Генно-модифицированные организмы для получения липидов

Генно-модифицированные организмы для получения липидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение направлено на генно-модифицированные организмы не млекопитающих, в частности микроорганизмы, в которых определенные ферментные активности уменьшены и/или повышены, которые являются полезными в промышленном биосинтезе липидов, в частности нейтральных липидов. Данное изобретение дополнительно относится к применениям таких организмов, транспортным основам для получения таких организмов и способам получения таких организмов.

Предпосылки создания изобретения и уровень техники

Липиды являются гидрофобными или амфифильными малыми молекулами, которые образовываются полностью или частично при помощи карбанионных конденсаций тиоэфиров, например, жирных кислот или поликетидов, и/или при помощи карбанионных конденсаций изопреновых звеньев, например, пренолов или стеролов. Данная группа включает несколько веществ высокой экономической важности. Группа триглицерол-липидов включает, например, масла, жиры или воски, которые используют в широком разнообразии контекстов, например, в качестве ингредиентов для пищевой промышленности или для приготовления пищи, для получения мыл, продуктов по уходу за кожей, духов и других средств личной гигиены и косметических продуктов. Для получения красок и других продуктов обработки древесины, в качестве биоразлагаемых изоляторов в электротехнической промышленности, для получения биоразлагаемых гидравлических жидкостей, в качестве смазывающих веществ, или даже в качестве основы биодизельного топлива, которое может быть использовано для замещения традиционных дизелей. Изопреноид-липидный сквален, например, используют в качестве адъюванта в вакцинах или других фармацевтических средствах, пищевых добавках, косметических средствах, а также безрецептурных лекарственных средствах. Сквален может быть также использован в качестве билдинг-блока для синтеза терпенов. Дополнительно сквален может быть использован в промышленности в качестве биоразлагаемого смазочного вещества. Другими экономически важными липидами являются стеролы, такие, как эргостерол, зимостерин, эпистерол, вещество для получения таких соединений, как сапонин, стероидные гормоны, витамины и фармацевтические вещества.

Липиды, в частности нейтральные липиды, обычно сохраняются в клетке в специфичных внутриклеточных органеллах, известных как липидные частицы. Данные частицы характеризуются простой структурой, состоящей из высокогидрофобного монослоя с только небольшим количеством включенных белков. Липиды сохраняются в липидных частицах, пока гидролиз не направит возврат их компонентов в метаболические и/или катаболические маршруты. Данный процесс образования липидных депо широко используют в природе, и все типы эукариотных клеток содержат внутриклеточные липидные частицы, которые также могут иметь название липидных телец, липидных капель, масляных телец или олеосом. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae липидные капли накапливают до 70% общего содержаний липидов клетки.

Поскольку большинство из перечисленных липидов получают из природных источников, например, растений, животных или микроорганизмов, были предприняты попытки повысить количество липидов живых клетках, т.е., накопить большее количество липидов в липидных частицах. Для этого, как известно, модифицируют метаболические маршруты организмов. Документ ЕР-0486290 А описывает избыточную экспрессию генов метаболизма эргостерола в дрожжах, приводящую к увеличению эргостерола в клетках. Документ WO03/064652 А описывает способ продуцирования зимостерина на основе увеличения ланостерин-С14-деметилазнойы и HMG-CoA-редуктазной активности. В документе WO2004/083407 А описаны тренсгенные организмы, имеющие пониженную Δ22-десатуразную активность и повышенную активность HMG-CoA редуктазы, ланостерин С14-деметилазы, сквален эпоксидазы и сквален синтетазы. Такие организмы могут быть использованы для выработки стерол липид эргоста-5,7-диенола. Таким образом, путем биологического модифицирования организмов, вырабатывающих липиды, выход полученных липидов может быть существенно увеличен.

Однако полученные липидные соединения в основном не очищены и перемешаны и должны быть разделены и/или очищены, в частности, если липиды предназначены для применения в качестве исходного вещества для дополнительных химических синтезов или модификаций. Дополнительно, любая процедура очистки, в особенности при проведении в промышленном масштабе, является дорогой, трудоемкой и имеет тенденцию к загрязнению окружающей среды.

