Белок слияния, содержащий тимусный стромальный лимфопоэтический белок, вакцина, содержащая экспрессионный вектор для экспрессии белка, и вакцина, содержащая указанный вектор для экспрессии

Белок слияния, содержащий тимусный стромальный лимфопоэтический белок, вакцина, содержащая экспрессионный вектор для экспрессии белка, и вакцина, содержащая указанный вектор для экспрессии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка не является предварительной заявкой и испрашивает приоритет согласно 35 U.S.С. §119(е) предварительной заявки США с серийным номером 60/875, поданной 14 декабря 2006, содержание которой включено здесь путем ссылки во всей полноте

Область техники

Настоящее изобретение относится к собачьему тимусному стромальному лимфопоэтическому белку (собачьему ТСЛБ), молекулам нуклеиновым кислот, векторам и клеткам хозяина, кодирующим собачий ТСЛБ, и способам получения и применения собачьего ТСЛБ.

Уровень техники

Животные, включая человека, которые страдают от реагин-опосредованных заболеваний, таких как атопические заболевания, наследственно предрасположены к развитию прямых аллергических реакций, включающих в себя иммуноглобулины Е (антитела IgE). Множественные генетические факторы вносят свой вклад в проявление результирующего фенотипа, который наблюдается у таких животных. Прямая гиперчувствительность, наблюдаемая при атопических заболеваниях, происходит в результате воздействия специфических аллергенов, таких как клещ домашней пыли (Dermatophagoides pteronyssinus), пыльцы, плесени и перхоти. Неудивительно, что индивидуумы, имеющие атопическое заболевание, наиболее вероятно страдают от астмы, атопического дерматита, также как и от остальных заболеваний, обусловленных высвобождением эндогенного IgE.

Атопические заболевания, такие как аллергический дерматит, астма и тому подобные, также появляются среди собачьих видов, включающих в себя домашних собак. У таких собак обычно начинают проявляться признаки атопии в возрасте от 1 до 3 лет. Из-за наследственной природы заболевания некоторые породы, включающие в себя золотистого ретривера, большинство терьеров, ирландского сеттера, лхасского апсо, далматинов, бульдогов и староанглийских овчарок, несут в себе большую тенденцию к атопии, несмотря на то, что известно, что другие виды собак, включая смешанные породы, также страдают от этого. Частота случаев по крайней мере одного частного вида атопии, атопического дерматита, значительно увеличивается схожим образом как у человека, так и у собак.

Собаки с атопией обычно начинают тереть, лизать, жевать, кусать или царапать свои лапы, морду, уши, подмышки или область паха, что будет приводить к потере волос, покраснению и утолщениям кожи. В некоторых отдельных случаях состояния кожи сочетаются и вызывают зуд у животного, в то время, как только одна аллергия не могла бы привести к такому зуду. Такие ухудшающиеся проблемы могут быть обусловлены аллергенами, передающимися воздушным путем (пыльца и т.д.), аллергенами в пище и аллергенами от паразитов (блохи и т.д.). Бактериальные и/или дрожжевые инфекции кожи могут также усиливать чувство зуда.

Одним простым средством для облегчения раздражающих симптомов атопии является избежание аллергенов-возбудителей. К сожалению, такое избежание обычно невозможно. Прежде ветеринары-практики лечили атопический дерматит у собак применением оральных антигистаминных средств, оральных или топических противовоспалительных агентов класса кортикостероидов, других супрессоров иммунной системы, таких как циклоспорин или такролимус, производные жирных кислот, и аллерген-специфическая иммунотерапия (которая требует введения определенного антигена). Однако ни один из этих видов лечения не работает во всех случаях. Более того, такие виды лечения дороги и/или вызывают значительные побочные эффекты. Таким образом, существует давняя нужда в более безопасных, более эффективных и более экономичных подходах к лечению или подавлению симптомов атопического дерматита у собак. Иммунная система млекопитающих основана на серии сложных клеточных взаимодействий, которая называется «иммунная сеть». Многие из иммунных ответов вращаются вокруг взаимодействий подобно сетевым взаимодействиям лимфоцитов, макрофагов, гранулоцитов и других клеток с растворимыми белками, которые называются цитокинами и играют критическую роль в опосредовании/контроле/регулировании этих клеточных взаимодействий. Таким образом, цитокины и клетки иммунной системы служат для запуска специфических физиологических механизмов или путей, ведущих к различным воспалительным заболеваниям.

