Ингибиторы ezh2 человека и способы их применения

Ингибиторы ezh2 человека и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственная ссылка

По данной заявке испрашивается приоритет и преимущество согласно U.S.S.N 61/381684, поданной 10 сентября 2010 года, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к ингибированию форм дикого типа и определенных мутантных форм метилтрансферазы гистонов EZH2 человека - каталитической субъединицы комплекса PRC2, которая катализирует от моно- до триметилирования лизина 27 на гистоне H3 (H3-K27), к способам лечения различных типов рака, включающих фолликулярную лимфому и диффузную крупно-B-клеточную лимфому (DLBCL), и к способам определения способности к ответу на ингибитор EZH2 у индивидуума.

Уровень техники

В эукариотических клетках ДНК упакована с помощью гистонов, образуя хроматин. Приблизительно 150 пар оснований ДНК дважды обернуты вокруг октамера гистонов (по два каждого из гистонов 2A, 2B, 3 и 4), образуя нуклеосому - основной элемент хроматина. Изменения упорядоченной структуры хроматина могут приводить к изменениям транскрипции ассоциированных с ней генов. Этот процесс в высокой степени контролируется, поскольку изменения профилей экспрессии генов могут существенно влиять на фундаментальные клеточные процессы, такие как дифференцировка, пролиферация и апоптоз. Контроль изменений структуры хроматина (и, таким образом, транскрипции) опосредуется ковалентными модификациями гистонов, прежде всего, их N-концов. Эти модификации часто называют эпигенетическими, поскольку они могут приводить к наследственным изменениям экспрессии генов, но они не влияют на саму последовательность ДНК. Ковалентные модификации (например, метилирование, ацетилирование, фосфорилирование и убиквитинилирование) боковых цепей аминокислот опосредуются ферментативно.

Селективное присоединение метильных групп к конкретным аминокислотным участкам на гистонах контролируется действием уникального семейства ферментов, известных как метилтрансферазы гистонов (HMT). На уровень экспрессии конкретного гена влияет присутствие или отсутствие одной или нескольких метильных групп в соответствующем участке гистона. Конкретный эффект метильной группы в конкретном участке сохраняется до тех пор, пока метильная группа не удалится деметилазой гистонов, или до тех пор, пока модифицированный гистон не будет заменен путем обновления нуклеосомы. Подобным образом, другие классы ферментов могут присоединять к ДНК и гистонам другие химические группы, и другие ферменты могут удалять эти группы для обеспечения контроля экспрессии генов.

Организованный набор биохимических систем, обуславливающих регуляцию транскрипции, должен строго контролироваться для оптимального протекания роста и дифференцировки клеток. Когда этот контроль нарушается вследствие нарушения экспрессии и/или активности ферментов, ответственных за модификацию ДНК и гистонов, возникают болезненные состояния. Например, существуют накапливающиеся данные, позволяющие предположить, что при раке человека нарушенная регуляция активности эпигенетических ферментов приводит к неконтролируемой пролиферации клеток, ассоциированной с раком, а также к другим связанным с раком фенотипам, таким как усиленная миграция и инвазия клеток. Помимо рака, существуют накапливающиеся данные о роли эпигенетических ферментов в ряде других заболеваний человека, включая метаболические заболевания (такие как диабет), воспалительные заболевания (такие как болезнь Крона), нейродегенеративные заболевания (такие как болезнь Альцгеймера) и сердечно-сосудистые заболевания. Таким образом, селективное модулирование аберрантного действия эпигенетических ферментов имеет значительную перспективу для лечения ряда заболеваний.

Метилтрансфераза гистонов EZH2

Известно, что белки группы Polycomb (PcG) и группы trithorax (trxG) являются частью системы клеточной памяти. Francis et al. (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2:409-21; Simon et al. (2002) Curr Opin Genet Dev 12:210-8. Обе группы белков вовлечены в поддержание пространственного характера экспрессии генов гомеотического бокса (Hox), который формируются рано в ходе эмбрионального развития с помощью временно экспрессируемых генов сегментации. Как правило, белки PcG представляют собой репрессоры транскрипции, которые поддерживают "выключенное состояние", и белки trxG представляют собой активаторы транскрипции, которые поддерживают "включенное состояние". Поскольку представители белков PcG и trxG обладают собственной активностью метилтрансферазы гистонов (HMTase), белки PcG и trxG могут участвовать в клеточной памяти путем метилирования коровых гистонов. Beisel et al. (2002) Nature 419:857-62; Cao et al. (2002) Science 298: 1039-43; Czermin et al. (2002) Cell 111: 185-96; Kuzmichev et al. (2002) Genes Dev 16:2893-905; Milne et al. (2002) Mol Cell 10: 1107-17; Muller et al. (2002) Cell 111: 197-208; Nakamura et al. (2002) Mol Cell 10: 1119-28.