Техническая проблема данного изобретения

Соответственно, техническая проблема, лежащая в основе данного изобретения, включает обеспечение средств и способов, позволяющих выработку липидов организмами в более чистой форме во избежание трудоемких и дорогостоящих процедур очистки.

Краткое описание данного изобретения и преимущественные варианты исполнения изобретения

Для решения такой технической проблемы, данное изобретение описывает организм в соответствии с п.1. Преимущественные варианты исполнения описаны в пунктах, зависимых от п.1. В них выражение "генно-модифицированные" предназначено для включения не только организмов, в которых геном был модифицирован способами генной инженерии, известными из уровня техники, которые были выбраны из мутантной группы в соответствии с целевой генной модификацией (традиционный мутагенез).

Данное изобретение основано на открытии, что возможно генно конструировать или биохимически модифицировать организмы таким образом, чтобы конкретные (нейтральные) липиды накапливаются в липидных частицах в более чистой форме. Организмы в соответствии с данным изобретением модифицированы таким образом, который устраняет или уменьшает синтез нежелательных стерилацильных эфиров и/или триацилглицеринов и/или восковых эфиров, в зависимости от липида, который предназначен для выработки организмом при более высокой чистоты. В дополнение к накоплению нейтрального липиды в более чистом виде, такое уменьшение или устранение возможно загрязняющих стерилацильных эфиров и/или триацилглицеринов и/или восковых эфиров также неожиданно приводят к увеличенным уровням и выходам целевого липида. Это может быть вызвано, не будучи связанными данной теорией, с увеличенным объемом хранения липидных частиц и/или повышенной биодоступностью субстрата для синтеза целевого липида.

Термин "нейтральный липид" относится к липидам, не имеющим заряженных групп и поэтому неспособных интегрироваться в двухслойные мембраны в существенных количествах. Термин включает триацилглицерины (TAGs), стерилацильные эфиры (SAEs) и восковые эфиры (WEs). Сквален также относится к классу "нейтральных липидов". Обычно, содержимое липидной частицы представляет собой смесь различных нейтральных липидов, что препятствует эффективной выработке целевого конкретного нейтрального липиды в рекомбинантном организме. Эту проблему решает данное изобретение путем модификации вырабатывающего организма таким образом, что как минимум один тип нейтрального липида, встречающегося в природе в указанном организме в указанной липидной частице, более не синтезируется таким образом. В результате, композиция оставшихся нейтральных липидов, содержащихся в липидной частице, становится более чистой и, таким образом, более привлекательной для выработки в коммерческих целях.

В общем, может быть применена любая одна активность или комбинация различных активностей (две, три или четыре) в соответствии с п.1, в зависимости от нейтрального липида, предназначенного для синтеза с более высокой чистотой, или, в свою очередь, в зависимости от нейтрального липида, который предназначен для удаления в биосинтезе как нежелательное загрязнение. Таким образом, существуют различные варианты исполнения данного изобретения и только конкретные варианты исполнения изобретения будут описаны далее более подробно.

Таким образом, в первом варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением модифицирован таким образом, что более не синтезирует стерилацильный эфир (SAE). Стерилацильные эфиры являются эфирами стеролов с длинноцепочечными жирными кислотами. В общем, синтез SAEs происходит в клетках при помощи ферментного механизма, задействующего ацил-СоА: стеролацил трансфераза/стерол O-ацилтрансферазу (ЕС 2.3.1.26). Катализируемая реакция представляет собой этерификацию стеролов длинноцепочечными жирными кислотами. Таким образом, в преимущественном варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением модифицирован таким образом, что активность ацил-СоА: стерол ацилтрансферазы/стерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.26) уменьшена по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа.

