Лечение связанных с геном-супрессором опухолей заболеваний посредством ингибирования природного транскрипта в антисмысловой ориентации относительно этого гена

Лечение связанных с геном-супрессором опухолей заболеваний посредством ингибирования природного транскрипта в антисмысловой ориентации относительно этого гена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

2420-178004RU/010

ЛЕЧЕНИЕ СВЯЗАННЫХ С ГЕНОМ-СУПРЕССОРОМ ОПУХОЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОСРЕДСТВОМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО ТРАНСКРИПТА В

АНТИСМЫСЛОВОЙ ОРИЕНТАЦИИ ОТНОСИТЕЛЬНО ЭТОГО ГЕНА

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США с № 61/119973, поданной 4 декабря 2008, предварительной заявки на патент США с № 61/157249, поданной 4 марта 2009, предварительной заявки на патент США с № 61/166381, поданной 3 апреля 2009, и предварительной заявки на патент США с № 61/154594, поданной 23 февраля 2009, все из которых включены в настоящее изобретение в целом посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Варианты осуществления настоящего изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию генов-супрессоров опухолей и связанных молекул.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Гибридизация ДНК-РНК и РНК-РНК важна во многих аспектах функционирования нуклеиновых кислот, ключающих репликацию ДНК, транскрипцию и трансляцию. Гибридизация также является важнейшей в ряде технологий, с помощью которых либо выявляют конкретную нуклеиновую кислоту, либо изменяют ее экспрессию. Антисмысловые нуклеотиды, например, нарушают экспрессию гена посредством гибридизации с РНК-мишенью, внося, тем самым, помехи в сплайсинг РНК, транскрипцию, трансляцию и репликацию. Антисмысловая ДНК обладает дополнительным свойством, заключающимся в том, что гибриды ДНК-РНК служат в качестве субстрата для расщепления рибонуклеазой H, активность которой присутствует в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы можно доставить в клетки, так же, как и олигодезоксинуклеотиды (ODN), или они могут быть экспрессированы с эндогенных генов в виде молекул РНК. Недавно Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами разрешило антисмысловое лекарственное средство, VITRAVENE^TM (для лечения вызванного цитомегаловирусом ретинита), что служит отражением того, что антисмысловая молекула обладает терапевтической эффективностью.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Это краткое изложение обеспечивается для предоставления краткого изложения настоящего изобретения, чтобы кратко выразить природу и сущность настоящего изобретения. Оно предоставляется с оговоренным условием, что оно не будет использоваться для интерпретации или ограничения объема или значения формулы настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта посредством использования антисмыслового олигонуклеотида(ов), нацеленного на любой участок природного антисмыслового транскрипта, что приводит к увеличению экспрессии соответствующего смыслового гена. В настоящем изобретении также предусматривается, что ингибирования природного антисмыслового транскрипта можно достичь с помощью коротких интерферирующих РНК (киРНК), рибозимов и небольших молекул, которые, как считается, находятся в пределах объема настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере на 50% обратному комплементу полинуклеотида, включающего от 5 до 30 последовательных нуклеотидов в пределах нуклеотидов 1-1675 SEQ ID NO: 8, или нуклеотидов 1-518 SEQ ID NO: 9, или нуклеотидов 1-759 SEQ ID NO: 10, или нуклеотидов 1-25892 SEQ ID NO: 11, или нуклеотидов 1-279 SEQ ID NO: 12, или нуклеотидов 1-1982 SEQ ID NO: 13, или нуклеотидов 1-789 SEQ ID NO: 14, или нуклеотидов 1-467 SEQ ID NO: 15 (фиг. 5), посредством чего осуществляется модулирование функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В другом предпочтительном варианте осуществления мишенью олигонуклеотида является природная антисмысловая последовательность полинуклеотидов генов-супрессоров опухолей, например, нуклеотиды, представленные в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, или любые их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные им последовательности. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены как SEQ ID NO: 16-36 (фиг. 6-9).