Аллергическое воспаление является результатом сложного иммунного каскада, который ведет Т клетки к продуцированию нерегулируемых ТН2-цитокинов, таких как IL-4, IL-5 и IL-13. Эти цитокины, в свою очередь, вызывают бронхиальную гиперактивность, продуцирование IgE, эозинофилию и продуцирование слизи (см., например, Busse and Lemanske, Jr (2001) N. Engl. J. Med. 344:350-62; Holgate (2000) Br. Med. J. 320:231-234, and Renauld (2001) J/Clin Pathol. 54:577-589).

Тимусный стромальный лимфопоетический белок (ТСЛБ) является IL-7 подобным цитокином, который был первоначально открыт у мышей как фактор, поддерживающий: (i) продуцирование in vitro иммуноглобулина IgM на поверхности В-клеток и (ii) пролиферацию В и Т клеток (Friend et al., 1994 Exp Hematology 22:321-328, см. также Levin et al., 199, J. Immunol. 162:677-683). Как известно, ТСЛБ связывает клеточный рецептор, содержащий в себе IL-7R-альфа субъединицу и уникальную субъединицу рецептора, называемую ТСЛБ-R. Это взаимодействие запускает передачу сигнала посредством активации STAT или экспрессией тимусного и регулируемого активацией хемокина (TARC) в гемопоэтических клетках, таких как миелоидные клетки, такие как моноциты, или дендритные клетки (см., например, патент США №6890734, включен здесь в качестве ссылки).

ТСЛБ также может играть значительную роль у мышей в патогенезе аллергических заболеваний, таких как атопический дерматит и астма. Например, трансгенные мыши, у которых в коже была специфически индуцирована экспрессия гена ТСЛБ, обладают иммунологическим и клиническими признаками атопического дерматита, такими как экзематозные повреждения, содержащие воспалительные кожные клеточные инфильтраты, резкое увеличение количества TH₂-CD4*T клеток, экспрессирующих кожные рецепторы для наведения, и увеличенный уровень IgE в сыворотке. Более того, легкие мышей, экспрессирующих легочный специфический трансген ТСЛБ обладают иммунологическими и клиническими признаками астмы, включающими крупную инфильтрацию лейкоцитов, гиперплазию бокаловидных клеток, субэпителиальный фиброз, увеличение цитокинов в Т-хелперах 2 типа и увеличение уровня IgE.

Sims et al. получили последовательность кДНК мышиного ТСЛБ, использующуюся в экспрессионном клонировании, но не имели возможности клонировать человеческий гомолог в пробы для гибридизации, основанные на мышином ТСЛБ (Sims et al. 200. J Exp Med, 192:671-680). В последствии человеческий гомолог был идентифицирован посредством детального EST анализа. Человеческий нуклеотид, соответствующий ТСЛБ, как было обнаружено, имеет только 43% гомологии с соответствующим нуклеотидом у мышей. Таким образом, остается необходимость в обеспечении новых и более практических способов лечения атопических заболеваний, включающих атопический дерматит и связанные с ним клинические проявления, у собак. Более того, необходимо выделить факторы, которые вовлечены в иммунный каскад, который ведет к атопическим заболеваниям у собак, что могло бы привести к развитию таких способов лечения.

Цитирование любой ссылки здесь не должно быть истолковано как принятие этой ссылки в качестве предшествующего уровня техники для настоящей заявки.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предоставляет новые и более применимые на практике способы лечения атопических заболеваний у собак, включающих в себя атопический дерматит и связанные с ним клинические проявления. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет новые выделенные и/или рекомбинантные тимусные стромальные лимфопоэтические белки (ТСЛБ), которые вовлечены в иммунный каскад, который ведет к атопическим заболеваниям. Настоящее изобретение далее предоставляет антигенные фрагменты таких белков ТСЛБ. В частном аспекте настоящего изобретения белок ТСЛБ является собачьим ТСЛБ.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет белок ТСЛБ, содержащий в себе аминокислотную последовательность, которая на 80% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, за исключением аминокислотного остатка 28 сигнальной последовательности, который, при назначении белка собаке, служит в качестве вакцины, антитела, которые связывают собачий ТСЛБ белок, содержащие в себе аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, распознаются в конечной собачьей сыворотке, полученной из вакцинированной собаки. В сходном варианте выполнения белок ТСЛБ содержит в себе аминокислотную последовательность, которая на 80% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, за исключением 28 аминокислотного остатка сигнальной последовательности; и она является перекрестно-реагирующей с антителом к собачьему ТСЛБ белку, содержащему аминокислоту из SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение далее предоставляет белок ТСЛБ, содержащий аминокислотную последовательность, которая на 80% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 (за исключением 28 аминокислотного остатка сигнальной последовательности), которая связывается моноклональным антителом, специфичным к эпитопу собачьего белка ТСЛБ.

