Канола ho/ll с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных

Канола ho/ll с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Испрашиваемый приоритет

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США с порядковым № 13/246757, поданной 27 сентября 2011 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к растениям, устойчивым к заболеваниям, например, к растениям Brassica napus, устойчивым к заболеванию килой крестоцветных. Настоящее раскрытие относится также к молекулярным маркерам, которые сцеплены с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных. В конкретных вариантах осуществления раскрытие относится к композициям и способам введения в растение устойчивости к заболеванию килой крестоцветных, например, путем использования молекулярных маркеров, сцепленных с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных. Конкретные варианты осуществления относятся к способам использования конкретных последовательностей нуклеиновой кислоты для идентификации растений, которые, очевидно, имеют фенотип устойчивости к заболеванию килой крестоцветных.

Известный уровень техники

Кила крестоцветных представляет собой широко распространенное заболевание, которое создает серьезные проблемы во многих областях выращивания Brassica. См., например, Dixon (1999) Grower April 29:28-9. Заболевание вызывается одноклеточным организмом Plasmodiophora brassicae. Симптомы заболевания включают аномалии корней с твердыми наплывами (булавами), которые в конечном итоге гниют. Заболевание также вызывает карликовость из-за подавления роста, и при недостатке воды наблюдается увядание листьев. Контролирование заболевания с помощью химических агентов является неэффективным.

Род Brassica включает несколько видов, представляющих коммерческий интерес, таких как B. rapa (например, пекинская капуста, китайская капуста, турнепс); B. napus (например, масличное семя, брюква); B. juncea (например, горчица); B. nigra (например, черная горчица); и B. oleracea (например, цветная капуста, брокколи, кочанная капуста, брюссельская капуста, савойская капуста, листовая капуста, кольраби, браунколь и т.д.). Тогда как подвиды в пределах вида рода Brassica обычно являются совместимыми в отношении размножения, это необязательно в случае размножения различных видов рода Brassica. Например, B. rapa и B. oleracea не имеют одинакового количества хромосом (10 хромосом относительно 9 хромосом) и, следовательно, являются несовместимыми в отношении размножения. Это создает особые трудности для переноса признаков от одного вида Brassica к другому.

В пределах рода Brassica описано несколько вариантов происхождения устойчивости к киле крестоцветных. См., например, Bradshaw et al. (1997) Ann. Appl. Biol. 130:337-48; Gowers (1982) Euphytica 31:971-6. Некоторые варианты устойчивости являются моногенными, некоторые полигенными, некоторые являются доминантными, некоторые являются рецессивными. Моногенная доминантная устойчивость описана у B. rapa и B. napus, такая как, например, моногенная доминантная устойчивость у пекинской капусты B. rapa. Yoshikawa (1983) Japan Agricultural Research Quarterly 17(1):6-11. Гибриды F₁ пекинской капусты с такой устойчивостью, как показано, обладают хорошей защитой против килы крестоцветных, хотя небольшое количество линий («рас») килы крестоцветных обладает способностью разрушать эту устойчивость.

Инфекционное заболевание килой крестоцветных рассматривается как главная угроза промышленному разведению канолы. Попытки скрещивания сортов канолы с устойчивостью к киле крестоцветных должны давать существенное количество растений c расщеплением, которые нуждаются в скрининге их устойчивости к заболеванию килой крестоцветных. Текущая практика скрининга продуктов скрещивания на устойчивость к заболеванию килой крестоцветных включает фенотипирование индивидуальных растений путем наблюдения за фенотипической реакцией этого растения после инокуляции растения патогеном P. brassicae. Этот и без того громоздкий процесс, требующий затрат времени, дополнительно осложняется текущими регуляторными ограничениями на транспорт патогена килы крестоцветных или любого инфицируемого материала. Предшествующие соображения делают цену скрининга продуктов скрещивания на устойчивость к заболеванию килой крестоцветных крайне высокой, а также существенно затрудняют попытки скрещивания за счет ограничения количества линий, которые могут быть протестированы одновременно.