Биохимические и генетические исследования обеспечили доказательства того, что белки PcG Drosophila функционируют, по меньшей мере, в двух различных белковых комплексах: репрессивный комплекс Polycomb 1 (PRC1) и комплекс ESC-E(Z) (также известный как репрессивный комплекс Polycomb 2 (PRC2)), хотя составы комплексов могут быть динамическими. Otte et al. (2003) Curr Opin Genet Dev 13: 448-54. Studies in Drosophila (Czermin et al. (выше); Muller et al. (выше)) и в клетках млекопитающих (Cao et al. (выше); Kuzmichev et al. (выше)) было показано, что комплексы ESC-E(Z)/EED-EZH2 (т.е. PRC2) обладают собственной активностью метилтрансферазы гистонов. Хотя составы комплексов, выделенных различными группами, немного отличаются, они, главным образом, содержат EED, EZH2, SUZ12 и RbAp48 или их гомологи из Drosophila. Однако воссозданный комплекс, содержащий только EED, EZH2 и SUZ12, сохраняет активность метилтрансферазы гистона в отношении лизина 27 гистона H3. Патент США 7563589 (включен посредством ссылки).

Среди различных белков, составляющих комплексы PRC2, EZH2 (энхансер гомолога 2 Zeste) представляет собой каталитическую субъединицу. Каталитический центр EZH2, в свою очередь, находится в домене SET - мотиве с высоко консервативной последовательностью (назван после Su(var)3-9, энхансер Zeste, Trithorax), которая выявлена в нескольких ассоциированных с хроматином белках, включая представителей как группы Trithorax, так и группы Polycomb. Домен SET характерен для всех известных лизиновых метилтрансфераз гистонов, за исключением метилтрансферазы H3-K79 DOT1.

В дополнение к подавлению гена Hox, было показано, что опосредуемое PRC2 метилирование H3-K27 гистонов участвует в X-инактивации. Plath et al. (2003) Science 300: 131-5; Silva et al. (2003) Dev Cell 4: 481-95. Привлечение комплекса PRC2 в Xi и последующее триметилирование H3-K27 гистонов происходит на стадии инициации X-инактивации и зависит от РНК Xist. Более того, было выявлено, что EZH2 и ассоциированная с ней активность метилтрансферазы H3-K27 гистонов по-разному маркирует плюрипотентные эпибластные клетки и дифференцированную трофэктодерму. Erhardt et al. (2003) Development 130: 4235-48).

В соответствии с ролью EZH2 в поддержании профилей эпигенетической модификации плюрипотентных эпибластных клеток, опосредуемая Cre делеция EZH2 приводит к утрате метилирования H3-K27 гистонов в клетках. Erhardt et al. (выше). Кроме того, исследование в клеточных линиях и тканях рака предстательной железы и рака молочной железы выявило строгую корреляцию между уровнями EZH2 и SUZ12 и инвазивностью этих типов рака (Bracken et al. (2003) EMBO J 22: 5323-35; Kirmizis et al. (2003) Mol Cancer Ther 2: 113-21; Kleer et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 11606-11; Varambally et al. (2002) Nature 419: 624-9), что указывает на то, что дисфункция комплекса PRC2 может приводить к раку.

Недавно было описано, что соматические мутации тирозина 641 (Y641F, Y641N, Y641S и Y641H) EZH2 ассоциированы с фолликулярной лимфомой (FL) и диффузной крупно-B-клеточной лимфомой (DLBCL) подтипа лимфомы B-клеток герминального центра (GCB). Morin et al. (2010) Nat Genet 42: 181-5. Во всех случаях было выявлено, что встречаемость мутантного гена EZH2 является гетерозиготной, и в мутантных образцах, в которых профиль определяли секвенированием транскриптома, была выявлена экспрессия как аллелей дикого типа, так и мутантных аллелей. Также было продемонстрировано, что все мутантные формы EZH2 могли быть включены в мультибелковый комплекс PRC2, но что полученные комплексы были лишены способности катализировать метилирование эквивалентного H3-K27 остатка пептидного субстрата. Таким образом, было сделано заключение, что ассоциированные с заболеванием изменения Tyr641 в EZH2 приводили к утрате функции в отношении катализируемого EZH2 метилирования H3-K27.