В другом варианте осуществления обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-

супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере на 50% обратному комплементу антисмысловой последовательности полинуклеотида гена-супрессора опухолей; посредством чего осуществляется модулирование функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В другом варианте осуществления обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере на 50% антисмысловому олигонуклеотиду, который связывается с антисмысловым полинуклеотидом гена-супрессора опухолей; посредством чего осуществляется модулирование функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В предпочтительном варианте осуществления композиция включает один или несколько антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловым и/или антисмысловым полинуклеотидами гена-супрессора опухолей.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды включают один или несколько модифицированных или замещенных нуклеотидов.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды включают одну или несколько модифицированных связей.

В еще одном варианте осуществления модифицированные нуклеотиды включают модифицированные основания, включающие фосфоротиоат, метилфосфонат, пептидонуклеиновые кислоты, 2'-O-метил, фтор или углерод, метилен или другие молекулы замкнутых нуклеиновых кислот (LNA). Предпочтительно модифицированными нуклеотидами являются молекулы замкнутых нуклеиновых кислот, включая α-L-LNA.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды вводят в фармацевтической композиции. Схема лечения включает по меньшей мере однократное введение антисмысловых соединений пациенту; однако это лечение может быть изменено с включением многократных доз в течение периода времени. Лечение может быть скомбинировано с одним или несколькими другими типами терапий.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды включены в липосому или присоединены к молекуле носителя (например, холестерину, пептиду TAT).

В одном варианте осуществления обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, причем указанный по меньшей мере один олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере на 50% обратному комплементу природной антисмысловой последовательности полинуклеотида гена-супрессора опухолей; посредством чего осуществляется модулирование функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В другом варианте осуществления обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере на 50% антисмысловому олигонуклеотиду, который связывается с полинуклеотидом гена-супрессора опухолей; посредством чего осуществляется модулирование функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В другом варианте осуществления обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом, мишенью которого является участок природной антисмысловой последовательности полинуклеотида гена-супрессора опухолей, посредством чего осуществляется модулирование функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В варианте осуществления функции и/или экспрессии полинуклеотида гена-супрессора опухолей увеличивается in vivo или in vitro относительно контроля.

В другом варианте осуществления мишенью по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида является природная антисмысловая последовательность полинуклеотида гена-супрессора опухолей.

В варианте осуществления мишенью по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида является последовательность нуклеиновой кислоты, включающая кодирующие и/или не кодирующие нуклеотидные последовательности полинуклеотида гена-супрессора опухолей.

В варианте осуществления мишенью по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида являются перекрывающиеся и/или не перекрывающиеся последовательности полинуклеотида гена-супрессора опухолей.

В конкретном варианте осуществления по меньшей мере один антисмысловый олигонуклеотид включает одну или несколько модификаций, выбираемых из по меньшей мере одной модифицированной молекулы сахара, по меньшей мере одной модифицированной межнуклеозидной связи, по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида и их комбинаций.

В связанном варианте осуществления одна или несколько модификаций включают по меньшей мере одну модифицированную молекулу сахара, выбираемую из 2'-O-метоксиэтил-модифицированной молекулы сахара, 2'-метокси-модифицированной молекулы сахара, 2'-О-алкил-модифицированной молекулы сахара, модифицированной молекулы в виде бициклического сахара и их комбинаций.

В другом варианте осуществления одна или несколько модификаций включают по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, выбираемую из фосфоротиоата, 2'-О-метоксиэтила (МОЕ), 2'-фтора, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, триэфира фосфорной кислоты, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.

В варианте осуществления одна или несколько модификаций включают по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбираемый из пептидонуклеиновой кислоты (ПНК), замкнутой нуклеиновой кислоты (LNA), арабинонуклеиновой кислоты (FANA), их аналога, производного и комбинаций.

В другом варианте осуществления по меньшей мере один олигонуклеотид включает по меньшей мере одну из последовательностей олигонуклеотидов, представленных как SEQ ID NO: 16-36.