Раскрытие изобретения

В настоящем документе описывается растение Brassica spp. и его части, где растение включает, по меньшей мере, один признак, выбранный из группы, состоящей из: высокого содержания олеиновой и/или низкого содержания линоленовой кислоты; устойчивости к Plasmodiophora brassicae; устойчивости к гербициду (например, к глифосату или имидазолиноновому гербициду); и восстановления цитоплазматической мужской стерильности. В некоторых вариантах осуществления растение Brassica spp. выбрано из группы, состоящей из B. rapa, B. napus, B. juncea, B. nigra, и B. oleracea. Например, в конкретных вариантах осуществления используется B. napus. В конкретных вариантах осуществления предлагается растение Brassica spp., где у растения подтверждается наличие высокого содержания олеиновой и/или низкого содержания линоленовой кислоты по сравнению с растением дикого типа того же вида, подтверждается устойчивость к Plasmodiophora brassicae по сравнению с растением дикого типа того же вида, выявляется устойчивость к имидазолинону по сравнению с растением дикого типа того же вида, и оно включает ген-восстановитель системы цитоплазматической мужской стерильности. Конкретные варианты осуществления могут включать способ выращивания растения Brassica spp. или его частей в соответствии с изобретением в поле, включающем P. brassicae.

В конкретных вариантах осуществления растение (или его части) могут включать геном, гомозиготный в отношении генетических аллелей, которые являются природными для первого родителя и неприродными для второго родителя растения, где у второго родителя подтверждается наличие существенно более низкого содержания олеиновой и/или более высокого содержания линоленовой кислоты, чем у первого родителя. В некоторых примерах растение (или его части) включает аллели от первого растения в гибриде или инбредной комбинации, по меньшей мере, в одном локусе, выбранном из локуса, картированного в группе сцепления, выбранной из N14, N4, N5 и N1 вида Brassica. В конкретных примерах аллель от первого растения может быть картирован с помощью одного или более маркеров, представленных SEQ ID NO: 5, 6, 14, и 15.

В настоящем документе описываются также молекулярные маркеры нуклеиновой кислоты, которые сцеплены (например, сцеплены; тесно сцеплены или предельно тесно сцеплены) с фенотипом Brassica napus с высоким содержанием олеиновой кислоты (HO) и/или низким содержанием линоленовой кислоты (LL). В конкретных вариантах осуществления маркер, который сцеплен с фенотипом HO, сцеплен с мутацией в гене fad2. В конкретных вариантах осуществления маркер, который сцеплен с фенотипом LL, сцеплен с мутацией в гене fad3. В некоторых вариантах осуществления маркеры, которые сцеплены с фенотипом HO/LL в B. napus, могут быть использованы для введения фенотипа HO/LL в другие растения (например, другие виды Brassica). Некоторые варианты осуществления включают способы применения, по меньшей мере, одного молекулярного маркера нуклеиновой кислоты, который сцеплен с фенотипом HO/LL в B. napus, например, без ограничения, для идентификации растений с фенотипом HO/LL; и/или для введения фенотипа HO/LL в новые генотипы растений и зародышевую плазму (например, путем селекции с использованием маркеров или генетической трансформации).

Дополнительно описываются способы введения фенотипа HO в растение рода Brassica и способы введения фенотипа LL в растение рода Brassica. В некоторых примерах способ введения фенотипа HO в растение рода Brassica заключается в мутации с заменой «C» на «T» в положении 411 гена fad2 в растении B. napus. В некоторых примерах способ введения фенотипа LL в растение рода Brassica заключается в мутации с заменой «G» на «A» в первом основании 5'-сайта сплайсинга третьего интрона гена fad32 в растении B. napus.

Описывается также способ идентификации растения, несущего ген, вносящий вклад в фенотип HO растения рода Brassica. В некоторых примерах способом идентификации растения, несущего ген, вносящий вклад в фенотип HO, является зонд, который специфически гибридизуется с сегментом гена fad2 B. napus, содержащим мутацию с заменой «C» на «T» в положении 411, но не гибридизуется с тем же самым сегментом гена fad2 B. napus дикого типа без этой мутации. Описывается также способ идентификации растения, несущего ген, вносящий вклад в фенотип LL растения рода Brassica. В некоторых примерах способом идентификации растения, несущего ген, вносящий вклад в фенотип LL, является зонд, который специфически гибридизуется с сегментом гена fad32 B. napus, содержащим мутацию с заменой «G» на «A» в первом основании 5'-сайта сплайсинга третьего интрона, но не гибридизуется с тем же самым сегментом гена fad32 B. napus дикого типа без этой мутации.

В некоторых вариантах осуществления семена растения Brassica spp. по изобретению могут включать, по меньшей мере, 63% олеиновой кислоты (С18:1). Например, семена растения Brassica spp. по изобретению могут включать, по меньшей мере, 77% олеиновой кислоты (С18:1). В некоторых вариантах осуществления семена растения Brassica spp. по изобретению могут включать не более 6% линоленовой кислоты (С18:3). Например, семена растения Brassica spp. по изобретению могут включать не более 1,5% линоленовой кислоты (С18:3).

