Ген и вариации, связанные с фенотипом bm1, молекулярные маркеры и их применение

Ген и вариации, связанные с фенотипом bm1, молекулярные маркеры и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ИСПРАШИВАНИЕ ПРИОРИТЕТА

По настоящей заявке испрашивается приоритет даты подачи предварительной заявки на патент США 61/429,390, поданной 3 января 2011 года, "ГЕН И ВАРИАЦИИ, СВЯЗАННЫЕ С ФЕНОТИПОМ BM1, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ".

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее описание относится к фенотипу кукурузы brown midrib (bm). В конкретных вариантах осуществления, настоящее описание относится к определенным измененным генам CAD2 в кукурузе, которые вносят вклад в фенотип bm1 в некоторых сортах кукурузы, к молекулам нуклеиновой кислоты, включающим измененный ген CAD2, и/или белковым продуктам, получаемым в результате трансляции таких молекул нуклеиновых кислот.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лигнины являются универсальными компонентами растений, которые образуют поперечные связи с такими углеводами, как гемицеллюлозы в клеточной стенке. Лигнин и целлюлоза являются двумя преобладающими компонентами клеточной стенки растений. Клеточная стенка растения обеспечивает естественный барьер от внеклеточной среды. Многие исследования продемонстрировали, что одна из реакций растений на биотические стрессы (например, инфекцию, вызванную патогенным микроорганизмом) или абиотические стрессы (например, засуху, механический стресс и т.д.) состоит из укрепления клеточной стенки растения, в особенности посредством увеличения содержания лигнина в клеточной стенке растения. Многие сельскохозяйственные или промышленные применения связаны с целевыми растительными продуктами (например, продуктами, используемыми в производстве бумаги, производстве силоса и производстве энергии, например в форме биотоплива), выходы которых непосредственно связаны с содержанием и/или составом лигнина в клеточной стенке растения.

Лигниновые полимеры ограничивают перевариваемость волокна в растении кукурузы. Лигниновые полимеры снижают перевариваемость волокна у жвачных, причем степень лигнификации может быть обратно пропорциональна перевариваемости кормовой культуры (Cherney et al. (1991) Adv. Agron. 46:157-98). Модуляция содержания и состава лигнина может требоваться для повышения перевариваемости фуража. Модуляция лигнинового состава также может быть необходима, например, для укрепления клеточных стенок растения и, таким образом, повышения устойчивости к стрессам, или, наоборот, для уменьшения прочности клеточных стенок растения с целью облегчения извлечения целлюлозы или других химических соединений (Baucher et al. (1998) Plant Mol. Biol. 39:437-47).

Впрочем, довольно сложно узнать, как изменить путь биосинтеза лигнина и спрогнозировать, каковы будут последствия модификаций. Это, по меньшей мере, частично, обусловлено тем, что путь биосинтеза лигнина является сложным метаболическим путем, включающим большое количество ферментативных реакций. См., например, Dixon et al. (2001) Phytochemistry 57(7):1069-84. Возможные механизмы, с помощью которых метаболический путь может быть изменен физиологически, например, для компенсации изменения, вводимого модификацией в метаболическом пути, не известны.

Лигнин представляет собой нерастворимый полимер из 3 мономеров-спиртов или монолигнолов: п-кумариловый спирт (H субъединицы), конифериловый спирт (G субъединицы) и синапиловый спирт (S субъединицы), которые образуются в фенилпропаноидном пути (Neish (1968) Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds. New York, Springer Verlag 1-43). Каждый тип субъединицы может образовывать различные связи с другими субъединицами и, таким образом, формировать лигнин. Другие связи также могут образовываться с другими париетальными соединениями (например, полисахаридами и белками), что приводит к формированию сложной трехмерной сети.

Этапы в сложном пути синтеза лигнина включают гидроксилирование, O-метилирование ароматических колец и конверсию карбоксила боковой цепи в спиртовую функциональную группу. Текущая гипотеза относительно монолигнольного пути биосинтеза включает последовательные реакции гидроксилирования и O-метилирование на различных уровнях окисления боковых цепей в метаболической сети, приводящие в результате к формированию S и G субъединиц. Ферменты сети включают 3-O-метилтрансферазу кофейной кислоты (COMT); гидроксициннамат:кофермент А лигазы (4CL); цитохром P450-зависимые ферулат-5-гидроксилазы (F5H); и некоторые изоформы циннамоил-КоА-редуктазы (CCR) и циннамилалкогольдегидрогеназы (CAD).

