рака предстательной железы среди американских мужчин составляла 25 на 100000 мужчин. В конце 1980-х гг. широкое внедрение теста на специфический антиген предстательной железы (PSA) стало основным усовершенствованием в управлении раком предстательной железы. В этом тесте измеряют количество белка PSA в крови, которое часто повышено у пациентов с раком предстательной железы. В 1986 г. Управление США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств одобрило применение теста на PSA для мониторинга пациентов с раком предстательной железы и в 1994 г.дополнительно одобрило его применение в качестве скринингового теста для этого заболевания. Благодаря широкому внедрению PSA тестирования в США, приблизительно 90 процентов всех случаев рака предстательной железы в настоящее время диагностируют на ранней стадии и, следовательно, мужчины дольше живут после постановки диагноза. Однако результаты двух продолжающихся клинических испытаний: NCI-спонсируемого скринингового испытания в отношении предстательной железы, легких, толстой кишки и яичника (PLCO) и Европейского скринингового исследования рака предстательной железы (ERSPC), необходимы для определения того, действительно ли скрининг PSA сохраняет жизни. В продолжающихся клинических испытаниях в течение последних 25 лет исследовали эффективность природных и синтетических соединений в профилактике рака предстательной железы. Например, в испытании по предотвращению рака предстательной железы (РСРТ), в котором приняли участие около 19000 здоровых мужчин, обнаружили, что финастерид - препарат, одобренный для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН), которая представляет собой доброкачественное увеличение предстательной железы, снижает риск развития рака предстательной железы на 25 процентов. В другом испытании по предупреждению рака с помощью селена и витамина Е (SELECT) исследуют более 35000 мужчин для определения того, могут ли ежедневные добавки селена и витамина Е снижать частоту возникновения рака предстательной железы у здоровых мужчин. В других испытаниях по предупреждению рака предстательной железы в настоящее время оценивают защитный потенциал поливитаминов, витаминов С и D, сои, зеленого чая и ликопина, который является природным соединением, обнаруженным в томатах. Одно исследование, опубликованное в 2005 г., показало, что определенные гены слиты в 60-80 процентах проанализированных опухолей предстательной железы. Это исследование представляет собой первое наблюдение неслучайных перегруппировок генов при раке предстательной железы. Это генетическое изменение со временем может быть использовано в качестве биомаркера, способного помочь в диагностике и, возможно, лечении этого заболевания. Другие исследования показали, что генетические вариации в конкретном районе хромосомы 8 может увеличить риск развития рака предстательной железы у мужчин. Эти генетические вариации являются причиной приблизительно 25 процентов случаев рака предстательной железы, которые наблюдаются у белых мужчин. Они являются первыми подтвержденными генетическими вариантами, которые увеличивают риск развития рака предстательной железы и могут помочь ученым лучше понять генетические причины этого заболевания. Также имеется продолжающееся исследование, в котором изучают, как белки, циркулирующие в крови пациента, могут быть использованы для улучшения диагностики рака предстательной железы и Других видов рака. В 2005 г. ученые идентифицировали группу специфических белков, которые продуцируются иммунной системой пациента в ответ на опухоли предстательной железы. Эти белки типа аутоантител были способны обнаружить присутствие клеток рака предстательной железы в образцах крови с точностью больше чем 90 процентов. При использовании в комбинации с PSA, эти и другие белки крови можно в конечном счете использовать для уменьшения числа ложно-положительных результатов, полученных с тестированием только PSA и, следовательно, сократить большое число ненужных биопсий предстательной железы, которые выполняют каждый год из-за ложно-положительных результатов PSA теста.