В дрожжах, в частности в S. cerevisiae, этерификация стеролов с получением стерилацильных эфиров достигается двумя изоферментами стерилацил трансферазы, т.е. Are1p и Are2p, имеющими различные специфичные афинности для различных стерольных промежуточных веществ. Are1p приводит в частности к этерификации предшественников эргостерола, таких, как ланостерин, зимостерин, эргоста-5,7-диенол и вещества, чужеродные дрожжам, такие, как 7-дегидро холестерин. Are2p приводит преимущественно к этерификации эргостерола, конечного продукта маршрута биосинтеза эргостерола в дрожжах. Если организм является дрожжевым организмом, в частности рода Saccharomyces и, преимущественно, S. cerevisiae, активность Are1p или Are2p или обоих, Are1p и Are2p, может быть снижена или устранена по сравнению с соответствующим немодифицированным дрожжевым организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа. При устранении обеих ферментных активностей, в клетках не происходит этерификания стеролов. Путем устранения только одной активности и сохранения другой, возможно получить, при желании, определенный тип стерилацильного эфира в клетках, если ферментные активности, приводящие к определенным стеролам, соответственно сохранены или адаптированы в организме.

В связи с первым аспектом данного изобретения, в котором организм отличается тем, что более не синтезирует стерильный ациловый сложный эфир, организм в соответствии с данное изобретение может в принципе быть любым возможным организмом, растительным организмом, грибковым организмом или бактериальным организмом. Однако, преимущественно организм получен из организма, который не сохраняет природно восковые эфиры в его липидных частицах, а только другие липиды, например, триацилглицерины и стерилацильные эфиры. Таким образом, путем устранения биосинтетического маршрута для синтеза стерилацильного эфира, такой организм накапливает в его липидных частицах в основном только триацилглицерины, таким образом, позволяя продуцировать в такой организм триацилглицерины в скорее чистой форме из липидных частиц. Примеры организмов, которые не накапливают природно восковые эфиры в их липидных частицах, в частности главным образом, представляют собой животных, клетки грибов и большинство растительных клеток, за исключением водорослей и клеток планктона. В особо преимущественном варианте исполнения изобретения в связи с первым аспектом данного изобретения, организм является грибковым организмом, преимущественно грибковым организмом рода, выбранного из группы, состоящей из Yarrowia, Rhodotorula, Lipomyces, Candida, Rhodosporidium, Mortierella, Mucor, Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Aspergillus, Penicillium и Dictyostelium. Особо преимущественным являются грибковые организмы вида Yarrowia lipolytica, Rhodotorula glutinis, Lipomyces starkeyi, Candida curvata, Rhodosporidium tortuloides, Mortierella isabellina, Mucor javonicus, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, виды Kluyveromyces, виды Aspergillus, виды Penicillium или виды Dictyostelium. В особо преимущественном варианте исполнения изобретения первого аспекта данного изобретения организм представляет собой S. cerevisiae.

Во втором варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением модифицирован таким образом, что более не синтезирует стерилацильный эфир (SAE) и восковый эфир (WE). В общем, синтез WEs происходит в клетках по ферментному механизму, включающему ацил СоА-воск спиртовые ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.75). Таким образом, в преимущественном варианте исполнения второго аспекта данного изобретения, организм в соответствии с данным изобретением модифицирован таким образом, что активность ацил-СоА: стерол ацилтрансферазы/стерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.26) и ацил СоА-воск спиртовой ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.75) уменьшена по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа.

Организм в соответствии с данным изобретением в связи со вторым аспектом данного изобретения накапливает в липидных частицах главным образом триацилглицерины, поскольку синтез стерилацильных эфиров и восковых эфиров уменьшен, преимущественно, полностью устранен. Такие организмы поэтому являются приемлемыми для выработки, в частности в промышленном масштабе, триацилглицеринов в чистом виде.

Организм в соответствии со вторым аспектом данного изобретения, преимущественно, получают из организма, которые природно вырабатывает восковые эфиры и хранит их внутриклеточно в липидных частицах. Организмы, вырабатывающие и сохраняющие восковые эфиры представляют собой, например, растений и насекомые, в которых их используют для обеспечения гидрофобной оболочки тканей для минимизирования дегидратации поверхностей, водорослей, планктонных организмов и бактерий.