В течение нескольких лет предпринимались попытки модифицировать содержание и состав лигнинов растений посредством повышения или понижения экспрессии одного или нескольких генов пути биосинтеза лигнина (Anterola and Lewis (2002) Phytochemistry 61:221-94). Несмотря на то, что предлагали различные стратегии, повышение или понижение экспрессии одного или более ферментов в пути биосинтеза лигнина не всегда дает надежные и предсказуемые результаты.

Другая стратегия состоит в использовании, в схемах отбора, мутантов целевого гена в пути биосинтеза лигнина. Растения, содержащие мутацию brown midrib (bmr), демонстрируют измененный лигниновый состав и перевариваемость. В кукурузе были идентифицированы по меньшей мере четыре независимых мутации brown midrib (Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7:1435-6). Все указанные мутации, которые называются "bm1, bm2, bm3 и bm4", демонстрируют пониженное содержание лигнинов по сравнению с контрольной кукурузой. Растения кукурузы brown midrib отличаются коричневой пигментацией средней жилки листа на стадии V4-V6 и светло-коричневой окраской паренхимы после выбрасывания султанов. Одной из описанных bmr мутаций является мутация со вставкой в ферменте COMT (bm3).

Зрелые растения кукурузы bm1 имеют уменьшенное на 10-20% содержание лигнина, небольшое уменьшение количества сложных эфиров феруловой кислоты и существенно сниженное содержание (~40%) сложных эфиров п-кумаровой и феруловой кислоты (Provan et al. (1997) J. Agric. Food 73:133-42; Barriére et al. (2004) Comptes Rendus Biologie 327:847-60). Частота п-гидроксифениловых, гваяциловых и сирингиловых мономеров тиоацидолиза аналогична в растениях bm1 и растениях дикого типа, показывая, что мутация bm1 не оказывает существенного влияния только на один тип лигниновой субъединицы (Guillaumie et al. (2007) Planta 226 (1):235-50). Лигнины растений bm1, по-видимому, действительно существенно обогащены углерод-углеродными межсубъединичными связями (Halpin et al. (1998) Plant J. 14 (5):545-53; Barriére et al. (2004), выше), при этом лигнины bm1 имеют существенное включение кониферилового альдегида и, в меньшей степени, синапового альдегида (Kim et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:47412-9).

Важные в сельскохозяйственном отношении применения кукурузы включают силос. Силос представляет собой ферментированный фураж высокой влажности, который можно использовать в качестве корма для жвачных. Его заквашивают и сохраняют в процессе, называемом силосованием, и обычно приготавливают из кукурузы или других кормовых культур, включая сорго или другие зерновые злаки, используя всю зеленую массу растений. Силосную массу обычно дают на корм молочному скоту, тогда как силос в брикетах обычно используют для мясного скота, овец и лошадей. Так как силос проходит процесс ферментации, энергия используется ферментативными бактериями для продукции летучих жирных кислот, таких как ацетат, пропионат, лактат и бутират, которые консервируют фураж. Результат состоит в том, что силос имеет более низкую энергетическую ценность, чем исходный фураж, поскольку ферментативные бактерии используют некоторые углеводы для синтеза летучих жирных кислот. Кукурузный силос является распространенным кормом для жвачных животных, потому что он обладает высокой энергетической ценностью и усвояемостью и легко приспособлен к механизации от полевой культуры до момента кормления. Кукурузный силос обычно имеет цвет от коричневатого до темно-зеленого и легкий, приятный запах.

Пониженное содержание лигнина в кукурузе brown midrib (кукурузе bm) приводит к получению силоса с более усвояемыми волокнами по сравнению с обычной кукурузой, и демонстрирует повышенную степень превращения в биотопливо. Кормление дойных коров силосом из кукурузы bmr, как было показано, увеличивает потребление сухого вещества (DMI) и выход молока (Grant et al. (1995) J. Dairy Sci. 78:1970-80; Oba and Allen (2000) J. Dairy Sci. 83:1333-41; Oba and Allen (1999) J. Dairy Sci. 82:135-42). Однако силос из кукурузы bmr уменьшал средний ежедневный прирост веса и эффективность кормления (G:F) у коров мясных пород, по сравнению с кукурузным силосом из обычного сорта кукурузы (Tjardes et al. (2000) J. Anim. Sci. 78:2957-65). Гибридные линии кукурузы brown midrib, как также часто обнаруживали, являлись низкоурожайными. Гибридную кукурузу brown midrib также обычно связывали с полеганием кормовых растений и недостаточной стойкостью к полеганию.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящей заявке описаны молекулы нуклеиновых кислот, включающие мутантный ген CAD2, который вносит вклад в фенотип bm1 кукурузы. Также описаны молекулярные маркеры, которые связаны или присутствуют в мутантном гене CAD2 кукурузы. Неожиданно, сложный путь биосинтеза лигнина подвергается очевидному изменению в присутствии мутантного гена CAD2, в результате чего растения, содержащие мутантный ген CAD2, имеют более низкие уровни лигнина по сравнению с уровнями лигнина, обнаруживаемыми в растениях дикого типа. Исследование мутантных генов CAD2 и идентификация маркеров, связанных с мутантными генами CAD2, может существенно облегчить создание и введение фенотипов с пониженным содержанием лигнина в зародышевую плазму растения. В некоторых вариантах осуществления, маркеры, которые связаны или присутствуют в мутантном гене CAD2 кукурузы или в последовательности мутантного гена CAD2 кукурузы непосредственно, могут применяться для введения мутантного гена CAD2 кукурузы в другие организмы, например растения, дрожжи и прокариоты.