Кроме PSA было идентифицировано несколько других маркеров рака предстательной железы, включая, например, шестидоменный трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы (STEAP) (Hubert et al., PNAS 96 (1999), 14523-14528), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA) (Reiteret al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95:1735-1740, 1998) и специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA; PSM) (Israeli et al., Cancer Res. 53 (1993). PSMA был первоначально определен с помощью моноклонального антитела (MAb) 7E11, полученного в результате иммунизации частично очищенным мембранным препаратом из клеточной линии лимфатических узлов аденокарциномы предстательной железы (LNCaP) (Horoszewicz et al., Anticancer Res. 7 (1987), 927-35). Фрагмент кДНК длиной 2,65 т.п.н., кодирующий белок PSMA, клонировали, а затем картировали на хромосоме 11р11.2 (Israeli et al., там же; O’Keefe et al., Biochem. Biophys. Acta 1443 (1998), 113-127). Первоначальный анализ PSMA продемонстрировал повсеместную экспрессию в пределах клеток секреторного эпителия предстательной железы. Иммуногистохимическое окрашивание продемонстрировало умеренную экспрессию PSMA в гиперплазированных и доброкачественных тканях, в то время как злокачественные ткани окрашивались с наибольшей интенсивностью (Horoszewicz et al., там же). Последующие исследования воспроизвели эти результаты и доказали, что экспрессия PSMA является универсальным признаком практически в каждой ткани предстательной железы, проанализированной на сегодняшний день. Эти сообщения дополнительно демонстрируют, что экспрессия PSMA резко увеличивается пропорционально агрессивности опухоли (Burger et al., Int. J. Cancer 100 (2002), 228-237; Chang et al., Cancer Res. 59 (1999), 3192-98; Chang et al., Urology 57 (2001), 1179-83), Kawakami and Nakayama, Cancer Res. 57 (1997), 2321-24; Liu et al., Cancer Res. 57 (1997), 3629-34; Lopes et al., Cancer Res. 50 (1990), 6423-29; Silver et al., Clin. Cancer Res. 9 (2003), 6357-62; Sweat et al., Urology 52 (1998), 637-40; Troyer et al., Int. J. Cancer 62 (1995), 552-558; Wright et al., Urology 48 (1996), 326-334). В соответствии с корреляцией между экспрессией PSMA и опухолевой стадией, повышенные уровни PSMA связаны с андроген-независимым раком предстательной железы (РСа). Анализ образцов тканей пациентов с раком предстательной железы продемонстрировал повышенные уровни PSMA после физической кастрации или андроген-депривационной терапии. В отличие от экспрессии специфического антигена предстательной железы, которая подавляется после удаления андрогенов, экспрессия PSMA значительно увеличивается как в первичных, так и в метастатических образцах опухолей (Kawakami et al., Wright et al., там же). В соответствии с повышенной экспрессией PSMA в андроген-независимых опухолях, также известно, что транскрипция PSMA подавляется стероидами, и введение тестостерона опосредует резкое снижение уровней белка PSMA и мРНК (Israeli et al., Cancer Res. 54 (1994), 1807-11; Wright et al., там же). PSMA также имеет высокий уровень экспрессии во вторичных опухолях предстательной железы и скрытом метастатическом заболевании. Иммуногистохимический анализ выявил относительно интенсивную и гомогенную экспрессию PSMA в пределах метастатических поражений, локализованных в лимфатических узлах, костях, мягких тканях и легких, по сравнению с доброкачественными тканями предстательной железы (Chang et al. (2001), там же; Murphy et al., Cancer 78 (1996), 809-818; Sweat et al., там же). Некоторые сообщения также показали ограниченную экспрессию PSMA в экстрапростатических тканях, включая субпопуляцию проксимальных почечных канальцев, некоторые клетки мембраны щеточной каемки кишечника и некоторые клетки крипт толстой кишки (Chang et al. (1999), Horoszewicz et al., Israeli et al. (1994), Lopes et al., Troyer et al., там же). Однако уровни PSMA в этих тканях, как правило, на два или три порядка меньше величин, наблюдаемых в предстательной железе (Sokoloff et al., Prostate 43 (2000), 150-157). PSMA, также экспрессирующийся в опухолеассоциированных новообразованных сосудах большинства солидных опухолей, исследованных на данный момент, отсутствует в нормальном сосудистом эндотелии (Chang et al. (1999), Liu et al., Silver et al., там же). Хотя значение экспрессии PSMA в сосудистой системе неизвестно, специфичность опухолеассоциированного эндотелия делает PSMA потенциальной мишенью для лечения многих форм злокачественных опухолей.

Хотя было затрачено много сил на идентификацию новых мишеней для подходов к лечению рака, рак до сих пор является одним из наиболее часто диагностируемых заболеваний. В свете этого, существует потребность в эффективных способах лечения рака.