В преимущественном варианте исполнения второго аспекта данного изобретения, организм представляет собой бактериальный организм, преимущественно рода Mycobacterium, Streptomyces, Rhodococcus, Nocardia, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia или Lactobacillus. Наиболее преимущественно организм представляет собой Escherichia coli.

Дополнительно, не только возможно получить в таком организме в соответствии с данным изобретением триацилглицерины, которые природно получают в организме, или в количестве, в котором они природно вырабатываются в организме, но также возможно генно модифицировать такой организм для увеличения количества одного или более конкретных триацилглицеринов, природно вырабатываемых в указанном организме или генно модифицировать такой организм таким образом, чтобы привести к синтезу одного или более триацилглицеринов, которые/который не вырабатываются таким организмом.

В особо преимущественном варианте исполнения изобретения триацилглицерин, который накапливается организмом в соответствии с данным изобретением, является эфиром глицерина и как минимум одной ненасыщенной жирной кислоты и более преимущественно указанной ненасыщенной жирной кислотой является омега-3 жирная кислота. В принципе, указанная омега-3 жирная кислота может быть любой возможной омега-3 жирной кислотой, но преимущественно, является α-линоленовой кислотой (ALA), стеаридоновой кислотой, эйкозосатететраноевой кислотой, эйкозопентаноевой кислотой (ЕРА), докозопентаноевой кислотой (DPA) или докозогекасноевой кислотой (DHA).

В другом преимущественном варианте исполнения изобретения ненасыщенная жирная кислота в триацилглицерине представляет собой омега-6 жирную кислоту. В принципе, указанная омега-6 жирная кислота может быть любой возможной омега-6 жирной кислотой, но преимущественно она является линолевой кислотой, гамма-линоленовой кислотой, эйкозодеканоевой кислотой, дигомо-гамма-линоленовой кислотой, арахидоновой кислотой, докозадеканоевой кислотой, адреновой кислотой, докозапентаноевой кислотой или календовой кислотой.

В другом преимущественном варианте исполнения изобретения ненасыщенная жирная кислота в триацилглицерине является омега-9 жирной кислотой. В принципе, омега-9 жирная кислота может быть любой возможной омега-9 жирной кислотой, но преимущественно, она является олеиновой кислотой, эйкозоноевой кислотой, медовой кислотой, эруковой кислотой или ацетэруковой кислотой.

Первый и второй варианты исполнения изобретения могут быть дополнительно улучшены, как описано далее. Триацилглицерины в общем образуются путем этерификации диацилглицерола с длинноцепочечными жирными кислотами или фосфолипидами. Этерификация с длинноцепочечными жирными кислотами катализируется диацилглицерол ацилтрансферазой/диацилглицерол O-ацилтрансферазой (ЕС 2.3.1.20). Этерификация с фосфолипидами катализируется лецитин холестеринацил трансферазой/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазой (ЕС 2.3.1.158). В особо преимущественном варианте исполнения изобретения организм в соответствии с третьим или вторым аспектом данного изобретения отличается тем, что активность диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20) и/или активность лецитин холестеринацил трансферазы/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158) повышена в сравнении с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа. Повышение активности одного или обоих указанных выше ферментов приводит к увеличению синтеза TAGs в клетках организма.