Сущность изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к модулированию активности метилтрансферазы гистонов EZH2 дикого типа и мутантной метилтрансферазы гистонов EZH2, являющейся субъединицей комплекса PRC2, который катализирует от моно- до триметилирования лизина 27 в гистоне H3 (H3-K27). Например, настоящее изобретение относится к ингибированию активности определенных мутантных форм EZH2. Мутантные формы EZH2 включают замену тирозина 641 (Y641, также Tyr641) EZH2 дикого типа другим аминокислотным остатком.

Другой аспект настоящего изобретения относится к определению способности пациента отвечать на ингибитор EZH2, в зависимости от уровня диметилированного H3-K27me2 или предпочтительно в зависимости от уровней диметилированного H3-K27me2 и триметилированного H3-K27me3. Например, клетки с низким или не поддающимся выявлению уровнем диметилированного H3-K27me2 или клетки с низким соотношением H3-K27me2/me3 в значительно большей степени отвечают на антипролиферативный эффект ингибитора EZH2, чем клетки с более типичным более высоким соотношением 3-K27me2/me3.

Один аспект изобретения представляет собой способ ингибирования у индивидуума преобразования H3-K27 в триметилированный H3-K27. Способ включает стадию введения индивидууму, у которого экспрессируется мутант EZH2 по Y641, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, где ингибитор ингибирует активность метилтрансферазы гистонов EZH2, тем самым ингибируя преобразование H3-K27 в триметилированный H3-K27 у индивидуума.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления ингибитор ингибирует активность метилтрансферазы гистонов мутанта EZH2 по Y641.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления ингибитор селективно ингибирует активность метилтрансферазы гистонов у мутанта EZH2 по Y641.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления мутант EZH2 по Y641 выбран из группы, состоящей из Y641F, Y641H, Y641N и Y641S.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления ингибитор EZH2 представляет собой S-аденозил-L-гомоцистеин или его фармацевтически приемлемую соль.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления ингибитор EZH2 представляет собой соединение 75:

(75)

или его фармацевтически приемлемую соль.

Один аспект изобретения представляет собой способ ингибирования у индивидуума преобразования H3-K27 в триметилированный H3-K27. Способ включает стадии проведения анализа для выявления мутанта EZH2 по Y641 в образце от индивидуума; и введение индивидууму, у которого экспрессируется мутант EZH2 по Y641, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, где ингибитор ингибирует активность метилтрансферазы гистонов у EZH2, тем самым ингибируя преобразование H3-K27 в триметилированный H3-K27 у индивидуума.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления проведение анализа для выявления мутанта EZH2 по Y641 включает полногеномное ресеквенирование или ресеквенирование области-мишени, которое выявляет нуклеиновую кислоту, кодирующую мутант EZH2 по Y641.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления проведение анализа для выявления мутанта EZH2 по Y641 включает приведение в контакт образца с антителом, которое специфично связывается с полипептидом или его фрагментом, характерным для мутанта EZH2 по Y641.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления проведение анализа для выявления мутанта EZH2 по Y641 включает приведение в контакт образца в условиях высокой жесткости с зондом нуклеиновой кислоты, который гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент, характерный для мутанта EZH2 по Y641.

Один аспект изобретения представляет собой способ ингибирования преобразования H3-K27 в триметилированный H3-K27. Способ включает стадию приведения в контакт мутанта EZH2 по Y641 с гистонным субстратом, включающим H3-K27, и эффективным количеством ингибитора EZH2, где ингибитор ингибирует активность метилтрансферазы гистонов у EZH2, тем самым ингибируя преобразование H3-K27 в триметилированный H3-K27.

Один аспект изобретения представляет собой способ идентификации индивидуума в качестве кандидата для лечения ингибитором EZH2. Способ включает стадии проведения анализа для выявления мутанта EZH2 по Y641 в образце от индивидуума; и идентификации индивидуума, у которого экспрессируется мутант EZH2 по Y641, в качестве кандидата для лечения ингибитором EZH2, где ингибитор ингибирует активность метилтрансферазы гистонов у EZH2.

Один аспект изобретения представляет собой способ идентификации ингибитора мутанта EZH2 по Y641. Способ включает стадии комбинирования выделенного мутанта EZH2 по Y641 с гистонным субстратом, донором метильной группы и тестируемым соединением, где гистонный субстрат включает форму H3-K27, выбранную из группы, состоящей из неметилированного H3-K27, монометилированного H3-K27, диметилированного H3-K27 и любой их комбинации; и проведение анализа для выявления метилирования H3-K27 в гистонном субстрате, тем самым, идентифицируя тестируемое соединение в качестве ингибитора мутанта EZH2 по Y641, когда метилирование H3-K27 в присутствии тестируемого соединения меньше, чем метилирование H3-K27 в отсутствие тестируемого соединения.