В конкретных вариантах осуществления, мутантный ген CAD2 согласно настоящему описанию может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую усеченный белок CAD2. Например, мутантный ген CAD2, включающий мутацию со вставкой в экзоне (например, экзоне 3) или интроне (например, интроне 1) гена CAD2, может вводить преждевременный стоп-кодон, что приводит к синтезу более короткого продукта гена. В некоторых вариантах осуществления, мутантный ген CAD2 согласно настоящему описанию может включать встречающуюся в природе мутацию в одной или более линиях кукурузы. В некоторых вариантах осуществления, мутантный ген CAD2 клонирован из известного сорта кукурузы bmr, например 515Dbm1. В других вариантах осуществления, мутантный ген CAD2 клонирован из ранее неизвестного сорта кукурузы bmr, например, DASbm1. При экспрессии в растении, мутантный ген CAD2 согласно настоящему описанию может обеспечивать некоторый фенотип растения, например, с пониженными уровнями РНК CAD2 в тканях растения и/или с пониженным содержанием лигнина в тканях растения.

Также в настоящей заявке описаны способы применения молекулярных маркеров на основе нуклеиновой кислоты, которые связаны с или присутствуют в мутантном гене CAD2 кукурузы согласно настоящему описанию, в качестве неограничивающего примера: для идентификации растений, имеющих фенотип, характеризуемый пониженным содержанием лигнина; для введения мутантного гена CAD2 кукурузы в генотипы новых растений (например, посредством скрещивания с помощью маркеров или генетической трансформации); для различения генов CAD2 дикого типа и определенных мутантных генов CAD2 согласно настоящему описанию; и для получения растений и семян растений из кроссов первого растения, включающего молекулярные маркеры на основе нуклеиновой кислоты, которые связаны с или присутствуют в мутантном гене CAD2 кукурузы согласно настоящему описанию, и второго растения, необязательно несущего мутантный ген CAD2 кукурузы. В некоторых вариантах осуществления, мутантный ген CAD2 кукурузы введен с помощью генно-инженерных манипуляций в виды растений, отличные от кукурузы.

Кроме того, описаны средства для получения генетически модифицированного растения (например, кукурузы), включающего мутантный ген CAD2 кукурузы, а также средства для идентификации растений (например, кукурузы), несущих мутантный ген CAD2 кукурузы. Средство для получения генетически модифицированного растения, включающего мутантный ген CAD2 кукурузы, является маркером, который связан с или присутствует в мутантном гене CAD2 кукурузы согласно настоящему описанию. Средство для идентификации растений, несущих мутантный ген CAD2 кукурузы, является зондом, который специфично гибридизуется с маркером, связанным с или присутствующим в мутантном гене CAD2 кукурузы согласно настоящему описанию.

Раскрыты способы увеличения количества мяса у животного, откармливаемого силосом, например, путем увеличения отношения прироста веса к массе потребляемого корма (G:F) в случае кукурузного силоса. В некоторых вариантах осуществления, способ увеличения количества мяса у животного, откармливаемого силосом, может включать в себя получение растительного материала, полученного из кукурузы, включающей мутантный ген CAD2 кукурузы согласно настоящему описанию, применение растительного материала для производства кукурузного силоса, и включение кукурузного силоса в конечный рацион для откорма жвачного. Таким образом, мясо и мясные продукты, произведенные из животного, откормленного на конечном рационе согласно настоящему описанию или согласно способу, который также представлен в настоящем описании.