В более частном варианте выполнения белок ТСЛБ содержит аминокислотную последовательность, которая на 90% или более идентична аминокислоной последовательности SEQ ID NO:2, за исключением 28 аминокислотного остатка сигнальной последовательности. В другом варианте выполнения белок ТСЛБ содержит аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислоной последовательности SEQ ID NO:2, за исключением 28 аминокислотного остатка сигнальной последовательности.

В частном варианте выполнения настоящего изобретения белок ТСЛБ является собачьим белком ТСЛБ, который содержит в себе аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В другом варианте выполнения белок ТСЛБ является зрелым собачьим белком ТСЛБ, который содержит аминокислотные остатки 29-155 из SEQ ID NO:2.

Также в настоящем изобретении предоставляются антигенные фрагменты белков ТСЛБ. Такие антигенные фрагменты включают в себя те, которые содержат один или более эпитопов, определенных индивидуально по аминокислотным последовательностям SEQ ID NO:8-101. В частном варианте выполнения антигенный фрагмент в настоящем изобретении содержит в себе один или более эпитопов, которые содержат в себе аминокислотные последовательности SEQ ID NO:30, 31, 32, и/или 34. В другом варианте выполнения изобретения антигенные фрагменты могут иметь аминокислотную последовательность внутри перекрывания аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:30, 31, 32, и/или 34, т.е. NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS (SEQ ID NO:118). В частном варианте выполнения изобретения антигенный фрагмент собачьего белка ТСЛБ способен связывать моноклональное антитело к человеческому ТСЛБ. Размер антигенных фрагментов аминокислотной последовательности NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS (SEQ ID NO:118) может лежать в приближенном интервале от 5 до 21 аминокислотных остатков.

Также предоставляются вакцины, которые могут включать в себя эффективное количество любого белка ТСЛБ настоящего изобретения, один или более антигенных фрагментов этих белков, или комбинации таких полноразмерных белков и одного или более таких фрагментов. В одном варианте выполнения белок ТСЛБ является собачьим ТСЛБ, который содержит в себе аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В частном варианте выполнения изобретения вакцина содержит один или более антигенных фрагментов собачьего ТСЛБ белка, который содержит в себе от 5 до 22 смежных аминокислот из аминокислотных остатков 71-92 из SEQ ID NO:2 (определенная здесь как SEQ ID NO:118). Примеры таких антигенных фрагментов включают в себя эпитопы, показанные здесь, которые содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32. SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:34. все вакцины настоящего изобретения могут далее содержать в себе фармацевтически приемлемый адъювант.

Вакцина настоящего изобретения может быть использована в способе получения антител к собачьему ТСЛБ. Один из таких способов содержит в себе иммунизацию млекопитающего эффективным количеством вакцины. Этот способ необязательно включает в себя способ регуляции активности ТСЛБ по его афферентным путям у собак и/или способ лечения или предотвращения аллергических симптомов у собак с атопией, который включает в себя иммунизацию собаки эффективным количеством вакцины. Улучшенные аллергические симптомы могут включать в себя аллергический дерматит, астму и тому подобное.

Вакцина настоящего изобретения может назначаться посредством внутримышечных инъекций, подкожных инъекций, внутривенных инъекций, внутрикожных инъекций, перорального применения, интраназального применения, скарификации и их комбинаций.