В одном варианте осуществления проведение анализа для выявления метилирования H3-K27 в гистонном субстрате включает измерение включения меченных метильных групп.

В одном варианте осуществления меченые метильные группы представляют собой изотопно меченные метильные группы.

В одном варианте осуществления проведение анализа для выявления метилирования H3-K27 в гистонном субстрате включает приведение в контакт гистонного субстрата с антителом, которое специфично связывается с триметилированным H3-K27.

Один аспект изобретения представляет собой способ идентификации ингибитора мутанта EZH2 по Y641. Способ включает стадии комбинирования выделенного мутанта EZH2 по Y641 с гистонным субстратом, донором метильной группы и тестируемым соединением, где гистонный субстрат содержит форму H3-K27, выбранную из группы, состоящей из неметилированного H3-K27, монометилированного H3-K27, диметилированного H3-K27 и любой их комбинации; и проведение анализа для выявления образования триметилированного H3-K27 в гистонном субстрате, тем самым, идентифицируя тестируемое соединение в качестве ингибитора мутанта EZH2 по Y641, когда образование триметилированного H3-K27 в присутствии тестируемого соединения является меньшим, чем образование триметилированного H3-K27 в отсутствие тестируемого соединения.

В одном варианте осуществления проведение анализа для выявления образования триметилированного H3-K27 в гистонном субстрате включает измерение включения меченых метильных групп.

В одном варианте осуществления меченые метильные группы представляют собой изотопно меченные метильные группы.

В одном варианте осуществления проведение анализа для выявления образования триметилированного H3-K27 в гистонном субстрате включает приведение в контакт гистонного субстрата с антителом, которое специфично связывается с триметилированным H3-K27.

Один аспект изобретения представляет собой способ идентификации селективного ингибитора мутанта EZH2 по Y641. Способ включает стадии комбинирования выделенного мутанта EZH2 по Y641 с гистонным субстратом, донором метильной группы и тестируемым соединением, где гистонный субстрат включает форму H3-K27, выбранную из группы, состоящей из монометилированного H3-K27, диметилированного H3-K27 и комбинации монометилированного H3-K27 и диметилированного H3-K27, тем самым формируя тестируемую смесь; комбинирования выделенной EZH2 дикого типа с гистонным субстратом, донором метильной группы и тестируемым соединением, где гистонный субстрат содержит форму H3-K27, выбранную из группы, состоящей из монометилированного H3-K27, диметилированного H3-K27 и комбинации монометилированного H3-K27 и диметилированного H3-K27, тем самым формируя контрольную смесь; проведения анализа для выявления триметилирования гистонного субстрата в каждой из тестируемой смеси и контрольной смеси; вычисления соотношения (a) триметилирования с мутантом EZH2 по Y641 и тестируемым соединением (M+) и (b) триметилирования с мутантом EZH2 по Y641 без тестируемого соединения (M-); вычисления соотношения (c) триметилирования с EZH2 дикого типа и тестируемым соединением (WT+) и (d) триметилирования с EZH2 дикого типа без тестируемого соединения (WT-); сравнения соотношения (a)/(b) с соотношением (c)/(d); и идентификации тестируемого соединения в качестве селективного ингибитора мутанта EZH2 по Y641, когда соотношение (a)/(b) меньше, чем соотношение (c)/(d).

Один аспект изобретения представляет собой способ лечения рака. Способ включает стадию введения индивидууму, имеющему рак, экспрессирующий мутант EZH2 по Y641, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, где ингибитор ингибирует активность метилтрансферазы гистонов EZH2, тем самым осуществляя лечение рака.

В этом и других аспектах изобретения в одном варианте осуществления рак выбран из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы и диффузной крупно-B-клеточной лимфомы (DLBCL) подтипа лимфомы B-клеток герминального центра (GCB).

Один аспект изобретения представляет собой способ лечения рака. Способ включает стадию введения индивидууму, имеющему рак, экспрессирующий мутант EZH2 по Y641, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, где ингибитор селективно ингибирует активность метилтрансферазы гистонов мутанта EZH2 по Y641, тем самым, осуществляя лечение рака.

Один аспект изобретения представляет собой способ лечения рака. Способ включает стадии проведения анализа для выявления мутанта EZH2 по Y641 в образце, содержащем раковые клетки от индивидуума, имеющего рак; и введения индивидууму, у которого экспрессируется мутант EZH2 по Y641, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, где ингибитор ингибирует активность метилтрансферазы гистонов EZH2, тем самым, осуществляя лечение рака.