Предыдущие и другие признаки станут более ясны из последующего подробного описания некоторых вариантов осуществления, которые следуют далее со ссылкой на сопровождающие фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 включает диаграмму, на которой показаны относительные длины и положения семи перекрывающихся ПЦР-фрагментов 515Dbm1 CAD2. Фиг.1 также включает диаграмму, на которой показаны относительные длины и положения тринадцати перекрывающихся ПЦР-фрагментов DASbm1 CAD2.

Фиг.2 включает диаграмму, на которой показаны геномная структура вставки в DASbm1 CAD2. Показаны только два первых эндогенных экзона CAD2.

Фиг.3 включает выравнивание геномных последовательностей ZmCAD2 с использованием последовательности B73 из общедоступного образца AC230031. Идентифицированы 15 SNP и 8 вставок/делеций, а также вставка транспозона в DASbm1. AC-вставка присутствует только в мутанте 515Dbm1 в экзоне 3. Экзоны показаны заглавным шрифтом. Интроны и промоторная область показаны строчным шрифтом.

Фиг.4 включает выравнивание предсказанных кДНК последовательностей ZmCAD2, включая кДНК последовательности, амплифицированные с использованием пары праймеров CVF/CVR с DASbm1, 515Dbm1 и дикого типа 6XN442 (подчеркнута). DASbm1 содержит вставку размером 409 п.н.

Фиг.5 включает выравнивание предсказанных последовательностей белка ZmCAD2, при этом показано, что CAD2 из 515Dbm1 содержит только 147 аминокислот из-за наличия AC вставки, которая вызывает сдвиг рамки считывания и вводит преждевременный стоп-кодон. CAD2 из DASbm1 содержит только 48 аминокислот, по сравнению с 367 аминокислотами в CAD2 из 6XB442. Области идентичности выделены полужирным шрифтом. Аминокислотная последовательность B73 CAD2 идентична аминокислотной последовательности 6XN422 CAD2 и поэтому не показана.

Фиг.6 включает данные, показывающие относительные уровни экспрессии РНК CAD2 в средних жилках и листьях кукурузы дикого типа, 515Dbm1 и DASbm1. Данные нормализованы по уровню РНК в средней жилке листьев кукурузы дикого типа 6XN442. Данные представляют собой среднее значение для 3 растений, и планки погрешностей указывают стандартное отклонение.

Фиг.7 включает данные, показывающие относительные количества общего лигнина в кукурузе дикого типа, 515Dbm1 и DASbm1. Данные представляют собой среднее значение для 3 растений, при этом с каждого растения получали по пять образцов из листьев и из междоузлий. Планки погрешностей указывают стандартное отклонение, и P-значения получали с использованием t-критерия Стьюдента.

Фиг.8 включает диаграмму системы анализа KASPar с последовательностями праймеров и матриц. Показаны последовательности матриц 515Dbm1 (SEQ ID NO:45) и 6XN442 (SEQ ID NO:46).

Фиг.9 включает данные, показывающие определение аллеля bm1 с помощью анализа KASPar. Необработанные данные по интенсивности флуоресценции от планшет-ридера анализировали с использованием системы KBioscience Laboratory Information Management System (KLIMS). График, на котором показаны значения RFU FAM, нанесенные в зависимости от RFU от VIC, также был получен при использовании KLIMS. Определение генотипа выполняли на основе разделения кластеров, как показано в изображении кластеров.

Фиг.10 включает данные, показывающие TaqMan определение аллелей CAD2. Аллельную дискриминацию вычисляли при использовании программы для амплификатора iCycler с оптической системой, при этом относительные единицы флуоресценции (RFU) VIC показаны на оси Y, а RFU FAM показаны на оси X.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот, перечисленные в сопровождающем списке последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но при этом следует понимать, что комплементарная цепь включена посредством любой отсылки к показанной цепи. В сопровождающем списке последовательностей:

В SEQ ID NO: 1 показана геномная последовательность 515Dbm1 CAD2 размером 5924 п.н.

В SEQ ID NO: 2 показана предсказанная кДНК последовательность 515Dbm1 CAD21512 размером п.н.

В SEQ ID NO: 3 показана предсказанная последовательность усеченного белка 515Dbm1 CAD2 размером 147 аминокислот.

В SEQ ID NO: 4 показана геномная последовательность 6XN442 CAD2 размером 5898 п.н.

В SEQ ID NO: 5 показана предсказанная кДНК последовательность 6XN442 CAD2 размером 1510 п.н.

В SEQ ID NO: 6 показана предсказанная последовательность белка 6XN442 CAD2 размером 367 аминокислот.