Настоящее изобретение далее предоставляет молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок ТСЛБ настоящего изобретения или его антигенный фрагмент. В одном таком варианте выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В частном варианте выполнения этого типа молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. Фрагменты нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 приблизительно из 18 смежных нуклеотидов, приблизительно из 24 смежных нуклеотидов, приблизительно из 36 смежных нуклеотидов, приблизительно из 45 смежных нуклеотидов, приблизительно из 66 смежных нуклеотидов или больше также являются частью настоящего изобретения. Нуклеиновые кислоты приблизительно из 18 нуклеотидов, приблизительно 24 нуклеотидов, приблизительно 36 нуклеотидов, приблизительно 45 нуклеотидов, приблизительно 66 нуклеотидов или больше, включая в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие полноразмерные белки ТСЛБ, которые гибридизуются с SEQ ID NO:1 в условиях точной гибридизации, также предоставляются настоящим изобретением. Все молекулы нуклеиновых кислот и их фрагменты настоящего изобретения могут далее содержать в себе гетерологичные нуклеотидные последовательности.

Настоящее изобретение также предоставляет вектор для экспрессии, который включает в себя ранее отмеченные молекулы нуклеиновых кислот и/или их фрагменты. В дополнение настоящее изобретение предоставляет клетки хозяина, которые содержат в себе такие вектора для экспрессии. Клетка хозяина необязательно либо прокариотическая, либо эукариотическая. В одном варианте выполнения прокариотической клеткой хозяина является Esherichia coli. В частном варианте выполнения этого типа клетка хозяина является E.coli BL21(DE3)/pLysS, которая содержит ген Т7 РНК полимеразы под контролем изопропил-β-тиогалактопиранозид (ИПТГ)-индуцибельного промотора lacUV5.

Настоящее изобретение далее предоставляет рекомбинантные вирусные вектора и/или пустые ДНК-вектора, содержащие одну из вышеупомянутых молекул нуклеиновых кислот, кодирующих собачий ТСЛБ, например SEQ ID NO:1, и/или фрагменты их. Такие вектора могут быть использованы, например, в вакцинах, подходящих для назначения собакам с атопическим дерматитом.

Настоящее изобретение также предоставляет способы получения белка ТСЛБ настоящего изобретения. Один из таких способов содержит в себе культивирование клетки хозяина настоящего изобретения в подходящей культуральной среде. Этот способ может далее включать в себя стадию выделения и/или очистки белка ТСЛБ из культивируемой клетки хозяина или культуральной среды. Конечный выделенный и/или очищенный белок ТСЛБ также является частью настоящего изобретения.

Антитела к ТСЛБ, полученные из гибридомной системы при действии вакцины настоящего изобретения, также являются частью настоящего изобретения. В одном из вариантов выполнения такого типа используется гибридомная система млекопитающих. В частном варианте выполнения антитела выделяют и/или очищают. Антитела могут быть либо поликлональными, либо моноклональными. Согласно изобретению, моноклональное антитело, полученное не от собаки, может быть необязательно сконструировано «особаченным» для того, чтобы проявлять минимальный антигенный эффект при введении собаке. В определенных предпочтительных вариантах выполнения связывающие домены любого антитела согласно изобретению необязательно преобразуются в связывающие фрагменты меньшего размера, чем первоначальное антитело, например, посредством расщепления, и/или рекомбинантные Fv, Fab и F(ab’)2 связывающие белки. Производные от антител терапевтические белки, которые обладают уникальными структурными и функциональными свойствами встречающихся в природе антител с тяжелыми с цепями (например, NANOBODIES®) также включены в изобретение. В дополнение, заменители антител, которые обладают высокой аффинностью к ТСЛБ и низкой иммуногенностью (например, авимерные белки, сконструированные из связывающих участков рецептора к ТСЛБ) также включены в настоящее изобретение. Изобретенные авимерные антитела к собачьему ТСЛБ могут активно использоваться при лечении аллергических симптомов у собак с атопией посредством применения эффективного количества такого антитела к собачьему ТСЛБ.

Настоящее изобретение также предоставляет вакцину, содержащую эффективное количество иммуногена не ТСЛБ природы в сочетании с эффективным количеством белка ТСЛБ настоящего изобретения, одним или более антигенных фрагментов этих белков, или сочетания полноразмерного белка с одним или более таким фрагментом. В частном варианте выполнения этого типа, белок ТСЛБ является собачьим белком ТСЛБ. В более частном варианте выполнения, собачий белок ТСЛБ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет диагностические способы с использованием собачьего белка ТСЛБ, его фрагменты и/или антитела, полученные к собачьему ТСЛБ и его фрагментам. В одном варианте выполнения настоящее изобретение предоставляет способ диагностики атопического дерматита у собак, содержащий в себе полученный образец эпидермы от собаки и детектирующий присутствие собачьего белка ТСЛБ в образце эпидермы. Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут лучше поняты при помощи ссылок на следующие иллюстрации и детальное описание.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует анализ белка из эукариотических клеток - системы для синтеза свободного белка, экспрессирующего собачий белок ТСЛБ - способом SDS электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Дорожка 1: Стандартный белок; Дорожка 2: Общий белок; Дорожка 3: Растворимый белок; Дорожка 4: Нерастворимый белок. Полосы белка ТСЛБ помечены стрелками.