В настоящем изобретении предложена молекула биспецифического одноцепочечного антитела, содержащая первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε (эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, где указанный эпитоп представляет собой часть аминокислотной последовательности, входящей в группу, состоящую из SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8; и второй связывающий домен, способный связываться со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA).

Хотя вовлекающие Т-клетки биспецифические одноцепочечные антитела, описанные в данной области техники, имеют большой терапевтический потенциал для лечения злокачественных заболеваний, большинство этих биспецифических молекул ограничены тем, что они являются видоспецифическими и распознают только человеческий антиген и - благодаря генетическому сходству - вероятно, аналогичный антиген шимпанзе. Преимуществом настоящего изобретения является обеспечение биспецифического одноцепочечного антитела, содержащего связывающий домен, демонстрирующий межвидовую специфичность к CD3-эпсилон цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе.

В настоящем изобретении неожиданно идентифицировали N-концевой 1-27-аминокислотный полипептидный фрагмент внеклеточного домена CD3-эпсилон, который, в отличие от всех других известных эпитопов CD3-эпсилон, описанных в данной области техники, сохраняет свою трехмерную структурную целостность, если он извлечен из своего нативного окружения в CD3-комплексе (и возможно слит с гетерологичной аминокислотной последовательностью, такой как ЕрСАМ или Fc-часть иммуноглобулина). Таким образом, в настоящем изобретении предложена молекула биспецифического одноцепочечного антитела, содержащая первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом N-концевого 1-27 аминокислотного полипептидного фрагмента внеклеточного домена CD3-эпсилон (который (CD3-эпсилон) извлечен, например, из своего природного окружения и/или содержится (представлен на поверхности) Т-клетки) человека и по меньшей мере одной CD3-эпсилон цепи примата, не являющегося шимпанзе, где указанный эпитоп представляет собой часть аминокислотной последовательности, входящей в группу, состоящую из SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8; и второй связывающий домен, способный связываться со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA). Предпочтительные приматы, не являющиеся шимпанзе, упомянуты в данной заявке ниже. По меньшей мере один (их группа или все) примат(ы), выбранный(е) из обыкновенной игрунки (Callithrix jacchus); эдипова тамарина (Saguinus oedipus), обыкновенной беличьей обезьяны (Saimiri sciureus) и длиннохвостого (яванского) макака (Масаса fascicularis) (либо SEQ ID 631, либо 632, либо обе), является (являются) особенно предпочтительным(и). Масаса mulatta, также известный как макак-резус, также рассматривается в качестве другого предпочтительного примата. Таким образом, предполагается, что антитела по изобретению связываются (способны связываться) с независимым от окружения эпитопом N-концевого 1-27-аминокислотного полипептидного фрагмента внеклеточного домена CD3-эпсилон человека и обыкновенной игрунки (Callithrix jacchus), эдипова тамарина (Saguinus oedipus), обыкновенной беличьей обезьяны (Saimiri sciureus) и длиннохвостого макака (Масаса fascicularis) (либо SEQ ID 631, либо 632, либо обе), и возможно также макака-резуса (Масаса mulatta). Молекула биспецифического одноцепочечного антитела, содержащая первый связывающий домен, как определено здесь, может быть получено (можно получить) или может быть изготовлено в соответствии с протоколом, изложенным в WO 2008/119567 (в частности, в Примере 2 WO 2008/119567). С этой целью предусматривается: (а) иммунизация мышей N-концевым 1-27-аминокислотным полипептидным фрагментом внеклеточного домена CD3-эпсилон человека и/или обыкновенной беличьей обезьяны (Saimiri sciureus); (б) получение иммунной библиотеки мышиных антител scFv; (в) идентификация CD3-эпсилон-специфических связывающих агентов посредством тестирования способности связываться по меньшей мере с SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8.