В SEQ ID NO: 7 показана геномная последовательность B73 CAD2 размером 5916 п.н.

В SEQ ID NO: 8 показана предсказанная кДНК последовательность B73 CAD2 размером 1510 п.н.

В SEQ ID NO: 9-22 показаны прямые и обратные праймеры, используемые для амплификации семи перекрывающихся фрагментов CAD2, а также мутанта 515Dbm1 и кукурузы дикого типа 6XN442.

В SEQ ID NO: 23 показана геномная последовательность DASbm1 CAD2 размером 9360 п.н.

В SEQ ID NO: 24 показана неполная кДНК последовательность DASbm1 CAD2, амплифицированная с использованием пары праймеров CVF/CVR.

В SEQ ID NO: 25 показана предсказанная последовательность усеченного белка DASbm1 CAD2 размером 48 аминокислот.

В SEQ ID NO: 26-34 показаны прямые и обратные праймеры, используемые для амплификации неполных фрагментов CAD2 из мутанта DASbm1.

В SEQ ID NO: 35 и 36 показаны прямой и обратный праймеры, используемые для амплификации неполного кДНК фрагмента CAD2.

В SEQ ID NO: 37-39 показаны прямые и обратный праймеры, используемые для амплификации неполных фрагментов CAD2 из мутанта DASbm1.

В SEQ ID NO: 40 показана вставка транспозона длиной 3444 п.н. в DASbm1 CAD2.

В SEQ ID NO: 41 показана дуплицированная последовательность длиной 11 п.н. во вставке транспозона DASbm1 из первого интрона CAD2: TACTGATATCT.

В SEQ ID NO: 42-44 показаны праймеры, используемые в анализе KASPar™ для дифференцирования аллеля 515Dbm1 от других аллелей bm1 и CAD2 дикого типа.

В SEQ ID NO: 45 и 46 показаны последовательности матриц, с которыми праймеры отжигаются в анализе KASPar. SEQ ID NO: 45 представляет собой геномную последовательность из 515Dbm1. SEQ ID NO: 46 представляет собой геномную последовательность из 6XN442.

В SEQ ID NO: 47 показан зонд, специфичный к мутанту DASbm1.

В SEQ ID NO: 48 показан зонд, специфичный к аллелю CAD2 дикого типа.

В SEQ ID NO: 49-51 показаны праймеры, используемые в анализе KASPar™ для дифференцирования аллелей DASbm1 и CAD2 дикого типа.

В SEQ ID NO: 52 показан зонд, специфичный к мутанту 515Dbm1.

В SEQ ID NO: 53 показан зонд, специфичный к аллелю CAD2 дикого типа.

В SEQ ID NO: 54 и 55 показаны праймеры, используемые в анализе KASPar™ для дифференцирования аллелей 515Dbm1 и CAD2 дикого типа.

В SEQ ID NO: 56-61 показаны праймеры и зонды, используемые для кПЦР-ОТ CAD2 и контролей.

В SEQ ID NO: 62 показана нуклеотидная последовательность первого экзона CAD2.

В SEQ ID NO: 63 показана нуклеотидная последовательность второго экзона CAD2.

В SEQ ID NO: 64 показана нуклеотидная последовательность третьего экзона CAD2.

СПОСОБ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Краткий обзор нескольких вариантов осуществления

Мутант bm1 включает неописанную ранее мутацию, которая колокализована с локусом CAD (Halpin et al. (1998), выше; Guillaumie et al. (2007), выше). В настоящей заявке описана идентификация специфических мутаций в кодирующей последовательности CAD2 Zea mays, которые вносят вклад в bm1 фенотип. Некоторые варианты осуществления включают мутантный ген CAD2, клонированный из общедоступной линии кукурузы bm1, 515Dbm1, который содержит AC вставку в 3-ем экзоне, что приводит к образованию усеченного белка CAD2. Некоторые варианты осуществления включают мутантный ген CAD2, клонированный из недавно обнаруженной линии кукурузы bmr, DASbm1, который содержит вставку транспозона, которая приводит к особому усеченному белку CAD2. Растения DASbm1 имеют значительно более низкие уровни экспрессии РНК CAD2, чем растения дикого типа, а также демонстрируют пониженное содержание лигнина. Также описано создание, проверка и применение высокоэффективных маркеров, связанных с каждой конкретной мутацией.