Другой аспект изобретения представляет собой способ определения способности индивидуума отвечать на ингибитор EZH2. В одном варианте осуществления способ включает выделение образца ткани от индивидуума; выявление уровня диметилирования (me2) H3-K27 в образце ткани; сравнение уровня диметилирования (me2) с контрольным уровнем диметилирования (me2); и идентификацию индивидуума как отвечающего на указанный ингибитор EZH2, когда уровень диметилирования (me2) отсутствует или ниже, чем контрольный уровень диметилирования (me2). В одном варианте осуществления способ дополнительно включает выявление уровня триметилирования (me3) H3-K27 в образце ткани; сравнение уровня триметилирования (me3) с контрольным уровнем триметилирования (me3) и уровня диметилирования (me2) с контрольным уровнем диметилирования (me2); и идентификацию указанного индивидуума как отвечающего на ингибитор EZH2, когда уровень триметилирования (me3) является таким же или превышает контрольный уровень триметилирования (me3), и уровень диметилирования (me2) отсутствует или ниже, чем контрольный уровень диметилирования (me2). В другом варианте осуществления способ дополнительно включает получение соотношения уровня диметилирования (me2) и уровня триметилирования (me3) H3-K27 в образце ткани; получение контрольного соотношения контрольного уровня диметилирования (me2) и контрольного уровня триметилирования (me3); сравнение соотношения с контрольным соотношением; и идентификацию индивидуума как отвечающего на указанный ингибитор EZH2, когда указанное соотношение является меньшим, чем указанное контрольное соотношение. В предпочтительном варианте осуществления индивидуум имеет рак. В одном варианте осуществления рак представляет собой фолликулярную лимфому. Альтернативно, рак представляет собой крупно-B-клеточную лимфому (DLBCL). В другом предпочтительном варианте осуществления у индивидуума экспрессируется мутант EZH2 по Y641. В предпочтительном варианте осуществления мутант по Y641 представляет собой Y641F, Y641H, Y641N или Y641S.

Один аспект изобретения представляет собой способ выбора лечения для индивидуума, имеющего рак. Способ включает определение способности индивидуума отвечать на ингибитор EZH2 по уровню диметилированного H3-K27 или предпочтительно по уровням диметилированного H3-K27 и триметилированного H3-K27; и предоставление ингибитора EZH2 индивидууму, когда индивидуум способен отвечать на ингибитор EZH2. В одном варианте осуществления рак представляет собой фолликулярную лимфому. Альтернативно, рак представляет собой диффузную крупно-B-клеточную лимфому (DLBCL). В другом предпочтительном варианте осуществления у индивидуума экспрессируется мутант EZH2 по Y641. В предпочтительном варианте осуществления мутант по Y641 представляет собой Y641F, Y641H, Y641N или Y641S.

Один аспект изобретения представляет собой соединение 75:

(75)

или его фармацевтически приемлемую соль.

Один аспект изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую соединение 75:

(75)

или его фармацевтически приемлемую соль.

Один аспект изобретения представляет собой применение соединения 75:

(75)

или его фармацевтически приемлемой соли при лечении фолликулярной лимфомы.

Один аспект изобретения представляет собой применение соединения 75:

(75)

или его фармацевтически приемлемой соли при лечении диффузной крупно-B-клеточной лимфомы (DLBCL).

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. В описании форма единственного числа также включает множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Хотя на практике и для исследования настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, сходные или эквивалентные способам или материалам, описанным в настоящем описании, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, приведенные в настоящем описании, включены посредством ссылок. Ссылки, цитированные в настоящем описании, не признаются как уровень техники заявленного изобретения. В случае противоречий следует руководствоваться настоящим описанием, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными, но не ограничивающими.

Другие признаки и преимущества изобретения будут понятны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлены два графика, на которых показано, что ассоциированные с B-клеточной лимфомой мутанты EZH2 являются активными метилтрансферазами гистонов. Активность метилтрансферазы in vitro в комплексах PRC2, содержащих EZH2 дикого типа и различные мутанты EZH2 по Y641, измеряли в виде (A) реакций переноса метильной группы с использованием пептида (H3 21-44) в качестве субстрата, и (B) реакций переноса метильной группы с использованием нуклеосом птиц в качестве субстрата. Обозначения: дикий тип (●), Y641F (o), Y641H (□), Y641N (■) и Y641S (▲). CPM представляет собой количество импульсов в минуту применительно к сцинтилляционному измерению радиационного излучения ³H.

