Способ высокоэффективного отбора микробных антагонистов против патогенов

Способ высокоэффективного отбора микробных антагонистов против патогенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее раскрытие относится к высокоэффективным способам скрининга биологических образцов. Более конкретно, данное раскрытие относится к одновременной идентификации микроорганизмов, обладающих биоконтролирующей активностью, включая микроорганизмы, пригодные для улучшения здоровья растений, животных и человека, в частности те, которые обладают антагонистической активностью против патогенов растений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инфекции патогенами, такие, как грибковые инфекции растений и животных, вызывают значительные потери продуктивной способности по всему миру. Например, среди наиболее важных биотических агентов, вызывающих серьезные потери и повреждения продуктов сельского хозяйства, находится большое количество вредителей растений, включая вредных насекомых, растений-паразитов, грибков и бактериальных патогенов. Во всем мире болезни, вызываемые патогенами сельскохозяйственных культур, вызывают потери, оцененные, приблизительно, в 12%, и предполагаемые послеуборочные потери из-за порчи продуктов питания составляют от 10% до 50%. Только в Соединенных Штатах эти цифры, предположительно, составляют, соответственно 12% и 9%. Различные болезни, вызываемые патогенами, передающимися с семенами или передающимися с почвой, часто вызывают тяжелые экономические потери в земледельческом и плодоовощном производствах. Помимо сельского хозяйства болезни, вызванные патогенами, могут приводить к разрушению целых растительных насаждений на болотах, в лесах или в других природных окружениях, наряду с другими растительными системами.

Для борьбы и контроля за патогенами растений применяется ряд различных стратегий. Помимо хорошей агрономической и культурной практики, растениеводы часто сильно полагаются на применение химических пестицидов. Действительно, химические пестициды против патогенов хорошо известны в области техники, к которой относится данное изобретение, и они интенсивно использовались многие годы в промышленном производстве растений и животных. Способы профилактического и/или терапевтического лечения грибковых и бактериальных инфекций у животных и растений, в целом, включают применение противогрибковых и противобактериальных агрохимических продуктов. Однако широкое применение химических веществ в сельском хозяйстве явилось предметом возрастающей общественной обеспокоенности и внимания из-за потенциально вредных воздействий на окружающую среду и здоровье человека. Действительно, несмотря на все выгоды пестицидов, часто сообщается о том, что агрохимические продукты часто поражают нецелевые организмы, такие, как человек, крупный рогатый скот, дикую природу и другие живые организмы. Другие проблемы, связанные с использованием пестицидов, включая появление патогенов, резистентных к пестицидам, привело к постепенному устранению и снятию с производства некоторых имеющихся пестицидов. В добавление к вышеуказанным проблемам распространение болезней, вызываемых патогенами растений, в природных экосистемах может препятствовать успешному применению химических веществ из-за масштаба, в котором придется использовать такие применения. В последние десятилетия повышенная обеспокоенность в отношении влияния применения пестицидов на окружающую среду и здоровье человека привела к усилиям по снижению зависимости от химического контроля нежелательных вредителей. В добавление, в настоящее время существуют строгие положения по применению химических пестицидов и определенное политическое давление, имеющее целью удалить наиболее опасные химические вещества с рынка. В результате возрастает нерасположение некоторых химических компаний к разработке и тестированию новых химических соединений из-за соображений, связанных с процессом регистрации и стоимостью.

В связи с этим совершенно очевидно что имеется потребность в разработке не-химических альтернативных способов контроля болезней растений, вызванных патогенами. Например, возрастает уверенность в том, что биологических контроль патогенов растений является жизнеспособной альтернативой защиты от болезней растений. В частности, использование биологически активных агентов в контроле вредителей растений и болезней, вызванных патогенами, стал особенно важным для сертифицированных органических растениеводов, которым может не понадобиться использование синтетических химических веществ для защиты растений от вредителей.

В качестве биоконтролирующих агентов сообщалось о нескольких микроорганизмах, антагонистичных по отношению к патогенам растений. За последние десятилетия было опубликовано большое количество документов, относящихся к использованию композиций, содержащих различные штаммы дрожжей или другие микроорганизмы против патогенов растений. Способы заражения растений микробными антагонистами использовались с хорошими результатами против некоторых распространенных грибковых патогенов нескольких посевных культур. Например, микробные антагонисты использовались для подавления табачной мозаики, корневой и напенной гнили хвойных, каштановой тли, тристецы цитрусовых и корончатого галла некоторых посевов. Во многих примерах посевные семена, покрытые микробными антагонистами, продемонстрировали сниженное инфицирование патогенами и повышенный рост растений. В добавление, некоторые послеуборочные грибковые заболевания могут контролироваться путем использования антагонистических грибков и бактерий. Примером послеуборочного биоконтроля является угнетение коричневой гнили персиков при хранении, которое может быть достигнуто в имитированных коммерческих условиях путем внедрения антагонистической бактерии Bacillus subtilis в воск, используемый в упаковочном процессе.