Молекулярная основа фенотипа bm1 не известна настолько, насколько известна, например, bm3. Halpin с сотр. (1998), см. выше, показали, что активности CAD, уровни белка и транскрипта, были значительно снижены в генотипах bm1, и ген CAD, позднее идентифицированный как CAD2, был картирован близко сцепленным с локусом bm1. Поскольку некоторое количество белка и мРНК CAD можно обнаружить в мутантных растениях, авторы предположили, что bm1 не была нулевой мутацией CAD2, а вместо этого влияла на его экспрессию посредством регуляторных элементов (Halpin et al. (1998), выше). Последующие исследования экспрессии генов с использованием микрочипов показали, что большое количество генов, помимо только CAD2, характеризовались пониженной экспрессией в растениях bm1 (Guillaumie et al. (2007), выше). Такое множество генов с пониженной экспрессией включали много генов пути биосинтеза лигнина и факторов транскрипции, что приводило к дальнейшему предположению, что возможно один из факторов транскрипции был ключевым геном для bm1.

Позднее было показано, что нонсенс-мутации в гене сорго SbCAD2 являлись ключевым механизмом в случае bmr мутанта сорго, bmr6, в некоторых сортах (Saballos et al. (2009) Genetics 181:783-95; Sattler et al. (2009) Plant Physiology 150:584-95). Нонсенс-мутация содержит замену C на T, которая создает преждевременный стоп-кодон и приводит к усеченному белку SbCAD2, который не имеет NADPH-связывающего и C-концевого каталитического доменов. Id.

Ввиду вышеизложенного, была поставлена под сомнение общепринятая теории, что bm1 фенотип связан с мутацией в факторе транскрипции или регуляторном элементе гена, и было проведено исследование с целью определить, могла ли мутация в CAD2 кукурузы давать фенотип bm1. Тщательная проверка генетической/физической карты кукурузы в области локусов bm1 и CAD2 показала, что CAD2 кукурузы расположен очень близко к центромере на хромосоме 5. Такая близость представляет существенное затруднение для генного картирования высокого разрешения вследствие известной супрессии рекомбинации вблизи центромерных областей. Поэтому, успех традиционных методов картирования генов был по меньшей мере непредсказуем, если не полностью маловероятен, и был разработан основанный на ПЦР метод клонирования гена-кандидата для идентификации каких-либо определенных мутаций в ZmCAD2, которые могли быть ответственны за bm1 фенотип в рассматриваемых сортах кукурузы.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, идентификация определенных мутантов CAD2 может быть выполнена с применением основанного на ПЦР метода клонирования. В некоторых вариантах осуществления, CAD2 Zea mays может быть клонирован как из bm1, так и из зародышевой плазмы дикого типа, с целью идентификации определенной мутации в CAD2 из зародышевой плазмы bm1. В конкретных вариантах осуществления, в зародышевой плазме bm1 идентифицирована мутация со вставкой динуклеотида AC, приводящая к сдвигу рамки считывания. В других вариантах осуществления, в зародышевой плазме bm1 идентифицирована вставка транспозона длиной 3444 пары оснований в первом интроне CAD2. Конкретный мутантный ген CAD2, приводящий к bm1 фенотипу в кукурузе, описанный в настоящей заявке, включает вставку динуклеотида AC в третьем экзоне гена CAD2, клонированного из сорта bm1, 515Dbm1.

Другой мутантный ген CAD2, приводящий к bm1 фенотипу в кукурузе, описанный настоящей заявке, включает вставку транспозона в гене CAD2 нового сорта bm1, DASbm1. Идентифицированная вставка имеет длину 3444 пары оснований и расщеплена на три экзона (409 пар оснований), которые формируют химерную мРНК с CAD2. Химерная мРНК вызывает сдвиг рамки считывания и вводит преждевременный стоп-кодон в кодирующей области, что приводит к усеченному белку CAD2 размером лишь 48 аминокислот. Указанный усеченный белок не имеет NADPH-связывающего и C-концевого каталитического доменов, и поэтому наиболее вероятно нефункционален, даже если он продуцируется в клетке.

Растения DASbm1, как и 515Dbm1, имеют значительно сниженные уровни РНК CAD2 и пониженное содержание общего лигнина. Как было определено, CAD2 является ключевым геном в фенотипе кукурузы bm1 в таких природных мутантах и обеспечивает молекулярную основу для наблюдаемого фенотипа bmr. С учетом вставки транспозона в DASbm1 и AC вставки в 515Dbm1, высокопроизводительные анализы KASPar и TaqMan для обнаружения указанных конкретных аллелей CAD2 и их дифференцирования от аллелей дикого типа были определены и оценены. Данные анализы могут применяться для идентификации зародышевой плазмы bm1, для ускорения интрогрессии признака bm1, а также для облегчения молекулярной селекции растений, обеспечивающих, например, получение силоса с улучшенной перевариваемостью и/или повышенный выход этанола для получения биотоплива. Последовательности модифицированного гена CAD2 могут применяться для введения фенотипа bm1 в новые генотипы кукурузы или другие культуры, например, сорго и просо, с использованием трансгенных методов. Фенотип bm1 и другие bmr фенотипы также могут применяться в качестве маркеров визуальной селекции для трансгенов в сочетании с технологией EXZACT Precision Technology (Dow AgroSciences).