На фиг.2 представлены четыре графика, на которых показано, что комплексы PRC2, содержащие мутант EZH2, предпочтительно катализируют ди- и триметилирование H3-K27 гистонов. (A) Активность метилтрансферазы мутантных комплексов и комплексов дикого типа (WT) в отношении неметилированного пептида (незакрашенные столбики), монометилированного пептида (мозаичные столбики) и диметилированного пептида (закрашенные столбики). (B) Аффинность к пептидным субстратам, исходя из K_1/2, является сходной при всех состояниях метилирования пептида у комплексов PRC2, содержащих EZH2 дикого типа (o), Y641F (●), Y641H (□), Y641N (■) и Y641S (▲) EZH2. Следует отметить, что варьирование величин K_1/2 среди всех субстратов и всех форм фермента является менее чем 3,5-катным. Для любого конкретного состояния метилирования субстрата варьирование величины K_1/2 является менее чем 2-кратным. (C) Число оборотов фермента (k_cat) варьирует, в зависимости от состояния метилирования, противоположным образом для WT EZH2 и мутантов EZH2 по Y641. k_cat снижается при увеличении состояния метилирования K27 для EZH2 дикого типа (o), но увеличивается для мутантов Y641F (●), Y641H (□), Y641N (■) и Y641S (▲) EZH2. (D) Каталитическая эффективность (k_cat/K_1/2) снижается при увеличении состояния метилирования K27 для EZH2 дикого типа (o), но возрастает для мутантов Y641F (●), Y641H (□), Y641N (■) и Y641S (▲) EZH2. На панелях B-D линии, соединяющие точки данных, не предполагают какой-либо математической взаимосвязи; вместо этого, они предназначены только в качестве наглядного средства.

На фиг.3A также представлены три графика, на которых показаны предсказанные относительные уровни H3-K27me3 (верхняя панель), H3-K27me2 (средняя панель) и H3-K27me1 (нижняя панель) для клеток, содержащих различные мутанты EZH2. Моделирование проводили с использованием уравнения скорости реакции сопряженных ферментативных реакций в состоянии равновесия и стационарных параметров кинетики, представленных в таблице 1. Все величины представлены относительно гомозиготных содержащих WT EZH2 клеток и предполагают насыщающие концентрации внутриклеточного SAM относительно Km и внутриклеточные концентрации нуклеосом, сходные с Km.

На фиг.3B представлена серия анализов с использованием вестерн-блоттинга относительных профилей состояния метилирования H3-K27 для клеточных линий лимфомы, гомозиготных по WT EZH2 или гетерозиготных по указанной мутации Y641 EZH2. На панелях сверху вниз представлены результаты исследования с помощью антител, специфичных к следующему: общей EZH2; H3-K27me3; H3-K27me2; H3-K27me1; и общему гистону H3 в качестве нагрузочного контроля.

На фиг.4 представлены выбранные предложенные механизмы, ведущие к нарушенным высоким уровням триметилирования H3-K27 гистонов при раке. Они включают: a) мутацию Y641 в EZH2, приводящую к изменению предпочтения субстрата из неметилированного на моно- и диметилированный гистон H3-K27; b) сверхэкспрессию EZH2; c) мутации в UTX, которые инактивируют функцию фермента, вызывая снижение деметилирования H3-K27me3; и d) сверхэкспрессию субъединицы PHF19/PCL3 комплекса PRC2, которая приводит к увеличению привлечения комплекса PRC2 к конкретным генам и увеличению триметилирования H3-K27 гистонов. Во всех четырех моделях изменение приводит к нарушенному триметилированию H3-K27 гистонов в проксимальных промоторных областях гена, что приводит к подавлению транскрипции ключевых генов при раке.

На фиг.5 представлена SDS-PAGE на геле, показывающая, что уровни экспрессии каждого из пятикомпонентных комплексов PRC2 сходны в случае мутантной EZH2 и EZH2 дикого типа.

На фиг.6 представлена пара таблиц, на которых показано, что мутантный комплекс PRC2 и комплекс PRC2 дикого типа (WT) обладают строгим предпочтением в качестве субстрата H3-K27-содержащих пептидов. Каждый фермент исследовали против панели перекрывающихся 15-мерных пептидов, охватывающие все H3 и H4. Активность измеряли как скорость (CPM в минуту), и представленная величина представляет собой среднее значение для двух независимых определений в каждой реакции. Для всех комплексов, наиболее предпочтительным пептидом был H3:16-30. Комплекс WT имел более чем в 6 раз более высокую активность против этого пептида, чем любой из мутантных комплексов.