В некоторых вариантах осуществления растение по изобретению (или его часть) может включать нуклеотидную последовательность, которая способна специфически гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 и 12. В этих и дополнительных вариантах осуществления растение или его части могут быть устойчивы к имидазолинону (например, имидазолинону, выбранному из группы имазаметбенза, имазамокса, имазапика, имазапира, имазахина и имазэтапира). Особые варианты осуществления включают способ контролирования, по меньшей мере, одного сорняка в поле, где поле содержит, по меньшей мере, одно растение Brassica spp. или его части, и применения имидазолинона, по меньшей мере, в части поля.

В настоящем документе описываются также молекулярные маркеры нуклеиновой кислоты, которые сцеплены (например, сцеплены; тесно сцеплены или предельно тесно сцеплены) с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных у Brassica napus. В некоторых вариантах осуществления маркеры, которые сцеплены с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных у B. napus, могут быть использованы для введения фенотипа устойчивости к заболеванию килой крестоцветных в другие растения (например, другие виды Brassica). Некоторые варианты осуществления включают способы применения, по меньшей мере, одного молекулярного маркера нуклеиновой кислоты, который сцеплен с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных у B. napus, например, и без ограничения, для идентификации растений с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных; и/или для введения фенотипа устойчивости к заболеванию килой крестоцветных в генотипы новых растений (например, путем селекции с использованием маркеров или генетической трансформации). В конкретных примерах маркер, который сцеплен с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных, может быть определен и/или идентифицирован путем амплификации ДНК с использованием праймера, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-22, или его функционального эквивалента.

Дополнительно описываются способы введения устойчивости к заболеванию килой крестоцветных в растение Brassica spp. и способы идентификации растения, несущего ген, вносящий вклад в устойчивость к заболеванию килой крестоцветных. В некоторых примерах способ введения устойчивости к заболеванию килой крестоцветных в растение Brassica spp. заключается в использовании последовательного сегмента геномной ДНК, который составляет 300 п.о. в длину и амплифицируется с помощью иллюстративных праймеров с SEQ ID NO: 18 и 19, причем маркер сцеплен с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных у растения B. napus. Описываются также способы идентификации растения, несущего ген, вносящий вклад в устойчивость к заболеванию килой крестоцветных. В некоторых примерах способом идентификации растения, несущего ген, вносящий вклад в устойчивость к заболеванию килой крестоцветных, является зонд, который специфически гибридизуется с последовательным сегментом геномной ДНК, который составляет 300 п.о. в длину и амплифицируется с помощью иллюстративных праймеров с SEQ ID NO: 18 и 19.

Представленные выше и другие особенности станут более понятны из последующего подробного описания некоторых вариантов осуществления, которые представлены со ссылкой на сопровождающие фигуры.

Краткое описание фигур

Фиг.1 включает частичные геномные нуклеотидные последовательности гена fad2, клонированного из сортов B. napus DMS100 и Quantum. Вверху показана частичная геномная нуклеотидная последовательность гена fad2, клонированного из DMS100 (SEQ ID NO:7), а внизу показана последовательность частичной геномной нуклеотидной последовательности гена fad2, клонированного из Quantum (SEQ ID NO:9). Острие стрелки указывает на мутацию одиночного нуклеотида с заменой «С» на «T», что приводит к стоп-кодону («TAG») (заштриховано). Мутантные специфичные для аллеля прямой (SEQ ID NO:5) и обратный (SEQ ID NO:6) праймеры для идентификации с помощью ПЦР маркера, специфичного для мутантного аллеля, показаны жирным шрифтом и подчеркнуты.

Фиг.2 включает аминокислотные последовательности гена fad2 из вырожденной геномной нуклеотидной последовательности, клонированной из DMS100 (SEQ ID NO:8), Quantum (SEQ ID NO:10) и из опубликованного гена fad2 Brassica napus (BNfad2) (SEQ ID NO:11). Острие стрелки указывает на положение стоп-кодона, возникающего из-за мутации одиночного нуклеотида (замена «С» на «T») у DMS100.