Высокоэффективные ПЦР-маркеры могут применяться, среди прочего: для идентификации в организме мутации CAD2, которая вносит вклад в фенотип bm1 в кукурузе; для введения в организм (например, растение) мутации CAD2, которая вносит вклад в фенотип bm1 в кукурузе; и для облегчения селекции кукурузы bm1 с использованием маркеров. Таким образом, также описано создание, проверка и применение конкретных высокоэффективных ПЦР-маркеров на основе определенных мутаций в CAD2 (например, мутация со сдвигом рамки считывания и вставка транспозона).

II. Сокращения

4CL	гидроксициннамат-кофермент А лигазы
ABC-переносчик	переносчик АТФ-связывающей кассеты
AGO	ARGONAUTE
APL	ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT
bmr	Brown midrib
bZIP	мотив основного домена/лейциновая молния
CAD	циннамилалкогольдегидрогеназа
CAD1	циннамилалкогольдегидрогеназа 1
CAD2	циннамилалкогольдегидрогеназа 2
CCR	циннамоил-КоА редуктаза
COMT	3-O-метилтрансфераза кофейной кислоты
COV1	CONTINUOUS VASCULAR RING-1
DFR	дигидрофлавоноидредуктаза
ZmCAD1 EgCAD1-типа	циннамилалкогольдегидрогеназа 1 кукурузы EgCAD1-типа
EST	маркер экспрессируемой последовательности

F5H	цитохром P450-зависимые ферулат-5 гидроксилазы
FAM	флуорофор 6-карбоксифлуоресцеин
HCT	гидроксициннамоил-КоА трансфераза 2
KLIMS	KBioscience Laboratory Information Management System
LIM	гомеодомен LIM
MADS-бокс	консервативный мотив поледовательности MADS (MCM1,AGAMOUS, DEFICIENS, SRF)
MP	MONOPTEROUS
OMT	O-метилтрансфераза
ORF	открытая рамка считывания
PAL	Фенилаланинаммоний-лиаза
ПЦР	Полимеразная цепная реакция
RFU	Относительные единицы флуоресценции
SAD	синапилалкогольдегидрогеназа
SAMS3	S-аденозил-метионинсинтаза 3
VIC®	флуорофор VIC® (Applied Biosystems)

III. Термины

Бэккроссинг или обратное скрещивание: методы обратного скрещивания могут использоваться для введения последовательности нуклеиновой кислоты в растения. Метод обратного скрещивания широко использовался в течение многих десятилетий для введения новых признаков в растения (Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988). В типичной методике обратного скрещивания исходный целевой сорт (рекуррентный родитель) скрещивают со вторым сортом (нерекуррентным родителем), несущим целевой ген, который нужно передать. Полученное потомство от этого кросса затем снова скрещивают с рекуррентным родителем и повторяют процесс до тех пор, пока не будет получено растение, обладающее по существу всеми требуемыми морфологическими и физиологическими характеристиками рекуррентного растения, в дополнение к переданному гену от нерекуррентного родителя.

Растение кукурузы: Используемый в настоящем описании термин "растение кукурузы" относится к растению вида Zea mays (кукуруза сахарная или маис).

Кукуруза BM: Используемый в настоящем описании термин "кукуруза BM" (или "кукуруза BMR") относится к сортам кукурузы, которые содержат мутацию brown midrib. Сорта кукурузы BM обычно демонстрируют красновато-коричневую пигментацию средней жилки листа. Кукуруза BM также обычно характеризуется более низким содержанием лигнина, более высокой перевариваемостью волокна и более высоким накоплением сухого вещества. Неограничивающие примеры сортов кукурузы BM включают сорта кукурузы bm1; например, 515Dbm1.