На фиг.7 представлен график, на котором показана эффективность S-аденозил-L-гомоцистеина (SAH) в отношении ингибирования WT EZH2 и мутантов EZH2 по Y641. На оси X представлен логарифм концентрации SAH; на оси Y показано процентное ингибирование.

На фиг.8 представлен график, на котором показана эффективность соединения 75 в отношении ингибирования EZH2 WT и мутантов EZH2 по Y641. На оси X показан логарифм концентрации соединения 75; на оси Y представлено процентное ингибирование.

На фиг.9 представлен анализ вестерн-блотов для относительных уровней H3-K27me1, me2 и me3 на панели клеточных линий, включая множество клеточных линий DLBCL, экспрессирующих WT EZH2 или мутант EZH2 по Y641. a) Гистоны выделяли из представленных клеточных линий, фракционировали с помощью SDS-PAGE на 4-20% геле, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и исследовали с помощью антител к гистону H3, H3-K27me1, me2 или me3. Уровни EZH2 определяли путем приготовления лизатов цельных клеток из представленных клеточных линий, обработки, как описано выше, и исследования с помощью антитела к EZH2; b) гистоны выделяли из представленных клеточных линий и обрабатывали, как описано выше, за исключением того, что уровни EZH2 не определяли.

На фиг.10 представлен иммуноцитохимический анализ уровней H3 и H3-K27me3 на панели клеточных линий WT и мутантных по Y641 клеточных линий лимфомы. Клеточные осадки указанных клеточных линий фиксировали и погружали в парафин. Подготавливали препараты и оценивали уровни H3 и H3-K27me3 с помощью иммуноцитохимии с использованием антител к гистону H3 или H3-K27me3.

На фиг.11 представлен иммуноцитохимический анализ уровней H3 и H3-K27me2 на панели клеточных линий WT и мутантных по Y641 клеточных линий лимфомы. Клеточные осадки указанных клеточных линий фиксировали и погружали в парафин. Подготавливали препараты и оценивали уровни H3 и H3-K27me2 с помощью иммуноцитохимии с использованием антител к гистону H3 или H3-K27me2.

На фиг.12 представлен график, на котором показано ингибирование общих уровней H3-K27me3 путем обработки ингибитором EZH2 в мутантных по Y641 клетках WSU-DLCL2. Клетки WSU-DLCL2 обрабатывали в течение 4 суток указанными концентрациями ингибитора EZH2 A или B. После обработки соединением гистоны выделяли, фракционировали с помощью SDS-PAGE на 4-20% геле, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и исследовали с помощью антител к гистону H3 или H3-K27me3.

На фиг.13 представлен график, на котором показано, что ингибиторы EZH2 могут блокировать пролиферацию мутантных по Y641 клеток WSU-DLCL2, однако имеют небольшой эффект на не мутантные по Y641 клетки OCI-LY19. Клетки инкубировали в присутствии возрастающих концентраций ингибитора EZH2 A или B в течение одиннадцати суток. В качестве контроля включали клетки, обработанные носителем (ДМСО). Количество и жизнеспособность клеток определяли с использованием анализа Guava Viacount в устройстве Guava EasyCyte Plus. Клетки разделяли, и среду и соединение восполняли каждые 3-4 суток.

На фиг.14 представлен график, на котором показано, что присутствие мутации EZH2 (Y641) и/или высоких уровней H3-K27me3 и низких уровней H3-K27me2 предсказывает чувствительность к ингибиторам EZH2. Клеточные линии поддерживали в присутствии возрастающих концентраций одного ингибитора EZH2 вплоть до 25 мкМ. Для установления величин IC₉₀ использовали количества жизнеспособных клеток после обработки в течение 11 суток. Результаты нанесены на график, где клеточные линии сгруппированы в соответствии с состоянием по мутации EZH2 (A), или сгруппированы в соответствии с уровнями H3-K27me2 и H3-K27me3 (B). На обоих графиках линия указывает на средние величины IC₉₀ для указанной группы клеточных линий.

Подробное описание изобретения

Структура хроматина важна для регуляции генов и эпигенетического наследования. Посттрансляционные модификации гистонов вовлечены в установление и подержание структуры хроматина более высокого порядка; например, концевые части определенных коровых гистонов модифицированы ацетилированием, метилированием, фосфорилированием, риболизированием и/или убиквитинилированием.