Настоящим изобретением также обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии гена-супрессора опухолей в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с по меньшей мере одним олигонуклеотидом короткой интерферирующей РНК (киРНК) длиной от 5 до 30 нуклеотидов, являющейся специфичной в отношении антисмыслового полинуклеотида гена-супрессора опухолей, причем указанный олигонуклеотид идентичен по

последовательности по меньшей мере на 50% комплементарной последовательности из по меньшей мере приблизительно пяти последовательных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой молекулы нуклеиновой кислоты полинуклеотида гена-супрессора опухолей; и модулирование функции и/или экспрессии гена-супрессора опухолей в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro.

В варианте осуществления олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере на 80% комплементарной последовательности из по меньшей мере приблизительно пяти последовательных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой молекулы нуклеиновой кислоты полинуклеотида гена-супрессора опухолей.

В другом варианте осуществления обеспечивается способ модулирования функции и/или экспрессии гена-супрессора опухолей в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 3 0 нуклеотидов, специфичным в отношении некодирующей и/или кодирующей последовательностей смысловой и/или природной антисмысловой цепи полинуклеотида гена-супрессора опухолей, причем указанный по меньшей мере один олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере на 50% по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной как SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15; и модулирование функции и/или экспрессии гена-супрессора опухолей в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro.

В одном варианте осуществления обеспечивается синтетический, модифицированный олигонуклеотид, включающий по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одну модификацию выбирают из по меньшей мере одной модифицированной молекулы сахара, по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи, по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида и их комбинаций; а, кроме того, указанный олигонуклеотид является антисмысловым соединением, которое гибридизуется с полинуклеотидом гена-супрессора опухолей и модулирует его экспрессию и/или функцию in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем.

В варианте осуществления по меньшей мере одна модификация включает межнуклеотидную связь, выбираемую из группы, состоящей из фосфоротиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, триэфира фосфорной кислоты, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеотидную связь.

В связанном варианте осуществления олигонуклеотид включает остов из фосфоротиоатных межнуклеотидных связей.

В варианте осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбираемый из пептидонуклеиновой кислоты, замкнутой нуклеиновой кислоты (LNA), их аналога, производного и комбинации.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид включает множество модификаций, причем указанные модификации включают межнуклеотидные связи, выбираемые из фосфоротиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, триэфира фосфорной кислоты, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинации.

В варианте осуществления олигонуклеотид включает множество модификаций, причем указанные модификации включают модифицированные нуклеотиды, выбираемые из пептидонуклеиновых кислот, замкнутых нуклеиновых кислот (LNA), их аналогов, производных и комбинации.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере одну модифицированную молекулу сахара, выбираемую из 2'-O-метоксиэтил-модифицированной молекулы сахара, 2'-метокси-модифицированной молекулы сахара, 2'-O-алкил-модифицированной молекулы сахара, модифицированной молекулы в виде бициклического сахара и их комбинаций.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид включает множество модификаций, причем указанные модификации включают модифицированные молекулы сахара, выбираемые из 2'-O-метоксиэтил-модифицированной молекулы сахара, 2'-метокси-модифицированной молекулы сахара, 2'-O-алкил-модифицированной молекулы сахара, модифицированной молекулы в виде бициклического сахара и их комбинации.

В другом варианте осуществления длина олигонуклеотида составляет по меньшей мере приблизительно 5-30 нуклеотидов, и он гибридизуется с антисмысловой и/или смысловой цепью полинуклеотида гена-супрессора опухолей, причем указанный олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере приблизительно на 20% комплементарной последовательности по меньшей мере из приблизительно пяти последовательных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой кодирующей и/или некодирующей последовательностей нуклеиновых кислот полинуклеотида гена-супрессора опухолей.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид идентичен по последовательности по меньшей мере приблизительно на 80% комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно из пяти последовательных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой кодирующей и/или некодирующей последовательностей нуклеиновых кислот полинуклеотида гена-супрессора опухолей.

В другом варианте осуществления указанный олигонуклеотид гибридизуется с по меньшей мере одним полинуклеотидом гена-супрессора опухолей и модулирует его экспрессию и/или функцию in vivo или in vitro, по сравнению с нормальным контролем.

В варианте осуществления олигонуклеотид включает одну из последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 16-36.

Настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается композиция, включающая один или несколько олигонуклеотидов, специфичных в отношении одного или нескольких полинуклеотидов генов-супрессоров опухолей, при этом указанные полинуклеотиды включают антисмысловые последовательности, комплементарные последовательности, аллели, гомологи, изоформы, варианты, производные, мутанты, фрагменты или их комбинации.

В определенном варианте осуществления олигонуклеотиды

идентичны по последовательности по меньшей мере приблизительно на 40% по сравнению с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 16-36.

В варианте осуществления один или несколько олигонуклеотидов включают любую из нуклеотидных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 16-36.

В другом варианте осуществления олигонуклеотиды, представленные как SEQ ID NO: 16-36, включают одну или несколько модификаций или замен нуклеотидов.

В другом варианте осуществления одну или несколько модификаций выбирают из фосфоротиоата, метилфосфоната, пептидонуклеиновой кислоты, молекул замкнутых нуклеиновых кислот (LNA) и их комбинаций.

В варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ профилактики или лечения заболевания, связанного с по меньшей мере одним полинуклеотидом гена-супрессора опухолей и/или по меньшей мере одним кодируемым им продуктом, включающий введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида, который связывается с природной антисмысловой последовательностью указанного по меньшей мере одного полинуклеотида гена-супрессора опухолей и модулирует экспрессию указанного по меньшей мере одного полинуклеотида гена-супрессора опухолей; посредством чего осуществляется предупреждение или лечение заболевания, связанного с по меньшей мере одним полинуклеотидом гена-супрессора опухолей и/или по меньшей мере одним кодируемым им продуктом.

В определенном варианте осуществления заболевание, связанное с по меньшей мере одним полинуклеотидом гена-супрессора опухолей, выбирают из заболевания, связанного со сниженным или повышенным апоптозом, старения тканей/клеток, рака (в том числе злокачественных опухолей, приведенных в таблице 1), аутоиммунного заболевания, болезни иммунодефицита, включающей СПИД, физиологического старения, нейродегенеративного заболевания или нарушения (например, болезни Альцгеймера, атаксии-телеангиэктазии, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона и т.д.), гиперпластического заболевания (например, келоида), ревматоидного артрита, коронарной болезни сердца, ишемической гибели клеток, лимфопролиферативного нарушения, атеросклероза, остеопороза, миелодиспластического синдрома, вызванного токсином заболевания, вирусной инфекции, заживления раны, болезни Каудена (CD), болезни Лермитта-Дуклоса (LDD), синдрома Баннайана-Зонана (BZS, также известного как синдром Баннайана-Райли-Рувалкаба, синдром Рувалкаба-Мири-Смита и синдром Райли-Смита), трансплантации, связанного с апоптозом заболевания или нарушения, болезни обмена веществ или метаболического состояния (например, диабета), болезней или нарушений почки, инфаркта миокарда/сердечной недостаточности, ишемии, сепсиса, воспалительного заболевания, при котором преобладают конкретные гемопоэтические клетки, пролиферативного заболевания или заболевания или нарушения, в случае которого примером терапии является лечение воспалительного заболевания через увеличение апоптоза.

В варианте осуществления обеспечивается способ идентификации и отбора по меньшей мере одного олигонуклеотида для in vivo введения, включающий отбор полинуклеотида-мишени, связанного с болезненным состоянием; идентификацию по меньшей мере одного олигонуклеотида, включающего по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов, которые комплементарны выбранному полинуклеотиду-мишени или находятся в антисмысловой ориентации относительно него; измерение температурной точки плавления гибрида антисмыслового олигонуклеотида и полинуклеотида-мишени в жестких условиях гибридизации и отбор по меньшей мере одного олигонуклеотида для in vivo введения на основе полученной информации.

Другие аспекты описываются ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1:

Фиг. 1А и 1В являются диаграммой результатов ПЦР в режиме реального времени, на которой демонстрируется кратность изменения в мРНК ТР73 после обработки клеток HepG2 олигонуклеотидами с фосфоротиоатными связями, вводимыми с использованием липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК р73 в клетках HepG2 значительно увеличиваются через 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, разработанных против p73as (фиг. 1А). В тех же образцах уровни РНК p73as значительно снижались после обработки олигонуклеотидами против p73as (Fig. 1B). Столбцы, обозначенные как oligo 1, oligo 2 и oligo 3, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 16, 17 и 18,

соответственно.