Фенотип bm1: Используемый в настоящем описании термин "фенотип bm1" может относиться к профилю измененного содержания и/или состава лигнина, который наблюдался в кукурузе bm1. В качестве неограничивающего примера, фенотип bm1 может быть охарактеризован одной или более следующими особенностями: содержание лигнина, которое снижено на 10-20% по сравнению с содержанием лигнина в растении дикого типа тех же видов (Guillaumie et al. (2007), выше); пониженное содержание сложных эфиров феруловой кислоты (Id.); пониженное содержание простых эфиров феруловой кислоты (Id.); уменьшенное содержание сложных эфиров п-кумаровой кислоты (Marita et al. (2003) J. Agric. Food Chem. 51:1313-21); повышенные уровни альдегидов (Id).; обогащение лигнинов углерод-углеродными межсубъединичными связями (Halpin et al. (1998), выше; Barriére et al. (2004), выше); а также существенное включение в лигнины кониферилового альдегида и/или синапового альдегида (Kim et al. (2002), выше; и Barriére et al. (2004), выше).

Сухое вещество: Используемый в настоящем описании термин "сухое вещество" относится к любому корму, включая фураж.

Система SNP генотипирования на основе конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASPar™) KBiosciences: KASPar™ представляет собой коммерческую гомогенную флуоресцентную систему для определения SNP генотипов (KBiosciences Ltd., Hoddesdon, UK). Анализ KASPar™ включает SNP-специфичную "аналитическую смесь", которая содержит три немеченых праймера, и "реакционную смесь", которая содержит все остальные необходимые компоненты, например, универсальную флуоресцентную репортерную систему. В дополнение к указанным смесям, пользователь обеспечивает, среди прочего, FRET-совместимый планшет-ридер, микротитровальный планшет(ы) и образцы ДНК, которые содержат приблизительно 5 нг/л ДНК.

Типовой анализ KASPar™ включает следующие этапы: подбор аллель-специфичных праймеров (например, с использованием PrimerPicker™, который является бесплатным сервисом, доступным через Интернет на веб-сайте KBiosciences); приготовление реакционной смеси, включающей аллель-специфичные праймеры; добавление реакционной смеси к образцам ДНК в микротитровальном планшете; амплификацию; сканирование планшета на флуоресцентном планшет-ридере; и построение кривых и оценку флуресцентных данных. Данные для каждого образца наносят вместе на 2-мерный график, где оси X и Y соответствуют значениям флуоресценции FAM и VIC. Образцы, имеющие один и тот же SNP генотип, объединяют в кластер на графике (то есть A/A; A/a и a/a). Дополнительную техническую информацию о системе KASPar, включая руководство по решению часто встречаемых проблем, можно получить от KBiosciences Ltd. (например, из руководства KASPar SNP Genotyping System Reagent Manual).

Сцепленный, сильно сцепленный и очень сильно сцепленный: Используемое в настоящем описании сцепление между генами или маркерами может относиться к такому явлению, когда гены или маркеры на хромосоме показывают измеряемую вероятность совместного переноса в индивидуальные организмы в следующем поколении. Чем ближе друг к другу расположены два гена или маркера, тем ближе к (1) становится данная вероятность. Таким образом, термин "сцепленный" может относиться к одному или более генам или маркерам, которые передаются вместе с геном с вероятностью больше 0,5 (что ожидается из независимого распределения, когда маркеры/гены расположены на различных хромосомах). Когда присутствие гена вносит вклад в фенотип индивидуального организма, можно сказать, что маркеры, которые сцеплены с геном, связаны с фенотипом. Таким образом, термин "сцепленный" может относиться к взаимосвязи между маркером и геном или между маркером и фенотипом.

Поскольку близость двух генов или маркеров на хромосоме непосредственно связана с вероятностью того, что гены или маркеры будут вместе передаваться индивидуальным организмам в следующем поколении, термин "сцепленный" также может относиться в настоящем описании к одному или более генам или маркерам, которые расположены в пределах приблизительно 2,0 мпн друг от друга на одной и той же хромосоме кукурузы. Таким образом, два "сцепленных" гена или маркера могут быть разделены приблизительно на 2,1 мпн; 2,00 мпн; приблизительно на 1,95 мпн; приблизительно на 1,90 мпн; приблизительно на 1,85 мпн; приблизительно на 1,80 мпн; приблизительно на 1,75 мпн; приблизительно на 1,70 мпн; приблизительно на 1,65 мпн; приблизительно на 1,60 мпн; приблизительно на 1,55 мпн; приблизительно на 1,50 мпн; приблизительно на 1,45 мпн; приблизительно на 1,40 мпн; приблизительно на 1,35 мпн; приблизительно на 1,30 мпн; приблизительно на 1,25 мпн; приблизительно на 1,20 мп