Фиг.2А иллюстрирует анализ белка из эукариотических клеток - системы для синтеза свободного белка, экспрессирующего собачий белок ТСЛБ - способом Вестерн блоттинга. Белки были проинкубированы с антителами Anti-His (С Term)/AP (Invitrogen). Дорожка 1: Стандартный белок; Дорожка 2: Полный белок; Дорожка 3: Растворимый белок; Дорожка 4: Нерастворимый белок. Собачий белок ТСЛБ был обнаружен в общем белке и в нерастворимом белке (как помечено стрелками).

Фиг.2В иллюстрирует анализ белка из эукариотических клеток - системы для синтеза свободного белка, экспрессирующего собачий белок ТСЛБ - способом Вестерн блоттинга. Белки были проинкубированы с крысиными моноклональными антителами, специфическими к человеческому ТСЛБ. Дорожка 1: Стандартный белок; Дорожка 2: Полный белок; Дорожка 3: Растворимый белок; Дорожка 4: Нерастворимый белок. Собачий белок ТСЛБ был обнаружен в общем белке и в нерастворимом белке (как помечено стрелками).

Фиг.3А иллюстрирует экспрессию и очистку ТСЛБ из клеток хозяина E.coli и показывает полосу 61 кДа, которая присутствует в растворимой фракции E.coli, которая представляет собой слияние собачьего белка ТСЛБ, белка GST и концевого пептида из 6 остатков гистидина. «М» обозначет стандартный белок (один и тот же на Фиг.3A-3D). Дорожка 1 и дорожка 2 являются растворимыми фракциями E.coli B121(DE3)pLysS, содержащую плазмиду 1265-93В без и с индукцией ИПТГ, соответственно. Стрелки показывают полосу слияния белка GST-ТСЛБ-His (один и тот же на Фиг.3A-3D).

Фиг.3В показывает, что меченый белок слияния GST-ТСЛБ-His может быть очищен смолой на основе глутатион Сефарозы 4В. Дорожки с 1 по 3 показывают различные фракции после элюции на глутатион Сефарозе 4В.

Фиг.3С показывает, что белок слияния на дорожке В может быть в дальнейшем очищен при использовании смолы Ni-NTA. Этот рисунок иллюстрирует повторную очистку белка слияния GST-ТСЛБ-His на смоле Ni-NTA после очистки на глутатион Сефарозе 4В. Дорожка 1 обозначает элюат, дорожка 2 обозначает элюирование смолы Ni-NTA.

Фиг.3D иллюстрирует анализ белка слияния GST-ТСЛБ-His с помощью Вестерн блоттинга и подтверждает, что белок слияния распознается антителом к GST (GE Health Care Cat No.27457701).

Фиг.4 иллюстрирует окрашивание FITC участка запечатанной в парафин части поврежденной кожи, полученной от собаки 10197 с диагнозом «атопический дерматит». Этот участок был проинкубирован с кроличьими поликлональными антителами к человеческому ТСЛБ и реакция визуализировалась с помощью Стрептавидин-FITC (Флуорескаин изотиоцианат). Интенсивность флуоресценции (светлые области) определяли связывание кроличьего поликлонального антитела к человеческому ТСЛБ с ТСЛБ, представленному в ткани.

Фиг.5А иллюстрирует окрашивание FITC участка запечатанной в парафин части поврежденной кожи, полученной от собаки 10197 с диагнозом «атопический дерматит». В этой части наблюдается диффузное окрашивание (темные области) эпидермальной области кожи, помеченной крысиным моноклональным антителом к человеческому ТСЛБ.

Фиг.5В иллюстрирует контрольный участок. Этот участок был из запечатанной в парафин части поврежденной кожи, полученной от собаки 10197 с диагнозом «атопический дерматит», которая обрабатывалась только контролем в виде фосфатного буфера.

