Штамм бактерий stenotrophomonas maltophilia - деструктор нефти и нефтепродуктов

Штамм бактерий stenotrophomonas maltophilia - деструктор нефти и нефтепродуктов

Реферат

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в широком диапазоне температур от +5 до +37°С.

В настоящее время загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами является одной из актуальных проблем. Ежегодно в России происходит в среднем около 20 тысяч инцидентов, связанных с попаданием нефти и нефтепродуктов в почвы и открытые водоемы. При масштабных разливах загрязнения распространяются на сопредельные территории, в результате нарушенные земли на долгие годы выводятся из хозяйственного оборота. Из многочисленных методов, которые позволяют сократить сроки реабилитации нефтезагрязненных почв, наиболее оправданными и экологичными считаются биологические способы, основанные на интенсификации микробиологической деструкции нефтяных углеводородов (см. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В. и др. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология, 1997. Т.33. №2. – С.198-201).

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас.% каждого микроорганизма (см. RU № 2191643, МПК B09C1/10, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:01, опубл. 27.10.2002).

Недостатком известного решения является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18…+22ºС, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+5ºС).

Известны штаммы: Acinetronacter sp. HB-1 (см. RU № 2077579, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12R1:01, C12N1/20, B09C101:00, опубл. 20.04.1997); Pseudomonas putida 36 (см. SU № 1076446, МПК C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20 C02F3/34, C02F101:32, C12N1/20, C12R1:40, опубл. 28.02.1984); Pseudomonas alcaligenes E7 (см. RU № 2134723, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20, C12R1:38, опубл. 20.08.1999).

Недостатком известных штаммов является то, что они также утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52, предназначенный для биоочистки сточных вод (см. KZ № 27045, МПК C12N 1/20, C12N 9/56, C12R 1/125, опубл. 14.06.2013). Штамм бактерий эффективен для очистки сточных вод, активно расщепляет животные жиры, в том числе бараний жир на 83 %, говяжий - на 88 % и свиной - на 91 %.

Недостатком известного штамма бактерий является неизученность окисляющей активности по отношению к нефти и нефтепродуктам, что не позволяет оценить его деструктирующую способность по отношению к нефтяным углеводородам.

Известен нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliguefaciens, Micrococcus varians (см. Архипченко И.А., Загвоздкин В.К. Очистка нефтезагрязненных почв с помощью препаратов на основе микробных удобрений // Экология и промышленность России. Спецвыпуск. 2004. С. 16-18).

Недостатком является то, что нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов недостаточна для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (см. RU №2446900, МПК В09С 1/10, опубл. 10.04.2012), обладающий способностью эффективно снижать концентрацию нефти в почве до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.

Недостатком изобретения является то, что штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +5 до +37°С.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в расширении номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) как в почве, так и в воде в условиях широкого диапазона температур от +5 до +37°С.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 - деструктор нефти и нефтепродуктов, обладающий утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), перспективный для очистки, почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в широком диапазоне температур (от +5 до +37°С) в относительно короткие сроки (3-45 суток).

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение поставленных функциональных задач.

Заявляемый штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 выделен 16 февраля 2015 года из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, отобранных возле емкостей Момского РЭС ОАО «Сахаэнерго», Северо-Восток Якутии, Момский район, село Хонуу.

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП «ГосНИИгенетика», 117 545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1, регистрационный номер ВКПМ В-12247.

Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Stenotrophomonas.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

CACACTCTAGTCGCCCAGTATCCACTGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACAACGGACTTAAACGACCACCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTTGGGTACCGTCATCCCAACCGGGTATTAGCCAGCTGGATTTCTTTCCCAACAAAAGGGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACCCACGCGGTATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACGGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCC

Результаты обработки секвенсов представляются в графическом виде.

S002910548     0.966 0.846 1375  Luteimonas cucumeris (T); Y4; HQ874629S000020206     0.980 0.841 1384  Pseudoxanthomonas broegbernensis (T); B1616/1; AJ012231S000503245     0.978 0.856 1362  Pseudoxanthomonas daejeonensis (T); TR6-08; AY550264S000007629     0.996 0.903 1345  Pseudomonas geniculata (T); ATCC 19374T; AB021404S000009493     0.987 0.933 1388  Pseudomonas beteli (T); ATCC 19861T; AB021406S000010261     0.998 0.944 1400  Pseudomonas hibiscicola (T); ATCC 19867T; AB021405S000129976     0.984 0.852 1431  Stenotrophomonas rhizophila (T); e-p10; AJ293463S000824093     1.000 0.992 1444  Stenotrophomonas maltophilia (T); IAM 12423; AB294553S001097383     0.993 0.867 1367  Stenotrophomonas chelatiphaga (T); LPM-5; EU573216S001611233     0.998 0.944 1392  Stenotrophomonas pavanii (T); ICB 89; FJ748683

По данным анализа RDP II 16S рРНК было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 (см. чеотеж).

Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%.

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм отнесен к видy Stenotrophomonas maltophilia (100%).

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамотрицательные палочки в мазках расположены одиночно или беспорядочными скоплениями. Спор и капсул не образует.

Культуральные признаки.

На мясопептонном агаре (МПА) (мас.%): ферментативный пептон – 1,0; натрий хлористый – 0,5; агар – 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2, формирует полупрозрачные желтоватые колонии с ровным краем диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются. Старые культуры могут образовывать коричневатый или сероватый пигмент.

На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (мас.%): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 7,1 - 7,5, формирует полупрозрачные желтоватые колонии с ровным краем диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются. Старые культуры могут образовывать коричневатый или сероватый пигмент.

На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки – 1,0; панкреатический гидролизат казеина – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,2; натрия фосфат однозамещенный – 0,2; D-глюкоза – 4,0; агар – 1,0; вода дистиллированная – остальное; рН 6,0±3, формирует желтоватые колонии, в старых культурах может образовывать коричневатый или серый пигмент, диаметр колоний 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

В мясопептонном бульоне (мас.%): ферментативный пептон – 1,0, натрий хлористый – 0,5, вода мясная – остальное; рН 7,0-7,2, образует муть.

На минеральной среде Мюнца (см. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5- С.1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава: (мас.%) KNO₃ – 0,4; MgSO₄ ·7H₂O – 0,08; NaCl – 0,1; K₂ HPO₄ – 0,14; KH₂ PO₄ – 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты – 1,0; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, растет в виде полупрозрачных серовато-желтых мелких колоний диаметром 1 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм аэроб растёт при температуре от +5 до +37°С, более интенсивно растет +10-(+30)°С. Растёт при рН 5,0–8,5. Оптимум рН 6,5–8,0. Растёт в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.

Используемые источники углерода: сорбит, маннит.

Проверенные неиспользуемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия. Штамм индол-отрицателен. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Не ферментирует бета-галактозидазу. Не утилизирует инозит. Продукт, синтезируемый штаммом: поверхностно-активные вещества, способные деструктировать нефть. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.

Штамм не токсичен по отношению к высшим растениям (биотестирование проведено на семенах овса обыкновенного сорт «Скакун»).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 выделен из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на МПА.

Для этого 1,0 г мерзлого грунта с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца следующего состава: (мас.%) KNO₃ – 0,4; MgSO₄ ·7H₂O – 0,08; NaCl – 0,1; K₂ HPO₄ – 0,14; KH₂ PO₄ – 0,06; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. На первом этапе инкубация проводилась в качалочных условиях при 200 об/мин и температуре +20±1°С. Рост бактерий наблюдали уже через 3 дня инкубации по образованию мутной эмульсии с и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 была получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах от +5 до +37°С. Через 72 ч на поверхности МПА наблюдали появление полупрозрачных колоний желтовато-серого цвета диаметром до 5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (см. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact.; July 1985, p. 408.) идентифицированы как штамм Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевали на скошенный МПА и инкубировали 48 часов при температуре +20±1°С. Выросшие на МПА культуры Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 смывали 0,9 % раствором NaCl; готовили исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.

Для получения препарата готовили жидкую минеральную среду по примеру 1 и культивировали в колбах в качалочных условиях в течение 48 часов при температуре 20±1°С, при 200 об/мин. Полученную жидкую смесь клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 с титром 1·10⁹ клеток/см³ использовали в качестве препарата для обработки почвы и воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Клетки штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 смывают 0,9 % раствором NaCl со скошенного мясо-пептонного агара. Готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята объемом 25 см³ с концентрацией 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 культивируют в водной среде с минеральным составом по примеру 1.

В колбочки объемом 250,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ клеток/ см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторениях. Колбы культивируют при разных температурах (от +5°C до +37°С) в течение 3-5 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025» (см. ФР.1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами, в условиях постоянной аэрации, предлагаемый штамм уже через 3-е суток при температуре +5°C утилизирует 4,4–5,5% нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C – 56,4–59,8 %; при температуре +30°C – 62,0–63,4%; при температуре +37°C – 67,0–69,6%; в зависимости от типа ксенобиотика (см. таблицу 1).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 (по примеру 2), содержащего 1·10⁹ клеток/см³ суспензии. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 45 суток при температуре +20±1˚С.

Полученные результаты (см. таблицу 2) показали, что в воде деструкция нефти под влиянием штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 за 45 суток составила 53,0 %. Деструкция в контрольной ёмкости существенно не изменилась.