Отдельно от этого, также возможно генно модифицировать организм таким образом, чтобы позволить организму вырабатывать определенные жирные кислоты для включения в TGAs или для повышения выработки таких жирных кислот, если они уже природно вырабатываются в таком организме для увеличения их содержания в TGAs, вырабатываемых в указанном организме. Например, если предполагается увеличить TGAs, вырабатываемые в организме, то количество омега-3 жирных кислот, таких, как эйкозопентаноевая кислота (ЕРА), докозапентаноевая кислота (DPA) и/или докозагексаноевая кислота (DHA), то будет полезным увеличить такие ферментные активности: Δ12 жирнокислотную десатуразу (ЕС 1.14.19), Δ15-десатуразу (ЕС 1.14.19), Δ6 жирнокислотную десатуразу (ЕС 1.14.19.3), жирнокислотную элонгазу, Δ5-десатуразу/Δ5-жирнокислотную десатуразу (ЕС 1.14.19) и Δ4 жирнокислотную десатуразу (ЕС 1.14.19). Таким образом, в преимущественном варианте исполнения изобретения органика отличается тем, что активность диацилглицерола ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20) и/или лецитин холестеринацил трансфераза/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158) и как минимум одной из активностей, выбранного из группы, состоящей из Δ12 жирнокислотной десатуразы (ЕС 1.14.19), Δ15-десатуразы (ЕС 1.14.19), Δ6 жирнокислотной десатуразы (ЕС 1.14.19.3), жирнокислотной элонгазы, Δ5-десатуразы/Δ5-жирнокислотной десатуразы (ЕС 1.14.19) и Δ4 жирнокислотной десатуразы (ЕС 1.14.19) повышено по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа. Например, растения и некоторые грибы способны к выработке омега-3 и омега-6 жирных кислот, в то время как, например, Saccharomyces cerevisiae может синтезировать только омега-9 жирные кислоты. Таким образом, если организм в соответствии с данное изобретение является Saccharomyces cerevisiae, то может быть желательным ввести в клетки такие ферментные активности, которые необходимы для выработки омега-3 и/или омега-6 жирных кислот. Подходы для введения соответствующих генов в дрожжевые клетки уже были описаны в литературе, также как и соответствующие гены (см., например, WO2004/101575). Гетерологический биосинтез конкретных жирных кислот, например, в дрожжевых клетках, например, описан в Beaudoin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(2000), 6421-6426) и в Veen et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 63(2004), 635-646).

Данное изобретение также относится к способу получения триацилглицерина, включающего культивирование организма в соответствии с первым или вторым аспектом данного изобретения. Как описано выше, такие организмы способны к накоплению в их липидных частицах больших количеств триацилглицеринов в основном чистом виде, TAGs могут быть выделены из организмов в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. Например, из уровня техники известно, как выделить липидные частицы из клеток и каким образом выделить из них нейтральные липиды, содержащиеся в них. Пример такого способа описан для организма Saccharomyces cerevisiae в прилагающихся Примерах.

Данное изобретение также относится к способу получения триацилглицерина, который представляет собой эфир глицерина и как минимум одной ненасыщенной жирной кислоты, включающий

(i) уменьшение или устранение при помощи ингибитора активности ацил-СоА: стеролацил-трансфераза/стерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.26) и/или ацил СоА-воск спиртовой ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.75); и

(ii) повышение активности диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20) и/или лецитин холестеринацил трансферазы/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158)

в организме по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа. Организм культивируют и TAGs могут быть выделены.

Касательно ненасыщенной жирной кислоты(кислот) которые должны содержаться в триацилглицерине, который предполагается получить, то же самое применяется в отношении преимущественных вариантов исполнения изобретения, которые уже были описаны выше в отношении природы полиненасыщенной жирной кислоты(кислот) и ферментной активности, которая должна быть повышена. В особо преимущественном варианте исполнения изобретения, полиненасыщенная жирная кислота представляет собой омега-3 жирную кислоту и повышенная ферментная активность является как минимум одной из активностей, приведенных в данной заявке дополнительно выше в связи с омега-3 жирными кислотами.

В третьем варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением модифицирован таким образом, что более не синтезирует триацилглицерина (TAG) и стерилацильный эфир (SAE).

Как описано выше, в общем синтез TAGs происходит при помощи ферментной активности диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20) и лецитин холестеринацил трансферазы/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158). Таким образом, в преимущественном варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением модифицирован таким образом, что активность ацил-СоА: стерол ацилтрансферазы/стерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.26) диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20) и лецитин холестерин ацилтрансферазы/фосфолипид:диациглицерина ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158) уменьшена по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа.