Фиг.6 иллюстрирует картирование эпитопов собачьего белка ТСЛБ с помощью крысиного монокпонального антитела к человеческому ТСЛБ. Пики, вызывающие особенный интерес - это пики от эпитопов под номером 22-26 (SEQ ID NO:29-33). Эпитопы 22-26 были также проинкубированы с N-концевым производным (пик 55 и выше) для того, чтобы подтвердить, что связывающиеся эпитопы не требуют N-концевого остатка.

Фиг.7 иллюстрирует сравнение собаки (SEQ ID NO:32) и человеческого аналога эпитопа 25 (SEQ ID NO:3) пептидной последовательности ТСЛБ.

Фиг.8А иллюстрирует последовательность ДНК гена собачьего ТСЛБ (SEQ ID NO:1).

Фиг.8В иллюстрирует предсказанный полипептид ТСЛБ, экспрессирующийся с последовательности ДНК, показанной на Фиг.8А (SEQ ID NO:2). Звездочка помечает N-конец первоначальной сигнальной последовательности (остатки 1-28) и подчеркнутые остатки 71-92 (SEQ ID NO:118), представляющие область, на которой были определены перекрывающиеся эпитопы.

Подробное описание изобретения

Атопический дерматит (АД) - это Th2-опосредованное аллергическое воспалительное заболевание. Это заболевание проявляется множеством схожих клинических признаков у человека и у собаки. Вероятно, что иммунопатогенез АД у собак схож с АД человека в отношении типа клеток и цитокинов, вовлеченных в повреждение кожи.

Связывание лиганда TARC (CCL22) с рецептором 4 хемокина СС (CCR4), который селективно экспрессируется на ТН2-лимфоцитах, вызывает селективную миграцию этих клеток к аллергическим повреждениям. Сообщалось, что TARC и его рецептор CCR4 регулируются по эфферентным путям при повреждениях кожи у собак с АД. Так как ТСЛБ является сильным индуктором TARC у человека, было предположено, что ТСЛБ может присутствовать при повреждениях у собак с АД. Антитела, полученные к человеческому ТСЛБ, были поэтому исследованы на поврежденной коже от собак с АД. Иммуногистохимия таких образцов кожи подтвердила присутствие антигена, реакционно-способного по отношению к антителам к человеческому ТСЛБ при повреждениях, как показано на Фиг.4. Однако задача по определению собачьего гомолога генов, кодирующих мышиный и человеческий ТСЛБ, как было доказано, особенно тяжело из-за высокой степени расхождения последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей ТСЛБ у млекопитающих, как обнаружено здесь.

Иммунизация домашней собаки ТСЛБ настоящего изобретения и/или одним или более его антигенных фрагментов должна служить для уменьшения уровней активности эндогенного ТСЛБ и поэтому сдерживать, снимать или предотвращать один или более симптомов атопии, таких, которые проявляются при астме и/или при атопическом дерматите, у иммунизированных собак. В дополнение, собачий белок ТСЛБ может быть использован в качестве иммуногена для расщепления антител к собачьему ТСЛБ для использования в качестве исследовательского или диагностического реагента у домашних собак или других видов млекопитающих. В качестве альтернативы, в частных примерах, собачий белок ТСЛБ и/или нуклеиновые кислоты, которые кодируют собачий ТСЛБ, могут служить для регулирования элементов эфферентных путей иммунной системы у собак с ослабленным иммунитетом, например, посредством активации STAT или экспрессии TARC, например, гемопоэтическими клетками.

Для того, чтобы более полно понять настоящее изобретение, предлагаются следующие определения.

Использование уникальных терминов для удобства в описании ни в коей мере не ограничивается. Так, например, ссылка на состав, содержащий в себе «полипептид», включает в себя ссылку на один или более таких полипептидов. Используемый здесь термин «приблизительно» используется попеременно с термином «примерно» и обозначает, что величина находится внутри интервала с 20% отклонением от определенной величины, т.е., пептид, содержащий «приблизительно» 50 аминокислотных остатков, может содержать от 40 до 60 аминокислотных остатков.

Термин «связывающий состав» относится к молекулам, которые специфично связываются с собачьим ТСЛБ, например, во взаимодействии антиген-антитело. Специфичность может быть более или менее включающей, например, специфичной для частного варианта выполнения, или для группы родственных вариантов выполнения, например, собачий ТСЛБ и/или собачьи антитела.