Фиг.3 включает геномные нуклеотидные последовательности гена fad3c, клонированные из DMS100 и Quantum. Вверху показан ген fad3с, клонированный из DMS100 (SEQ ID NO:12), а внизу показан ген fad3с, клонированный из Quantum (SEQ ID NO:13). Экзоны, соответствующие экзонам 4, 5, 6 и 7 гена fad3 в Brassica rapa и Arabidopsis, заключены в прямоугольники, а интроны, соответствующие интронам 4, 5 и 6 гена fad3 в Brassica rapa и Arabidopsis, не заключены в прямоугольники. Острие стрелки указывает на мутацию одиночного нуклеотида с заменой «G» на «A». Прямой (SEQ ID NO:14) и мутантный, специфичный для аллеля обратный (SEQ ID NO:15) праймеры для идентификации с помощью ПЦР маркера, специфичного для мутантного аллеля, показаны жирным шрифтом и подчеркнуты.

Фиг.4 включает таблицу, в которой представлены корреляции маркеров, специфичных для мутантного аллеля, с содержанием жирных кислот в 184 дважды гаплоидных (DH) линиях, происходящих от скрещивания Quantum и DMS100 (вверху), а также результаты электрофореза продуктов ПЦР, амплифицированных с маркера, специфичного для мутантного аллеля гена fad2 (внизу).

Фиг.5 включает картирование локуса количественных признаков (QTL), показывающее одну главную (N5) и одну минорную (N1) область QTL для высокого содержания олеиновой кислоты (С18:1) и три области QTL (N4 и N14) для низкого содержания линоленовой кислоты (С18:3), определенные с помощью маркеров по настоящему изобретению.

Фиг.6 включает схематическое представление одного варианта применения системы цитоплазматической мужской стерильности в схеме получения гибридных семян.

Фиг.7 включает диаграмму, показывающую распределение профилей жирных кислот для различных гибридов растений.

Фиг.8 включает иллюстрацию распределения дат цветения у иллюстративных растений канолы, устойчивых к заболеванию килой крестоцветных с высоким содержанием олеиновой кислоты и низким содержанием линоленовой кислоты.

Фиг.9 включает изображение геля, демонстрирующее идентификацию молекулярного маркера, сцепленного с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных у канолы. Полоса идентифицированного маркера, сцепленного с устойчивостью к киле крестоцветных, выделена красным, и в этом случае размер амплифицированного фрагмента составляет 333 п.о. (33 дополнительных пары оснований суммарно были добавлены к праймерам SEQ ID NO: 18 и 19 (26 оснований было добавлено к 5'-концу SEQ ID NO:18, и 7 оснований было добавлено к 5'-концу SEQ ID NO:19, как представлено в SEQ ID NO: 20 и 21, соответственно) для облегчения определения с использованием генетического анализатора ABI 3130). Представлена реакция каждой линии на заболевание килой крестоцветных.

Перечень последовательностей

Последовательности нуклеиновых кислот, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных аббревиатур для нуклеотидных оснований, как определено в § 1.822 37 C.F.R., показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но понятно, что комплементарная цепь подлежит включению при любой ссылке на представленную цепь.

SEQ ID NO: 1-2 представляют собой праймеры, используемые для амплификации гена fad2 геномной ДНК B. napus родительских линий DMS100 и Quantum.

SEQ ID NO: 3-4 представляют собой праймеры, используемые для амплификации гена fad31 геномной ДНК B. napus родительских линий DMS100 и Quantum.

SEQ ID NO:5 представляет собой специфичный для мутанта прямой праймер для идентификации и/или определения аллеля fad2, который вносит вклад в высокое содержание олеиновой и/или низкое содержание линолевой кислоты у Brassica.

SEQ ID NO:6 представляет собой обратный праймер для идентификации и/или определения аллеля fad2, который вносит вклад в высокое содержание олеиновой и/или низкое содержание линолевой кислоты у Brassica.

SEQ ID NO:7 представляет собой родительскую геномную нуклеотидную последовательность гена fad2, клонированную из сорта B. napus DMS100.

SEQ ID NO:8 представляет собой аминокислотную последовательность продукта гена fad2 из вырожденной геномной нуклеотидной последовательности, клонированной из сорта B. napus DMS100, причем последовательность, как показано, прервана «стоп»-кодоном.

SEQ ID NO:9 представляет собой родительскую геномную нуклеотидную последовательность гена fad2, клонированную из сорта B. napus Quantum.

SEQ ID NO:10 представляет собой аминокислотную последовательность продукта гена fad2 из вырожденной геномной нуклеотидной последовательности, клонированной из сорта B. napus Quantum.

SEQ ID NO:11 представляет собой аминокислотную последовательность продукта гена fad2 из вырожденной геномной нуклеотидной последовательности из сорта B. napus BNfad2.