Фиг. 1С является диаграммой результатов ПЦР в режиме реального времени, на которой демонстрируется кратность изменения + среднеквадратическое отклонение в мРНК ТР73 после обработки клеток HepG2 олигонуклеотидами в виде киРНК, вводимыми с использованием липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК р73 в клетках HepG2 значительно увеличиваются через 48 ч после обработки двумя из олигонуклеотидов, разработанных против антисмыслового полинуклеотида р73, Hs.668503 и одним из олигонуклеотидов, разработанных против антисмыслового

полинуклеотида р73, Hs.674463. Столбцы, обозначенные как as р73 Hs.668503_l, р73 Hs.668503_2, р73 Hs.674463_1 и р73 Hs.674463_2, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22, соответственно.

Фиг. 1D является диаграммой результатов ПЦР в режиме реального времени, на которой демонстрируется кратность изменения + среднеквадратическое отклонение в мРНК ТР73 после обработки клеток ТМ4 олигонуклеотидами с фосфоротиоатными связями, вводимыми с использованием липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК р73 в мышиных клетках ТМ4 значительно увеличиваются через 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, разработанных против антисмыслового полинуклеотида мышиного р73, Hs.668503 и одним из олигонуклеотидов, разработанных против антисмыслового полинуклеотида мышиного р73, WDR8. Столбцы, обозначенные как р73

мыши Hs.668503_1, р73 мыши Hs.668503_10, р73 мыши Hs.668503_14, р73 мыши Hs.668503_15, р73 мыши WDr8_1, р73 мыши WDr8_7, р73 мыши WDr8_8 и р73 мыши WDr8_3, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 23-30, соответственно.

Фиг. 2 является диаграммой результатов ПЦР в режиме реального времени, на которой демонстрируется кратность изменения в мРНК р53 после обработки клеток HUVEC олигонуклеотидами с фосфоротиоатными связями, вводимыми с использованием липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК р53 в клетках HUVEC значительно увеличиваются через 48 ч после обработки всеми из киРНК, разработанных против p53as (oligo1 Р=0,003, oligo2 Р=0,001 и oligo2 Р=0,03). Столбцы, обозначенные как oligo1, oligo2 и oligo3, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 31, 32 и 33 соответственно.

Фиг. 3 является диаграммой результатов ПЦР в режиме реального времени, на которой демонстрируется кратность изменения в мРНК PTEN после обработки клеток HepG2 олигонуклеотидами с фосфоротиоатными связями, вводимыми с использованием липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК PTEN в клетках HepG значительно увеличиваются через 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, разработанных против антисмыслового полинуклеотида PTEN, Hs.624903. Столбцы, обозначенные как PTEN Hs.607931_2, PTEN Hs.624903_2, PTEN Hs.624903_3, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно.

На фиг. 4 представлены:

SEQ ID NO: 1: вариант 1 транскрипта с гена-супрессора опухолей (ТР73) Homo sapiens, мРНК (входящий №в NCBI: NM_005427.2)

SEQ ID NO: 2 демонстрирует геномную последовательность р73 (экзоны отображены заглавными буквами, интроны - строчными буквами).

SEQ ID NO: 3 демонстрирует мышиную геномную последовательность р73 (экзоны отображены заглавными буквами, интроны - строчными буквами).

SEQ ID NO: 4: опухолевый белок р53 (ТР53) Homo sapiens, вариант 1 транскрипта, мРНК (входящий №в NCBI: NM_000546.4)

SEQ ID NO: 5 демонстрирует геномную последовательность р53 (экзоны отображены заглавными буквами, интроны - строчными буквами).

SEQ ID NO: 6: фосфатаза и гомолог тенсина (PTEN) Homo sapiens, мРНК (входящий № в NCBI: NM_000314).