В преимущественном варианте исполнения изобретения организм в соответствии с третьим аспектом данного изобретения представляет собой организм, который получен из организма, который природно вырабатывает и сохраняет восковые эфиры. Такие организмы уже описаны выше. Преимущественно организм является бактериальным организмом, как уже описано выше, наиболее преимущественно, Escherichia coli. Ввиду устранения синтеза TAG и SAE, такой организм будет приемлемым для основного накопления в его липидных частицах восковых эфиров. В особо преимущественном варианте исполнения изобретения такой организм дополнительно отличается тем, что проявляет увеличение активности ацил-СоА воск спиртовой ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.75) по сравнению с соответствующим немодифицированным штаммом, преимущественно, соответствующим штаммом дикого типа. Это позволит увеличить количество восковых эфиров, синтезированных в организме. Средства и способы повышения активности целевого фермента в клетках организма известны специалисту в данной области и описаны в данной заявке дополнительно ниже.

В другом преимущественном варианте исполнения изобретения организм в соответствии с третьим аспектом данного изобретения получен из организма, который природно не вырабатывает и хранит восковые эфиры. Такие организмы были описаны выше в связи с первым аспектом данного изобретения. Преимущественно, такой организм является грибковым организмом, как описано выше, более преимущественно рода Saccharomyces и наиболее преимущественно вида Saccharomyces cerevisiae. Ввиду устранения синтеза TAG и SAE, липидные частицы такого организма могут быть использованы для накопления рассматриваемого липида, например, сквалена, как описано дополнительно ниже.

В четвертом варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением модифицирован таким образом, что более не синтезирует восковый эфир (WE), триацилглицерин (TAG) и стерилацильный эфир (SAEs). В данном аспекте организм в основном не хранит какие-либо WEs, TAGs и SEs в его липидных частицах. Такой организм является особо полезным для разработки организмов, в липидные частицы которых могут быть направлены конкретно целевые липиды. Например, возможно ввести в такой организм молекулы нуклеиновой кислоты, позволяя синтез другого типа липида, который затем накапливается в липидных частицах. Кроме этого, могут быть обеспечены организмы, позволяющие синтез в основном чистых липидов в липидных частицах.

В преимущественном варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с четвертым аспектом данного изобретения модифицирован таким образом, что активность ацил-СоА: стерол ацилтрансферазы/стерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.26) диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20), лецитин холестеринацил трансферазы/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158) и ацил СоА-воск спирт ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.75) уменьшена по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа.

В пятом варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением представляет собой организм, который вырабатывает в клетке(ах) нейтральный липид, который накапливается в липидной частице и который является генно-модифицированным таким образом, что более не синтезирует триацилглицерин (TAG) и поэтому более не содержит указанный триацилглицерин, встречающийся в природе в его липидных частицах в указанных частицах. Как описано выше, в общем синтез TAGs происходит, например в дрожжах, при помощи ферментной активности диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20) и лецитин холестеринацил трансферазы/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158). Таким образом, в преимущественном варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с пятым аспектом данного изобретения является генно-модифицированным таким образом, что активность диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20) и лецитин холестерин ацилтрансферазы/фосфолипид:диацилглицерин ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158) уменьшена по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа.

В преимущественном варианте исполнения пятого аспекта данного изобретения организм получен из организма, который природно не вырабатывает и хранит восковые эфиры в его липидных частицах. Такие организмы были описаны выше. Преимущественно организм является грибковым организмом, как описано выше, более преимущественно рода Saccharomyces и наиболее преимущественно вида Saccharomyces cerevisiae.

В шестом варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с данным изобретением представляет собой организм, который вырабатывает а клетке(ах) нейтральный липид, который накапливается в липидной частице и который является генно-модифицированным, так что более и поэтому более не содержит триацилглицерины и восковые эфиры, которые природно встречаются в его липидных частицах в указанных частицах. В преимущественном варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с шестым аспектом данного изобретения является генно-модифицированным таким образом, что активность диацилглицерол ацилтрансферазы/диацилглицерол O-ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.20), лецитин холестеринацил трансферазы/фосфолипид: диацилглицерол ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.158) и ацил СоА-воск спиртовой ацилтрансферазы (ЕС 2.3.1.75) уменьшена по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом, преимущественно соответствующим организмом дикого типа.