SEQ ID NO:12 представляет собой геномную нуклеотидную последовательность гена fad3с, клонированную из сорта B. napus DMS100.

SEQ ID NO:13 представляет собой геномную нуклеотидную последовательность гена fad3с, клонированную из сорта B. napus Quantum.

SEQ ID NO:14 представляет собой прямой праймер для идентификации и/или определения аллеля fad32, который вносит вклад в высокое содержание олеиновой и/или низкое содержание линолевой кислоты у Brassica.

SEQ ID NO:15 представляет собой специфичный для мутанта обратный праймер для идентификации и/или определения аллеля fad32, который вносит вклад в высокое содержание олеиновой и/или низкое содержание линолевой кислоты у Brassica.

SEQ ID NO: 16 и 17 представляют собой праймеры, используемые для амплификации гена fad32 геномной ДНК B. napus родительских линий DMS100 и Quantum.

SEQ ID NO: 18-21 представляют собой последовательности иллюстративных праймеров, пригодных для идентификации и/или определения маркера устойчивости к заболеванию килой крестоцветных.

SEQ ID NO:22 представляет собой последовательность флуоресцентно меченного универсального праймера M13, используемую для амплификации меченых фрагментов ДНК при использовании для определения с SEQ ID NO: 20 и 21.

Вариант(ы) осуществления изобретения

I. Обзор нескольких вариантов осуществления

В настоящем документе описываются растения Brassica spp. (например, B. napus) и их потомство, включающее фенотип устойчивости к заболеванию килой крестоцветных. В настоящем документе описываются также части растения, полученные из растения Brassica, включая семена и растительные материалы растения. В конкретных вариантах осуществления устойчивость к киле крестоцветных может быть моногенной и/или мультигенной. В конкретных вариантах осуществления устойчивость к киле крестоцветных может быть доминантной и/или рецессивной.

При использовании растения Brassica napus, включающего фенотип устойчивости к заболеванию килой крестоцветных, идентифицированы молекулярные маркеры, которые тесно сцеплены с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных. В частности идентифицирован локус маркера, представляющего собой повтор короткой последовательности (SSR), который тесно сцеплен с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных. Этот маркер SSR может быть особенно пригоден для введения этого фенотипа в другие растения (например, другие сорта B. napus и другие виды Brassica), например, путем традиционного скрещивания растений, а также для идентификации растений, вероятно имеющих этот фенотип (например, среди растений, созданных рекомбинантным генно-инженерным способом). Использование, по меньшей мере, одного молекулярного маркера, который тесно сцеплен с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных, в программе скрещивания Brassica может существенно снизить время и стоимость скрининга материалов для скрещивания на устойчивость к заболеванию килой крестоцветных. Например, использование такого маркера может снизить необходимость в дорогостоящем скрининге на устойчивость к заболеванию килой крестоцветных, тем самым существенно облегчая скрещивание сортов канолы с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных.

II. Термины

Обратное скрещивание: Методы обратного скрещивания могут быть использованы для введения последовательности нуклеиновой кислоты в растения. Метод обратного скрещивания широко используется в течение десятилетий для введения новых признаков в растения. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. При типичном протоколе обратного скрещивания исходный представляющий интерес сорт (рекуррентный родитель) скрещивается со вторым сортом (нерекуррентным родителем), который несет представляющий интерес ген, предназначенный для переноса. Полученное потомство от этого скрещивания затем опять скрещивают с рекуррентным родителем, и процесс повторяют до тех пор, пока не получат растение, где в трансформированном растении открываются по существу все желаемые морфологические и физиологические характеристики рекуррентного родителя в дополнение к гену, перенесенному от нерекуррентного родителя.

Устойчивость к киле крестоцветных: Устойчивость или толерантность растения к киле крестоцветных относится к увеличенному росту, продуктивности и/или снижению размера и/или количества корневых наплывов у растения по сравнению с неустойчивым и/или нетолерантным сортом того же растения при выращивании в поле, включающем Plasmodiophora brassicae. При применении в настоящем описании устойчивость к киле крестоцветных также включает толерантность к киле крестоцветных. Устойчивость к киле крестоцветных может быть придана с помощью одного или более генов, аллелей или трансформантов.

Генетический локус: При применении в настоящем описании термин «генетический локус» относится к локализации в хромосоме.

Геномный локус: При применении в настоящем описании термин «геномный локус» относится к локализации в пределах полного набора хромосом организма.