SEQ ID NO: 7 демонстрирует геномную последовательность PTEN (экзоны отображены заглавными буквами, интроны - строчными буквами).

На фиг. 5 представлены:

SEQ ID NO: 8: природная антисмысловая последовательность p73as (входящий № в NCBI: NM_017818.2)

SEQ ID NO: 9: природная антисмысловая последовательность р73: Hs.668503.

SEQ ID NO: 10: природная антисмысловая последовательность р73: Hs.674463

SEQ ID NO: 11: мышиная природная антисмысловая последовательность р73

SEQ ID NO: 12: мышиная природная антисмысловая последовательность р73: Hs.668503 (Совпадающие основания в последовательности кДНК и геномной последовательности указаны заглавными буквами.)

SEQ ID NO: 13: природная антисмысловая последовательность р53 (входящий №в NCBI: NM_018081.2)

SEQ ID NO: 14: природная антисмысловая последовательность PTEN (Hs.624903)

SEQ ID NO: 15: природная антисмысловая последовательность PTEN (Hs.607931)

На фиг. 6 представлены антисмысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO: 16-22. 'r' означает РНК, a * означает фосфотиоатную связь.

На фиг. 7 представлены антисмысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO: 23-30. * означает фосфотиоатную связь.

На фиг. 8 представлены р53-антисмысловые олигонуклеотиды, связывающиеся с природной антисмысловой последовательностью NM_18081, SEQ ID NO: 31-33.

На фиг. 9 представлены PTEN-антисмысловые олигонуклеотиды, связывающиеся с природной антисмысловой последовательностью Hs.624903 и Hs.607931, SEQ ID NO: 34-36. 'r' означает РНК.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Несколько аспектов настоящего изобретения описываются ниже со ссылкой на примерные применения ради иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные конкретные элементы, взаимосвязи и способы изложены для обеспечения полного понимания настоящего изобретения. Однако специалист со средним уровнем компетентности в релевантной области техники без труда поймет, что настоящее изобретение может быть осуществлено на практике без одного или нескольких конкретных элементов или с использованием других способов. Настоящее изобретение не ограничивается порядком действий или событий, поскольку некоторые действия могут происходить в отличных порядках и/или одновременно с другими действиями или событиями. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события требуются для реализации методологии в соответствии с настоящим изобретением.

Предполагается, что все гены, названия генов и продукты генов, описываемые здесь, соответствуют гомологам из любого вида, для которого применимы описываемые здесь композиции и способы. Таким образом, термины включают, но без ограничения, гены и продукты генов людей и мышей. Понятно, что, когда описывается ген или продукт гена конкретного вида, это описание, как предполагается, приводится лишь в качестве примера и не должно интерпретироваться как ограничение, если контекст, в котором оно обнаруживается, однозначно не свидетельствует об ином. Таким образом, например, в случае описываемых здесь генов, которые в некоторых вариантах осуществления относятся к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям млекопитающих, они, как предполагается, охватывают гомологичные и/или ортологичные гены и продукты генов из других животных, включающих, но без ограничения, других млекопитающих, рыбу, земноводных, рептилий и птиц. В предпочтительных вариантах осуществления гены или последовательности нуклеиновых кислот являются человеческими.

Определения

Используемая здесь терминология предназначена лишь для описания конкретных вариантов осуществления и, как предполагается, не является ограничивающей настоящее изобретением. Предполагается, что используемые здесь формы единственного числа «a», «an» и «the» включают также формы множественного числа, если контекст однозначно не свидетельствует об ином. Кроме того, в тех случаях, когда термины «включающий», «включает», «имеющий», «имеет», «с» или их варианты используются или в подробном описании изобретения, или/и формуле изобретения, такие термины, как предполагается, являются включающими подобным термину «включающий» образом.