В преимущественном варианте исполнения изобретения организм в соответствии с пятым или шестым аспектом данного изобретения, т.е. организм, который более не синтезирует триацилглицерин или который более не синтезирует триацилглицерин и восковый эфир, способен к накоплению в его липидных частицах ацильного эфира стерольного липида. Накопление ацильного эфира стерольного липида в липидных частицах может быть вызвано тем фактом, что организм природно синтезирует такие эфиры или это может быть вызвано тем фактом, что гены, кодирующие соответствующие ферменты, приводящие к биосинтезу ацильных эфиров стерольных липидов, были введены в клетки.

Стерольные липиды, такие, как холестерин и его производные, являются важными компонентами мембранных липидов, наряду с глицерофосфолипидами и сфингомиелинами. Стероиды, которые также включают такую же гибридизованную четырехчленную циклическую структуру, имеют различные биологические роли в качестве гормонов и сигнальных молекул. С18 стероиды включают семейство эстрогенов, в то время как С19 стероиды включают андрогены, например, тестостерон и андростерон. С21 подкласс включает прогестогены, а также глюкокортикоиды и минералокортикоиды. Секостероиды, включающие различные формы витамина D, характеризуются расщеплением В цикла основной структуры. Другие примеры стеролов представляют собой желчные кислоты и их конъюгаты, которые у млекопитающих являются окисленными производными холестерина и синтезируются в печени.

В преимущественном варианте исполнения изобретения стерольный липид является стеролом или стероидом. Стероидом является терпеноидный липид, характеризующийся углеродным скелетом с четырьмя гибридизованными циклами, в общем расположенными 6-6-6-5 образом. Стероиды различаются по функциональным группам, присоединенным к таким циклам и степени окисления циклов. Сотни различимых стероидов найдены в растениях, животных и грибах. Все стероиды получены в клетках из стерол ланостерина (животного или грибкового) или стерол циклоартенола (растения). Оба стерола получают циклизацией тритерпенового сквалена. Стероиды включают эстроген, прогестерон и тестостерон.

Стеролы (или стероидные спирты) являются подгруппой стероидов с гидроксильной группой в 3-положении А-цикла. Они являются амфифильными липидами, синтезируемыми из ацетил-коэнзима А. Общая молекула является достаточно плоской. Гидроксильная группа на А цикле является полярной. Остаток алифатической цепи является неполярным. Стеролы растений называют фитостеролы и стеролы животных называют зоостеролы. Наиболее важными зоостеролами являются холестерин и некоторые стероидные гормоны; наиболее важными фитостеролами являются кампестерол, ситостерол и стигмастерол. Стеролы играют существенную роль в физиологии эукариотных организмов. Например, холестерин образует часть клеточной мембраны, где его присутствие влияет на текучесть клеточной мембраны и служит вторичным мессенджером в развитии сигналов. Растительные стеролы также известны как блокирующие сайты поглощения холестерина в кишечнике человека, таким образом способствуя уменьшению холестерина у людей. У людей, стеролы действуют как обеспечивающие важные сигналы и метаболические связи, например, циркадные ритмы, свертывание крови.

В преимущественном варианте исполнения изобретения стерол является холестерином, производным холестерина, 7-дегидро-холестерином, ланостерином, производным ланостерина, зимостерином, производным зимостерина, латостерином, производным латостерина, кукурбитацином, производным кукурбитацина, эпистеролом, производным эпистерола, теастероном, производным теастерона, кастастероном, производным кастастерона, тифастеролом, производным тифастерола, катастероном, производным катастерона, циклоейкаленолом, производным циклоейкаленола, ситостеролом, производным ситостерола, изофукостеролом, производным изофукостерола, фукостеролом, производным фукостерола, горгостеролом, производным горгостерола, эргостеролом, производным эргостерола, стигмастеролом или производным стигмастерола.