Неравновесное сцепление: При применении в настоящем описании термин «неравновесное сцепление» относится к статистической связи между двумя локусами или между свойством и маркером.

Сцепленный, прочно сцепленный и предельно прочно сцепленный: При применении в настоящем описании сцепление между генами или маркерами относится к феномену, при котором гены или маркеры в хромосоме проявляют поддающуюся измерению вероятность совместной передачи индивидуумам в последующем поколении. Сцепление двух генов или маркеров происходит относительно друг друга, эта вероятность возникает при сцеплении с (1). Таким образом, термин «сцепленный» может относиться к одному или более генам или маркерам, которые передаются вместе с геном с вероятностью более 0,5 (которая ожидается при независимом наборе, когда маркеры/гены локализованы на различных хромосомах). Так как близость двух генов или маркеров в хромосоме прямо связана с вероятностью того, что эти гены или маркеры будут совместно переданы индивидуумам в следующем поколении, термин «сцепленные» в настоящем описании может также относиться к одному или более генам или маркерам, которые локализованы в пределах приблизительно 2,0 Мб относительно друг друга в одной и той же хромосоме Brassica spp. Таким образом, два «сцепленных» гена или маркера могут быть разделены приблизительно 2,1 Мб; 2,00 Мб; приблизительно 1,95 Мб; приблизительно 1,90 Мб; приблизительно 1,85 Мб; приблизительно 1,80 Мб; приблизительно 1,75 Мб; приблизительно 1,70 Мб; приблизительно 1,65 Мб; приблизительно 1,60 Мб; приблизительно 1,55 Мб; приблизительно 1,50 Мб; приблизительно 1,45 Мб; приблизительно 1,40 Мб; приблизительно 1,35 Мб; приблизительно 1,30 Мб; приблизительно 1,25 Мб; приблизительно 1,20 Мб; приблизительно 1,15 Мб; приблизительно 1,10 Мб; приблизительно 1,05 Мб; приблизительно 1,00 Мб; приблизительно 0,95 Мб; приблизительно 0,90 Мб; приблизительно 0,85 Мб; приблизительно 0,80 Мб; приблизительно 0,75 Мб; приблизительно 0,70 Мб; приблизительно 0,65 Мб; приблизительно 0,60 Мб; приблизительно 0,55 Мб; приблизительно 0,50 Мб; приблизительно 0,45 Мб; приблизительно 0,40 Мб; приблизительно 0,35 Мб; приблизительно 0,30 Мб; приблизительно 0,25 Мб; приблизительно 0,20 Мб; приблизительно 0,15 Мб; приблизительно 0,10 Мб; приблизительно 0,05 Мб; приблизительно 0,025 Мб; приблизительно 0,012 Мб и приблизительно 0,01 Мб. Ген может быть «сцеплен» с маркером, который находится в пределах экзона или интрона гена. В этом случае разделение между сцепленными геном и маркером составляет 0,00 Мб.

Конкретные примеры маркеров, которые «сцеплены» с fad2, включают нуклеотидные последовательности в группе сцепления N5 и N1 генома B. napus, например, с мутацией с заменой «С» на «T» в положении 411 гена fad2 B. napus. Конкретные примеры маркеров, которые «сцеплены» с fad3, включают нуклеотидные последовательности в группе сцепления N14 и N4 генома B. napus, например, с мутацией с заменой «G» на «A» в первом основании 5'-сайта сплайсинга третьего интрона гена fad32 в B. napus.

Маркеры и/или гены могут также быть «сцепленными» с фенотипом, например, с фенотипом, в который вовлечен сцепленный ген или ген, сцепленный со сцепленным маркером. Некоторые варианты осуществления включают маркеры, которые сцеплены с HO, LL, устойчивостью к имидазолинону и/или фенотипами устойчивости к заболеванию килой крестоцветных. Конкретные примеры маркеров, которые «сцеплены» с фенотипами HO/LL, включают маркеры, которые сцеплены с fad2 и fad3. Конкретные примеры маркеров, которые «сцеплены» с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных, включают последовательный сегмент геномной ДНК, который составляет 300 п.о. в длину и амплифицируется иллюстративными праймерами SEQ ID NO: 16 и 17. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, длина этого маркера SSR будет варьироваться, если нуклеотиды добавляются или удаляются из участка геномной ДНК, локализованного между дистальными концами конкретных праймеров, используемых при отжиге.