Термин «приблизительно» или «примерно» означает в пределах приемлемого диапазона ошибки для конкретного числа, определяемого специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники, который будет зависеть частично от того, каким образом измеряют или определяют число, т.е. от ограничений системы измерения. Например, «приблизительно» может означать в пределах 1 или более 1 среднеквадратического отклонения, в соответствии с практикой в данной области техники. Альтернативно, «приблизительно» может означать диапазон, составляющий вплоть до 20%, предпочтительно вплоть до 10%, более предпочтительно вплоть до 5% и все еще более предпочтительно вплоть до 1% от конкретного числа. Альтернативно, особенно относительно биологических систем или процессов, термин может означать в пределах порядка величины, предпочтительно 5-кратного и более предпочтительно 2-кратного, числа. Если конкретные числа приведены в описании изобретения и формуле изобретения, следует считать термин «приблизительно» означающим в пределах приемлемого диапазона ошибки для конкретного числа, кроме особо оговоренных случаев.

Используемый здесь термин «мРНК» означает известный в настоящее время транскрипт(ы) в виде мРНК целевого гена и любые дополнительные транскрипты, которые могут быть выявлены.

Под «антисмысловыми олигонуклеотидами» или «антисмысловым соединением» подразумевается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-, ДНК-мишенью). Например, если он представляет собой олигонуклеотид в виде РНК, он связывается с другой РНК-мишенью посредством РНК-РНК взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени (Eguchi et al, (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Антисмысловой олигонуклеотид может повышать или понижать экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Подразумевается, что это определение включает любую чужеродную молекулу РНК или ДНК, которая полезна в терапевтическом, диагностическом или другом разрезе. Такие молекулы включают, например, антисмысловые молекулы РНК или ДНК, РНК, участвующие в интерференции (РНК- интерференции), микроРНК, молекулы РНК-ловушек, киРНК, ферментативные РНК, терапевтические корректирующие РНК и РНК-агонист и -антагонист, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), продукты альтернативного сплайсинга, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени. Как таковые, эти соединения могут вводиться в форме одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.

В контексте этого изобретения термин «олигонуклеотид» относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметиков. Термин «олигонуклеотид» также включает линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или связей, включающих дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидонуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), фосфоротиоат, метилфосфонат и т.п. Олигонуклеотиды способны к специфическому связыванию с полинуклеотидом-мишенью через посредство обычного характера взаимодействий мономера с мономером, такого как тип спаривания основания Уотсона-Крика, хугстиновский (Hoogsteen) или обратный Hoogsteen типы спаривания оснований, или т.п.

Олигонуклеотид может быть «химерным», т.е. состоять из различных участков. В контексте этого изобретения «химерные соединения» представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химических участков, например, участок (участки) ДНК, участок (участки) РНК, участок (участки) ПНК и т.д. Каждый химический участок состоит из по меньшей мере одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды типично включают по меньшей мере один участок, в котором олигонуклеотид модифицирован для проявления одного или нескольких желательных свойств. Желательные свойства олигонуклеотида включают, но без ограничения, например, повышенную устойчивость к деградации нуклеазами, увеличенное поступление в клетку и/или повышенное сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, различные участки олигонуклеотида могут обладать различными свойствами. Химерные олигонуклеотиды настоящего изобретения могут быть образованы в виде смешанных структур двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов, описанных выше.

Олигонуклеотид может состоять из участков, которые могут быть соединены в «список», т.е. когда мономеры связаны последовательно, как в природной ДНК, или соединены через спейсеры. Предполагается, что спейсеры являются ковалентным «мостиком» между участками и имеют в предпочтительных случаях длину, не превышающую приблизительно 100 атомов углерода. Спейсеры, являющиеся липофильными, индуцирующими особые вторичные структуры, вроде, например, содержащих аланин пептидов, индуцирующих альфа-спирали, могут нести различные функциональные свойства, например, имея положительный или отрицательный заряд, несут особые свойства связывания с нуклеиновыми кислотами (интеркаляторов, связующих элементов бороздок, токсинов, флуорофоров и т.д.).

Как здесь используется, «ген-супрессор опухолей» охватывает все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, разновидности, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловую и антисмысловую полинуклеотидные цепи и т.д.

Как здесь используются, слова опухолевый белок 73, p73, TP73 используются взаимозаменяемо в настоящей заявке.

Как здесь используются, слова TRP53, белок-супрессор опухолей p53, p53, антиген NY-CO-13 Р53, клеточный опу