Независимый от окружения эпитоп CD3, предложенный в данном изобретении, соответствует первым 27 N-концевым аминокислотам CD3-эпсилон или функциональным фрагментам этого 27-аминокислотного участка. Фраза "независимый от окружения", как использовано здесь в отношении эпитопа CD3, означает, что связывание описанных в данном изобретении связывающих молекул/молекул антител не приводит к изменению или модификации конформации, последовательности или структуры, окружающей антигенную детерминанту или эпитоп. В отличие от этого, эпитоп CD3, распознаваемый обычной CD3-связывающей молекулой (например, описанной в WO 99/54440 или WO 04/106380), локализован на С-конце CD3-эпсилон цепи относительно N-концевых 1-27 аминокислот независимого от окружения эпитопа, где он принимает правильную конформацию только в том случае, если погружен в остальную часть эпсилон-цепи и удерживается в правильном стерическом положении посредством гетеродимеризации эпсилон-цепи либо с CD3-гамма-, либо дельта-цепью.

Анти-CD3-связывающие домены, как часть биспецифической одноцепочечной молекулы к PSMAxCD3, предложенной в данном изобретении, были описаны в WO 2008/119567. Эти связывающие домены, полученные (и направленные) против независимого от окружения эпитопа CD3, обеспечивают неожиданное клиническое улучшение в отношении перераспределения Т-клеток и, таким образом, более благоприятный профиль безопасности. Не вдаваясь в теорию, поскольку эпитоп CD3 является независимым от окружения, образуя автономный самодостаточный субдомен без существенного влияния на остальную часть CD3-комплекса, CD3-связывающий домен биспецифической одноцепочечной молекулы к PSMAxCD3, предложенной в данной заявке, индуцирует меньше аллостерических изменений в конформации CD3, чем традиционные CD3-связывающие молекулы (подобные молекулам, предложенным в WO 99/54440 или WO 04/106380), которые распознают зависимые от окружения эпитопы CD3.

Независимость от окружения эпитопа CD3, который распознается CD3-связывающим доменом биспецифического одноцепочечного антитела к PSMAxCD3 по изобретению, связана с меньшим или полным отсутствием перераспределения Т-клеток (перераспределение Т-клеток соответствует начальному падению и последующему восстановлению абсолютного числа Т-клеток) во время начальной фазы лечения указанным биспецифическим одноцепочечным антителом к PSMAxCD3 по изобретению. Это приводит к лучшему профилю безопасности биспецифического одноцепочечного антитела к PSMAxCD3 no изобретению по сравнению с традиционными CD3-связывающими молекулами, известными в данной области техники, которые распознают зависимые от окружения эпитопы CD3. В частности, поскольку перераспределение Т-клеток во время начальной фазы лечения с помощью CD3-связывающих молекул является основным фактором риска побочных событий, таких как побочные эффекты в отношении ЦНС (центральная нервная система), биспецифическое одноцепочечное антитело к PSMAxCD3 по изобретению посредством распознавания независимого от окружения, а не зависимого от окружения эпитопа CD3, имеет существенное преимущество безопасности по сравнению с CD3-связывающими молекулами, известными в данной области техники. Пациенты с такими побочными эффектами в отношении ЦНС, связанными с перераспределением Т-клеток во время начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами, обычно страдают от спутанности сознания и дезориентации, в некоторых случаях также от недержания мочи. Спутанность сознания представляет собой изменение психического состояния, при котором пациент не способен думать с обычным для него или для нее уровнем ясности. Пациенту обычно трудно сконцентрироваться и его мышление является не только размытым и неясным, но часто значительно замедленным. Пациенты с побочными эффектами в отношении ЦНС, связанными с перераспределение Т-клеток во время начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами, также могут страдать от потери памяти. Часто спутанность сознания приводит к потере способности узнавать людей, места, время или дату. Чувство дезориентации является характерным для спутанности сознания, при этом нарушается способность принимать решения. Побочные эффекты в отношении ЦНС, связанные с перераспределением Т-клеток во время начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами, могут дополнительно включать несвязную речь и/или трудности в поиске слов. Это расстройство может привести к нарушению как выражения, так и понимания языка, а также чтения и записи. Кроме недержания мочи, вертиго и головокружение также могут сопровождать побочные эффекты в отношении ЦНС, связанные с перераспределением Т-клеток во время начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами у некоторых пациентов.