При применении в настоящем описании термин «тесно сцепленный» может относиться к одному или более генам или маркерам, которые расположены в пределах приблизительно 0,5 Мб относительно друг друга в одной и той же хромосоме. Таким образом, два «тесно сцепленных» гена или маркера могут быть разделены приблизительно 0,6 Мб; приблизительно 0,55 Мб; 0,5 Мб; приблизительно 0,45 Мб; приблизительно 0,4 Мб; приблизительно 0,35 Мб; приблизительно 0,3 Мб; приблизительно 0,25 Мб; приблизительно 0,2 Мб; приблизительно 0,15 Мб; приблизительно 0,12 Мб; приблизительно 0,1 Мб; приблизительно 0,05 Мб и приблизительно 0,00 Мб. Конкретные примеры маркеров, которые «тесно сцеплены» с fad2, включают определенные нуклеотидные последовательности в группе сцепления N5 и N1 генома B. napus, например, с мутацией с заменой «С» на «T» в положении 411 гена fad2 B. napus. Конкретные примеры маркеров, которые «тесно сцеплены» с fad3, включают определенные нуклеотидные последовательности в группе сцепления N14 и N4 генома B. napus, например, с мутацией с заменой «G» на «A» в первом основании 5'-сайта сплайсинга третьего интрона гена fad32 B. napus. Конкретные примеры маркеров, которые «тесно сцеплены» с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных, включают последовательный сегмент геномной ДНК, который составляет 300 п.о. в длину и амплифицируется иллюстративными праймерами SEQ ID NO: 16 и 17.

При применении в настоящем описании термин «предельно тесно сцепленный» может относиться к одному или более генам или маркерам, которые расположены в пределах приблизительно 100 т.п.о. относительно друг друга в одной и той же хромосоме. Таким образом, два «предельно тесно сцепленных» гена или маркера могут быть разделены приблизительно 125 т.п.о.; приблизительно 120 т.п.о.; приблизительно 115 т.п.о.; приблизительно 110 т.п.о.; приблизительно 105 т.п.о.; 100 т.п.о.; приблизительно 95 т.п.о.; приблизительно 90 т.п.о.; приблизительно 85 т.п.о.; приблизительно 80 т.п.о.; приблизительно 75 т.п.о.; приблизительно 70 т.п.о.; приблизительно 65 т.п.о.; приблизительно 60 т.п.о.; приблизительно 55 т.п.о.; приблизительно 50 т.п.о.; приблизительно 45 т.п.о.; приблизительно 40 т.п.о.; приблизительно 35 т.п.о.; приблизительно 30 т.п.о.; приблизительно 25 т.п.о.; приблизительно 20 т.п.о.; приблизительно 15 т.п.о.; приблизительно 12 т.п.о.; приблизительно 10 т.п.о.; приблизительно 5 т.п.о.; приблизительно 1 т.п.о. и приблизительно 0 т.п.о. Конкретные примеры маркеров, которые «предельно тесно сцеплены» с fad2, включают определенные нуклеотидные последовательности в группе сцепления N5 и N1 генома B. napus, например, с мутацией с заменой «С» на «T» в положении 411 гена fad2 B. napus. Конкретные примеры маркеров, которые «предельно тесно сцеплены» с fad3, включают определенные нуклеотидные последовательности в группе сцепления N14 и N4 генома B. napus, например, с мутацией с заменой «G» на «A» в первом основании 5'-сайта сплайсинга третьего интрона гена fad32 B. napus. Конкретные примеры маркеров, которые «предельно тесно сцеплены» с фенотипом устойчивости к заболеванию килой крестоцветных, включают последовательный сегмент геномной ДНК, который составляет 300 п.о. в длину и амплифицируется иллюстративными праймерами SEQ ID NO: 16 и 17.

Сцепленные, тесно сцепленные и предельно тесно сцепленные генетические маркеры могут применяться в программах селекции с использованием маркеров для идентификации индивидуумов, включающих сцепленные фенотипы и/или типы генов, и для воспроизведения этих признаков и/или генов в сортах Brassica.

Локус: При применении в настоящем описании термин «локус» относится к положению в геноме, которое соответствует поддающемуся измерению свойству (например, признаку). Локус SNP определяется зондом, который гибридизуется с ДНК, содержащейся в пределах локуса.