EZH2 представляет собой метилтрансферазу гистонов, которая является каталитической субъединицей комплекса PRC2, который катализирует от моно- до триметилирования лизина 27 на гистоне H3 (H3-K27). Триметилирование H3-K27 гистонов представляет собой механизм подавления транскрипции определенных генов, которые расположены близко к участку модификации гистонов. Известно, что триметилирование является маркером рака, экспрессия которого изменяется при раке, таком как рак предстательной железы (см., например, публикацию патентной заявки США № 2003/0175736, включенную в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте). EZH2 относится к семейству белков группы Polycomb (PcG). Белки группы Polycomb помогают поддерживать характерные признаки клеток путем репрессии транскрипции генов-мишеней. Jacobs et al. (1999) Semin Cell Dev Biol 10(2): 227-35; Jacobs et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1602(2): 151-61. На микрочипах ДНК EZH2 был идентифицирован как активированный при гормон-резистентном метастазирующем раке предстательной железы. Dhanasekaran et al. (2001) Nature 412(6849): 822-6; Varambally et al. (2002) Nature 419(6907): 624-9. EZH2 активируется при агрессивных типах рака молочной железы и является медиатором проинвазивного фенотипа. Kleer et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(20): 11606-11. Сверхэкспрессия EZH2 в иммортализованных эпителиальных клеточных линиях молочной железы человека обеспечивает независимый от заякоривания рост и инвазию клеток. Kleer et al. (выше). Для опосредуемой EZH2 инвазии клеток требуется неизмененный домен SET и активность деацетилазы гистонов. Предшествующие испытания обеспечили доказательство функциональной связи между нарушенной регуляцией экспрессии EZH2, подавлением транскрипции и неопластической трансформацией. Varambally et al. (выше); Kleer et al (выше).

Один из аспектов настоящего изобретения относится к ингибированию активности EZH2, включая определенные мутантные формы EZH2. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к селективному ингибированию активности определенных мутантных форм EZH2.

Было описано, что точечные мутации в гене EZH2 в одном аминокислотном остатке (Tyr641, в настоящем описании обозначаемый, как Y641) EZH2 связаны с подгруппами B-клеточных лимфом человека. Morin et al. (2010) Nat Genet 42(2): 181-5. В частности, Morin et al. описали, что соматические мутации тирозина 641 (Y641F, Y641H, Y641N и Y641S) в EZH2 ассоциированы с фолликулярной лимфомой (FL) и диффузной крупно-B-клеточной лимфомой (DLBCL) подтипа лимфомы B-клеток герминального центра (GCB). Мутантный аллель всегда выявляют в ассоциации с аллелем дикого типа (гетерозиготный) в пораженных заболеванием клетках, и было описано, что мутации устраняют ферментативную активность комплекса PRC2 в отношении метилирования немодифицированного пептидного субстрата.

Недавно неожиданно было открыто, что фермент EZH2 дикого типа (WT) проявляет наиболее высокую каталитическую эффективность (kcat/K) для реакции от нуль- до монометилирования H3-K27 и меньшую эффективность для последующих (от моно- до ди- и от ди- до триметилирования) реакций; в то время как в противоположность этому, ассоциированные с заболеванием мутации Y641 проявляют в значительной степени ограниченную способность к проведению первой реакции метилирования, однако обладают увеличенной каталитической эффективностью в последующих реакциях относительно фермента дикого типа. Эти результаты подразумевают, что злокачественный фенотип заболевания использует комбинированную активность фермента, осуществляющего монометилирование H3-K27 (PRC2, содержащий WT EZH2 или EZH1) вместе с PRC2, содержащим мутантную EZH2 для усиленного преобразования H3-K27 в триметилированную форму (H3-K27me3).

Без связи с какой-либо теорией, полагают, что мутация Y641 на фенилаланин (F), гистидин (H), аспарагин (N) или серин (S) в EZH2 может облегчать множество раундов метилирования H3-K27 путем влияния на характер образования H-связей и/или пространственное скучивание в активном центре фермент-бисубстратного тройного комплекса, влияя на образование надлежащего водного канала для депротонирования реагирующего лизина. Zhang et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105: 5728-32. Это препятствование установлено по аналогии с результатами кристаллографического и молекулярного динамического моделирования, выявленного для мутации тирозина в родственных метилтрансферазах лизина белков LSMT, Dim-5 и SET7/9.

Например, когда тирозин 245 рекомбинантной SET7/9 подвергали мутации на аланин, наблюдали изменение субстратной специфичности. Dillon et al. (2005) Genome Biol 6: 227. Способность мутанта Y245A SET7/9 метилировать немодифицированный пептид из 20 остатков, соот