Используемый здесь термин «собака» включает всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiahs, если не указано иное.

Используемый здесь термин «полипептид» используется попеременно с термином «белок» и «пептид» и обозначает полимер, содержащий в себе 2 или более аминокислот, связанных между собой пептидными связями. Термин «полипептид», используемый здесь, включает в себя значительный фрагмент или сегмент и содержит ряд аминокислотных остатков примерно по крайней мере из 8 аминокислот, в основном примерно из 12 аминокислот, обычно по крайней мере 16 аминокислот, предпочтительней по крайней мере 20 аминокислот, и в особенно предпочтительных вариантах выполнения по крайней мере 30 или более аминокислот, например, 35, 40, 45, 50 и т.д. Такие фрагменты могут нести концы, которые начинаются и/или заканчиваются фактически на всех позициях, например, начало на остатках 1, 2, 3 и конец на, например, 155, 154, 153 и т.д., во всех практических комбинациях.

Необязательно, у полипептида может не хватать определенных аминокислотных остатков, которые кодируются геном или мРНК. Например, ген или молекула мРНК может кодировать последовательность аминокислотных остатков на N-конце полипептида (т.е. сигнальную последовательность), которая потом отщепляется и поэтому может не являться частью конечного белка.

Используемая здесь аминокислотная последовательность на 100% является «гомологичной» второй аминокислотной последовательности, если две аминокислотные последовательности идентичны и/или отличаются только нейтральными или консервативными заменами, как определено ниже. Соответственно аминокислотная последовательность приблизительно на 80% является «гомологичной» второй аминокислотной последовательности, если приблизительно 80% двух аминокислотных последовательностей идентичны и/или различаются только по нейтральным или консервативным заменам.

Функционально эквивалентные аминокислотные остатки часто могут замещаться остатками в пределах последовательности, приводя к консервативным аминокислотным заменам. Такие изменения определяют термин «консервативная замена», используемый здесь. Например, один или более аминокислотные остатки в пределах последовательности могут замещаться другой аминокислотой схожей полярности, которая действует как функциональный эквивалент, приводя к «молчащим» изменениям. Замены аминокислот в пределах последовательности могут быть выбраны из других членов того класса, к которым принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают в себя аспартамовую кислоту и глутаминовую кислоту. Не ожидается, что такие изменения повлияют на молекулярный вес, как определено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или по изоэлектрической точке.

Особенно предпочтительными консервативными заменами являются: лизин на аргинин и наоборот, что в любом случае обеспечивает положительный заряд; глутаминовую кислоту на аспарагиновую и наоборот, что в любом случае обеспечивает отрицательный заряд; серин на треонин, который в любом случае обеспечивает свободную ОН-группу; и глутамин на аспарагин, что в любом случае обеспечивает свободную аминогруппу. Аминокислоты также могут быть замещены в пределах следующих сходных групп: (1) пролин, аланин, глицин, серин и треонин; (2) глутамин, аспарагин, глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота; (3) гистидин, лизин и аргинин; (4) цистеин; (5) валин, лейцин, изолейцин, метионин; и (6) фенилаланин, тирозин и триптофан.

В родственном варианте выполнения две высоко гомологичные последовательности ДНК могут быть идентифицированы по собственной гомологии, или по гомологии аминокислот, которые они кодируют. Такое сравнение последовательностей может быть представлено с использованием стандартного пакета программ, доступного в банках данных таких последовательностей. В частном варианте выполнения две высоко гомологичные последовательности ДНК кодируют аминокислотные последовательности, имеющие приблизительно 80% идентичности, более предпочтительно приблизительно 90% идентичности и еще более предпочтительно приблизительно 95% идентичности. В более частном случае две высоко гомологичные аминокислотные последовательности имеют приблизительно 80% идентичности, более предпочтительно приблизительно 90% идентичности и еще более предпочтительно приблизительно 95% идентичности.

Как используется здесь, процент идентичности белковой и ДНК последовательности может быть определен при помощи пакета программ, такого как MacVector v9, который доступен коммерчески у фирмы Accelrys (Burlington, Massachusetts) и алгоритм Clustal W для параметров по умолчанию для сопоставления и параметров по умолчанию для идентичности. Смотри, например, Thompson, et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Clustal W - бесплатно загружаемая программа для платформ dos, Macintosh и Unix, например, с EMBLI, Европейского Института Биоинформатики. Настоящая ссылка для скачивания найдена на http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. Эти и другие доступные программы могут быть также использованы для определения сходства последовательностей, используя такие же или аналогичные параметры по умолчанию.