Сохранение трехмерной структуры в пределах упомянутого 27-аминокислотного N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон можно использовать для получения предпочтительно человеческих связывающих доменов, которые способны связываться с N-концевым полипептидным фрагментом CD3-эпсилон in vitro и с нативным (CD3-эпсилон субъединица) CD3-комплексом на Т-клетках in vivo с одинаковой аффинностью связывания. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что N-концевой фрагмент, как описано в данном изобретении, образует третичную конформацию, которая сходна со структурой, в норме существующей in vivo. Был выполнен очень чувствительный тест на значение структурной целостности аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон. Отдельные аминокислоты из аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон заменяли на аланин (сканирование аланином) для тестирования чувствительности аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон к незначительным нарушениям. CD3-специфические связывающие домены как часть биспецифического одноцепочечного антитела к PSMAxCD3 по изобретению использовали для тестирования связывания с аланин-мутантами аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон (см. WO 2008/119567). Отдельные обмены первых пяти аминокислотных остатков в самом N-концевом фрагменте и двух аминокислот в положениях 23 и 25 аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон имели критическое значение для связывания молекул антитела. Замена аминокислотных остатков в районе положения 1-5, содержащем остатки Q (глутамин в положении 1), D (аспарагиновая кислота в положении 2), G (глицин в положении 3), N (аспарагин в положении 4), и Е (глутаминовая кислота в положении 5) на аланин ликвидировала связывание предпочтительно человеческого биспецифического одноцепочечного антитела к PSMAxCD3 по изобретению с указанным фрагментом. Наряду с тем, для по меньшей мере некоторых из биспецифических одноцепочечных антител к PSMAxCD3 по изобретению предпочтительно человеческого биспецифического одноцепоческого антитела к PSMAxCD3, два аминокислотных остатка на С-конце упомянутого фрагмента Т (треонин в положении 23) и 1 (изолейцин в положении 25) уменьшали энергию связывания с предпочтительно человеческим биспецифическим одноцепочечным антителом к PSMAxCD3 по изобретению.

Неожиданно обнаружили, что выделенное таким образом предпочтительно человеческое биспецифическое одноцепочечное антитело к PSMAxCD3 по изобретению распознает не только человеческий М-концевой фрагмент CD3-эпсилон, но также соответствующие гомологичные фрагменты CD3-эпсилон различных приматов, включая обезьян Нового Света (игрунковые, обыкновенная игрунка {Callithrix jacchus); эдипов тамарин (Saguinus oedipus); обыкновенная беличья обезьяна (Saimiri sciureus)) и обезьян Старого Света (длиннохвостый макак (Масаса fascicularis), также известный как яванский макак; или Масаса mulatta, также известный как макак-резус). Таким образом, обнаружили специфичность биспецифического одноцепочечного антитела к PSMAxCD3 по изобретению в отношении множества приматов. Следующие анализы последовательности подтвердили, что человек и приматы имеют общий участок с высоко гомологичной последовательностью на N-конце внеклеточного домена CD3-эпсилон.

Аминокислотная последовательность вышеупомянутых N-концевых фрагментов CD3-эпсилон представлена в SEQ ID NO:2 (человек), SEQ ID NO:4 (обыкновенная игрунка (Callithrix jacchus)); SEQ ID NO:6 (эдипов тамарин (Saguinus oedipus)); SEQ ID NO:8 (обыкновенная беличья обезьяна (Saimiri sciureus)); SEQ ID NO:631 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTILTC или SEQ ID NO:632 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT (Масаса fascicularis, также известный как яванский макак, или макак-крабоед (Cynomolgus monkey)) и SEQ ID NO:633 QDGNEEMGSITQTPYHVSISGTTVILT (Масаса mulatta, также известный как макак-резус).

Второй связывающий домен биспецифического одноцепочечного антитела к PSMAxCD3 по изобретению связывается со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA). Предпочтительно, второй связывающий домен биспецифического одноцепочечного антитела к PSMAxCDS связывается с человеческим PSMA или PSMA примата, не являющегося шимпанзе; более предпочтительно он связывается с человеческим PSMA и PSMA примата, не являющегося шимпанзе, и, следовательно, обладает межвидовой специфичностью; еще более предпочтительно с человеческим PSMA и PSMA макака (и, следовательно, также обладает межвидовой специфичностью). Особенно предпочтительно, PSMA макака представляет собой PSMA яванского макака и/или PSMA макака-резуса. Однако из объема настоящего изобретения не исключено, что второй связывающий домен также может связываться с гомологами PSMA из других видов, таких как гомолог PSMA у грызунов.

Рак пр