Маркер: При применении в настоящем описании маркер относится к гену или нуклеотидной последовательности, которая может быть использована для идентификации растений, имеющих определенный аллель, например, fad2, fad3 и последовательный сегмент геномной ДНК, который составляет 300 п.о. в длину и амплифицируется иллюстративными праймерами SEQ ID NO: 16 и 17. Маркер может быть описан как вариант данного геномного локуса. Генетический маркер может представлять собой короткую последовательность ДНК, такую как последовательность вокруг изменения одной пары оснований (полиморфизм по одному нуклеотиду или «SNP»), или более длинную последовательность, например, повтор минисателлитной/простой последовательности («SSR»). «Аллель маркера» относится к варианту маркера, который присутствует в конкретном растении. При применении в настоящем описании «маркер» включает ссылку на локус в хромосоме, который служит для идентификации индивидуального положения в хромосоме. Генотип может быть определен с помощью использования одного или множества маркеров. Таким образом, «маркер» включает ссылку на одно или более положение(ия) нуклеотида в гене, локализованном в хромосоме генома.

Молекулярные маркеры особенно пригодны для ускорения процесса введения гена или локусов количественных признаков (QTL) в элитный сорт культурного растения или скрещиваемую линию путем обратного скрещивания. Маркеры, сцепленные с геном, могут быть использованы для селекции растений, обладающих желаемым признаком, и маркеры, распределенные по геному, могут быть использованы для селекции растений, которые генетически сходны с рекуррентным родителем. Young and Tanksley (1989) Theor. Appl. Genet. 77:95-101; Hospital et al. (1992) Genetics 132:1199-210.

При применении в настоящем описании термин «маркер» может относиться к клонированному сегменту хромосомной ДНК Brassica (например, сегменту с нуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO:7, либо SEQ ID NO:12) и может также или альтернативно относиться к молекуле ДНК, которая комплементарна клонированному сегменту хромосомной ДНК Brassica.

Некоторые варианты осуществления включают «производное» маркера. При применении в настоящем описании термин «производное» может относиться к модификации конкретной последовательности маркера. Иллюстрациями таких модификаций в отношении молекулярных маркеров являются замена, вставка и/или делеция одного или более оснований относительно последовательности нуклеиновой кислоты маркера, раскрытой в настоящем описании, которые предохраняют, слегка изменяют или повышают функцию молекулярного маркера в отношении идентификации одного или более признака(ов) (например, устойчивости к заболеванию килой крестоцветных и признаков высокого содержания олеиновой и/или низкого содержания линоленовой кислот у Brassica или других видов семенных культур). Такие производные могут быть легко определены специалистом в данной области техники, например, с помощью использования методов компьютерного моделирования для предсказания и оптимизации структуры последовательности. Термин «производное», таким образом, включает последовательности нуклеиновой кислоты, которые по существу идентичны одной или более последовательностям раскрытых в настоящем описании маркеров, так что производные маркеров способны обладать раскрытыми функциями для использования в селекции с использованием маркеров.

Селекция с использованием маркеров: При применении в настоящем описании термин «селекция с использованием маркеров» может относиться к подходу к селекции непосредственно одного или более комплексов признаков (например, HO, LL, устойчивости к имидазолинону и/или устойчивости к заболеванию килой крестоцветных). В современной практике селекционеры растений делают попытки идентификации легко определяемых признаков, таких как цвет цветков, внешний вид оболочки семян или варианты изозимов, которые сцеплены с агрономически желаемым признаком. Селекционеры затем прослеживают агрономический признак в расщепляемых, селекционных популяциях, следя за расщеплением легко определяемого признака. Однако существует очень мало таких взаимоотношений сцепления, доступных для использования при селекции растений.

Селекция с использованием маркеров является способом улучшения сортов растений, целесообразным в отношении времени и цены. Ряд примеров применения селекции с использованием маркеров включает использование изозимных маркеров. См., например, Tanksley and Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevier. Одним примером является изозимный маркер, сцепленный с геном устойчивости к вредителям нематодам у томатов. Устойчивость контролируется геном, обозначаемым Mi, расположенным в 6 хромосоме томата и очень тесно сцепленным с Aps1, изозимом - кислой фосфатазой. Использование маркера изозима Aps1 для непрямой селекции гена Mi создало преимущества в том, что расщепление в популяции можно было однозначно определить с помощью стандартных методов электрофореза; маркер изозима может быть количественно оценен в ткани рассады, что исключает необходимость поддерживания растения до созревания; и кодоминантные аллели маркера изозима позволяют дискриминировать гомозигот от гетерозигот. См. Rick (1983) in Tanksley and Orton, выше.

В некоторых вариантах осуществления присутствие маркера в растении может быть определено при использовании зонда нуклеиновой кислоты. Зонд может представлять собой молекулу ДНК или молекулу РНК. РНК-зонды могут быть синтезированы с помощью методов, известны