«Полинуклеотид» или «молекула нуклеиновой кислоты» является молекулой, содержащей в себе нуклеотиды, включающая в себя без ограничений РНК, кДНК, геномную ДНК и даже синтетические последовательности ДНК. Эти термины также предназначены для рассмотрения молекул нуклеиновых кислот, которые включают в себя какие-либо из известных в науке аналогов ДНК и РНК.

Настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с нуклеотидными последовательностями, кодирующими белок ТСЛБ настоящего изобретения. Молекула нуклеиновой кислоты способна к гибридизации с другой молекулой нуклеиновой кислоты, такой как кДНК, геномная ДНК или РНК, когда одноцепочечная форма молекулы нуклеиновой кислоты может отжигаться с другой молекулой нуклеиновой кислоты при соответствующих значениях температуры и ионной силы раствора (см. Sambrook and Russel Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, L.I, (2000)).

Очень строгие условия гибридизации соответствуют, например, самой высокой температуре T_m, 50% формамида, 5Х или 6XSSC. При гибридизации необходимо, чтобы две молекулы нуклеиновых кислот содержали в себе комплементарные последовательности, хотя, в зависимости от строгости гибридизации, возможны неспаренные участки (мисмэтчи) между основаниями. Соответствующая строгость гибридизации нуклеиновых кислот зависит от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности, разновидности которой хорошо известны в данной области. Чем степень сходства или гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями, тем больше значение T_m, для гибридов нуклеиновых кислот, имеющих такие последовательности. Относительная стабильность (соответствующая более высокой T_m) гибридизации нуклеиновых кислот уменьшается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК.-РНК, ДНК:ДНК. Для гибридов длиной более 100 нуклеотидов было получено уравнение для вычисления T_m (Sambrook and Russel Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, L.I, (2000)). Для гибридизации с более короткими молекулами нуклеиновых кислот, т.е., олигонуклеотидами, участок с неспаренными основаниями (мистмэтчами) становится более важным и длина олигонуклеотида определяет его специфичность.

Предпочтительно минимальная длина молекулы нуклеиновой кислоты, способной к гибридизации, составляет по крайней мере приблизительно 12 нуклеотидов; более предпочтительно по крайней мере приблизительно 18 нуклеотидов; еще более предпочтительно длина составляет по крайней мере приблизительно 24 нуклеотида, и наиболее предпочтительный вариант - по крайней мере 36 нуклеотидов. В специфическом варианте выполнения, к термину «стандартные условия гибридизации» относится T_m 55°С, и условия использования, установленные ранее. В другом специфическом варианте выполнения, строгие условия обозначают T_m 65°С для условий гибридизации и отмывки, соответственно.

«Кодирующая последовательность» ДНК или «последовательность, кодирующая» частный белок или пептид, - это последовательность ДНК, которая транскрибируется и транслируется в полипептид in vitro и in vivo под контролем соответствующих регуляторных элементов.

Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5’-конце и стоп-кодоном на 3’-конце. Кодирующая последовательность может включать в себя, но без ограничений, прокариотические последовательности, кДНК с мРНК эукариот, последовательности геномной ДНК от эукариот (например, млекопитающих) и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции обычно будет располагаться на 3’-конце кодирующей последовательности.

Термин «реально связанный» относится к расположению элементов, где описанные компоненты располагаются так, чтобы выполнять свои обычные функции. Так, контрольные элементы, реально связанные с кодирующей последовательностью, способны влиять на экспрессию кодирующей последовательности. Необходимо, чтобы контрольные элементы не располагались по соседству с кодирующей последовательностью все время, пока они действуют, управляя их экспрессией. Так, например, промежуточные, еще нетранслированные, транскрибированные последовательности могут присутствовать между промотором и кодирующей последовательностью, и промотор может пока рассматриваться как «реально связанный» с кодирующей последовательностью.

Термин «гетерологичная нуклеотидная последовательность», используемый здесь, обозначает нуклеотидную последовательность, которая добавляется к нуклеотидной последовательности настоящего изобретения рекомбинационными способами с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, которая не является в действительности сформированной в природе. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут кодировать белки слияния (т.е. химерные). Так, гете