Пример 5. Очистка почвы от нефтезагрязнений с помощью клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Опыты с применением клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 для очистки почвы от нефти проведены на супесчанной почве в условиях модельного опыта. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до обработки почв клетками штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 составило 3000 мг/кг, что соответствовало среднему уровню загрязнения в соответствии с нормативными документами (см. Письмо Минприроды России от 27.12.1993 г. № 04-25/61-5678 «О порядке определения размеров ущерба от загрязнения земель химическими веществами»; Методические рекомендации по выявлению деградированных и загрязненных земель. Комитет РФ по земельным ресурсам от 27 марта 1995 г. № 3-15/582, 29 с.).

Эффективность применения штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 оценивали по степени деградации нефтезагрязнения в почвенных образцах, отобранных для анализа, до и после внесения микробной суспензии на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Поскольку единого нормативного документа по оценке допустимого содержания нефтепродуктов в почве нет, оценку остаточного содержания нефти в почве до и после проведения опыта проводили гравиметрическим методом согласно инструкции общепринятым документам (см. РД 39-0177098-015-90 «Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтепрома»).

Для этого образцы почвы до и после обработки биопрепаратом подвергались экстракции в аппарате Сокслета четыреххлористым углеродом, после чего экстрагент удаляли перегонкой с дефлегматором, доводя остаток до постоянного веса. Определение влажности образцов проводили общепринятым методом (см. ГОСТ 28268-89 «Почвы. Методы определения влажности, максимальной гигроскопической влажности»), после чего производили перерасчет содержания нефтепродуктов на сухую почву.

Опыты проводили в условиях холодильной камеры при температуре +5±1ºС; в комнатных условиях при температуре +20±1ºС и в термостатированных условиях при температуре +30±1ºС и температуре +37±1ºС.

Установлено, что степень биодеградации нефтепродуктов в опытных образцах через 45 суток после обработки почв бактериальной суспензией на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 составила при температуре +5±1ºС – 6,6%; при температуре +20±1ºС – 54,8%; при температуре +30±1ºС – 60,0%; при температуре +37±1ºС – 60,6% (см. таблицу 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 3 до 45 суток), в широком диапазоне температур от +5 до +37°С, который может быть использован как для очистки почвы, так и для очистки воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Таблица 1

Степень утилизации нефтепродуктов штаммом Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 в водной среде с минеральными компонентами

Вариант опыта	Отбор контрольных проб	Содержание нефтепродуктов, мг/дм3
t°С
+5	+20	+30	+37
Вода+минеральные компоненты+штамм+нефть	до опыта	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0
после опыта	956,0	404,0	380,0	304,0
% деструкции	4,4	59,6	62,0	69,6
Вода+минеральные компоненты+штамм+дизельное топливо	до опыта	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0
после опыта	950,0	436,0	366,0	330,0
% деструкции	5,0	56,4	63,4	67,0
Вода+минеральные компоненты+штамм+масло моторное	до опыта	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0
после опыта	948,0	402,0	380,0	322,0
% деструкции	5,2	59,8	62,0	67,8
Вода+минеральные компоненты+штамм+масло гидравлическое	до опыта	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0
после опыта	954,0	402,0	380,0	312,0
% деструкции	4,6	59,8	62,0	68,8
Вода+минеральные компоненты+штамм+газовый конденсат	до опыта	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0
после опыта	945,0	404,0	376,0	320,0
% деструкции	5,5	59,6	62,4	68,0

Таблица 2

Деструкция нефти в воде штаммом Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

	Содержание нефтепродуктов, мг/дм3	Степень утилизации нефти, %
Вариант опыта	до опыта	после опыта
Вода+нефть+ штамм	30 000,0	15 900,0	53,0
Контроль: Вода+нефть	30 000,0	29 300,0	2,3

Таблица 3

Деструкция нефтепродуктов в почве под влиянием клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

Схема опыта	Содержание нефти, мг/кг	Деградация нефти,%
до очистки	после очистки
Опыт при температуре +5±1ºС
Контроль (почва + нефть)	3000,0	2940,0	2,0
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3	3000,0	2800,0	6,6
Опыт при температуре +20±1ºС
Контроль (почва + нефть)	3000,0	2820,0	6,0
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3	3000,0	1356,0	54,8
Опыт при температуре +30±1ºС
Контроль (почва + нефть)	3000,0	2794,0	6,8
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3	3000,0	1200,0	60,0
Опыт при температуре +37±1ºС
Контроль (почва + нефть)	3000,0	2760,0	8,0
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3	3000,0	1180,0	60,6

Штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia ВКПМ В-12247 - деструктор нефти и нефтепродуктов.