В частности, в организме, если накапливается ацетиловый эфир 7-дегидро-холестерина, активность HMG-CoA-редуктазы (ЕС 1.1.1.34), и/или Δ24-редуктазы, и/или ланостерин СН-деметилаза/цитохрома Р450 51 (ЕС 1.14.13.70), и/или сквален-эпоксидазы/ сквален-монооксигеназы (ЕС 1.14.99.7) может возрасти по сравнению с соответствующим организмом дикого типа. Дополнительно, активность SAM:C-24 стерол метил трансферазы, и/или С-22 стерол десатуразы и/или С-5 стерол десатуразы может быть уменьшена или устранена по сравнению с соответствующим организмом дикого типа. В организме, в котором накапливается ациловый эфир эргостерола, активность HMG-CoA-редуктазы (ЕС 1.1.1.34), и/или ланостерин СН-деметилаза/цитохрома Р450 51 (ЕС 1.14.13.70) и/или сквален-эпоксидазы/сквален-монооксигеназы (ЕС 1.14.99.7), может быть увеличена по сравнению с соответствующим организмом дикого типа. В организме, котором накапливается ациловый эфир эпистерола, активность HMG-CoA-редуктазы (ЕС 1.1.1.34), и/или ланостерин С14-деметилаза/цитохром Р450 51 (ЕС 1.14.13.70), и/или сквален-эпоксидазы/сквален-монооксигеназы (ЕС 1.14.99.7) может быть увеличена по сравнению с соответствующим организмом дикого типа и/или Δ22-десатуразу/цитохром Р450 61 (ЕС 1.14.14.1) активность может быть уменьшена по сравнению с соответствующим организмом дикого типа.

В другом преимущественном варианте исполнения изобретения стероид является андростероном, производным андростерона, тестостероном, производным тестостерона, андростендиолом, производным андростендиола, андростендионом, производным андростендиона, калустероном, производным калустерона, метандриолом, производным метандриола, боластероном, производным боластерона, эпиандростероном, производным эпиандростерона, местанолоном, производным местанолона, станолоном, производным станолона, стенболоном, производным стенболона, эпитестостероном, производным эпитестостерона, тестостероном, производным тестостерона, кортизолом, производным кортизола, альдостероном, производным альдостерона, прегненолоном, производным прегненолона, кортизоном, производным кортизона, кортикостероном, производным кортикостерона, норетиндропом, производным норетиндрона, урокортизолом или производным урокортизола.

В преимущественном варианте исполнения изобретения пятого и шестого аспекта данного изобретения организм, который способен к накоплению ацилового эфира стерольного липида, представляет собой организм, который природно обладает маршрутом биосинтеза, приводящим к синтезу соответствующего стерольного липида и в котором, более преимущественно, ферментная активность соответствующего маршрута увеличена по сравнению с соответствующим немодифицированным организмом для получения большего накопления соответствующего стерольного липида.

В преимущественном варианте исполнения изобретения, организм в соответствии с аспектами 1-6 данного изобретения способен к накоплению в его липидной частице пренольного липида. Пренольные липиды синтезируются из 5-углеродных предшественников изопентил дифосфата и диметилаллил дифосфата, которые вырабатываются главным образом через маршрут мевалоновой кислоты (MVA). Пренольные липиды охватывают изопреноиды, хиноны и гидрохиноны, полипренолы, гопаноиды и некоторые другие незначительные типы. Простые изопреноиды (линейные спирты, дифосфаты, и т.д.) образуются путем последовательного добавления звеньев С5 и классифицируются в соответствии с количеством таких терпеновых звеньев. Структуры, содержащие более 40 атомов углерода, известны как политерпены. Каротиноиды являются важными простыми изопреноидами, функционирующими как антиоксиданты и как предшественники витамина А. Другой биологически важный класс молекул представлен хинонами и гидрохинонами, содержащими изопрецоидный хвост, присоединенный к хиноновому каркасу неизопреноидного происхождения. Витамин Е и витамин K, а также убихиноны, являются примерами данного класса. Бактерии синтезируют полипренолы под названием бактопренолы), в которых концевое изопреноидное звено присоединено к кислород