К сожалению, для большинства патогенов в настоящее время отсутствуют эффективные технологии биоконтроля. Хотя концепция биологического контроля является привлекательной, остается критическая потребность в новых микроорганизмах, имеющих новые способности к биоконтролю. До некоторой степени эта потребность в первую очередь обусловливается стремительным появлением новых штаммов патогенов, резистентных к химическим пестицидам, или ограничением использований агрохимических пестицидов. В добавление, существуют различные барьеры широкомасштабного внедрения применений контроля вредителей, включая наличие сложных смесей патогенов в природном окружении. Более того, в течение своего жизненного цикла растения, микроорганизмы и патогены взаимодействуют друг с другом при помощи большого разнообразия способов. Эти сложные взаимодействия могут оказывать значительное влияние на развитие каждого из этих организмов различными путями. Вдобавок, патогены растений, в особенности, грибковые патогены, очень разнообразны, и их патогенность различна у различных растений-хозяев. Более того, коммерческое использование и применение агентов биологического контроля развивалось медленно, в основном, из-за различного поведения в различных условиях окружения в полевых условиях. Таким образом, в то время, как концепция биологического контроля является привлекательной, технология применялась только в ограниченных случаях.

Для того, чтобы преодолеть обсуждаемые выше проблемы и ограничения, и с целью перенесения технологии биоконтроля в поле и коммерциализации биоконтролирующих агентов, важно разрабатывать новые составы биоконтролирующих микроорганизмов с большей степенью стабильности и выживаемости. Для этой цели важно проводить поиск новых и новейших биоконтролирующих микроорганизмов с различными механизмами действия. Действительно, поскольку биологический контроль основывается на микроорганизмах, следует идентифицировать дополнительные микроорганизмы с подходящими биохимическими и физиологическими характеристиками для выполнения этой задачи.

В ответ на давление создавать более коммерчески жизнеспособные биоконтролирующие решения многие лаборатории, как в академических учреждениях, так и в промышленности, инвестируют значительные ресурсы в идентификацию и оценку новых микроорганизмов-кандидатов, которые потенциально пригодны для применений биоконтроля в коммерческом масштабе. Микроорганизмы представляют собой наибольший компонент живой природы и, как это общепризнанно, представляют собой единый наибольший источник эволюционного и биохимического разнообразия на планете. Действительно, общее количество микробных клеток на Земле по оценке составляет, по меньшей мере, 10³⁰. Только прокариоты представляют собой наибольшую часть индивидуальных организмов, включающих от 10⁶ до 10⁸ отдельных генетических видов. Однако через ограничение существующих скрининговых способов эти природные ресурсы с огромным биоразнообразием остаются в значительной степени неиспользованным резервуаром новых видов, генов, ферментных активностей и соединений с потенциалами коммерческого использования. В настоящее время первичный скрининговый этап типично представляется собой первую лимитирующую стадию в обнаружении биоконтролирующих способностей микроорганизмов. Доступные в настоящее время способы для скрининга коммерчески жизнеспособных микробных антагонистов остаются в значительной степени неизмененными с момента возникновения сферы деятельности и поэтому часто не могут эффективно применяться к этим недостаточно изученным ресурсам. В таких скринингах обычно собирают большое количество микроорганизмов-кандидатов из природных сред и затем подвергают различным селекционным методикам, которые часто являются трудоемкими, интенсивными и/или достаточно медленными.

Ввиду вышеизложенного существует большая потребность в улучшении скорости открытия и применения решений биоконтроля. В частности, необходимы новые способы, способствующие быстрой и эффективной идентификации микроорганизмов с биоконтролирующей активностью против широкого диапазона патогенов. Один аспект настоящего изобретения предоставляет высокоэффективный скрининговый способ в качестве решения этой давно ощущавшейся проблемы, предоставляющий процесс для быстрого и эффективного доступа к генетическому разнообразию популяций микроорганизма и, тем самым, идентифицирующий новейшие микроорганизмы коммерческого интереса.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один аспект настоящего раскрытия относится к способу отбора микроорганизма, обладающего антагонистической активностью против патогена. Данный способ включает (a) предоставление мультитестовой платформы и множества микробных образцов, где мультитестовая платформа содержит одну или более твердых микробных ростовых сред, содержащих диспергированную популяцию патогена; (б) отдельное и одновременное приведение каждого их микробных образцов в контакт с диспергированной популяцией патогена (в) ко-культивирование микробных образцов с диспергированной популяцией патогена для оценки ответа патогена на каждый из микробных образцов; и (г) отбор одного или более микробных образцов, содержащих микроорганизм, имеющий антагонистическую активность против патогена.

Выполнения способов отбора в соответствии с этим аспектом может включать одну или более из следующих характеристик. В определенных вариантах воплощения множество микробных образцов содержит, по меньшей мере, 12, 24, 48, 96, 200, 384, 400, 500, 1000 или 1500 микробных образцов. В некоторых вариантах воплощения один или более микробных образцов могут быть изолированными культурами микроорганизмов. В некоторых других вариантах воплощения, по меньшей мере, один из микробных образцов может быть смесью двух или более изолированных микроорганизмов. В еще некоторых других вариантах воплощения один или более микробных образцов могут быть получены напрямую из природной среды.

В соответствии с некоторыми вариантами воплощения данного аспекта патоген может быть патогеном растений. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения патогеном растений является грибок. В некоторых других особенно предпочтительных вариантах воплощения патоген растений может быть избран из группы, состоящей из Colletotrichum sp., Fusarium sp., Gibberella sp., Monographella sp. и Stagnospora sp. В еще некоторых других особенно предпочтительных вариантах воплощения патоген растений может быть избран из группы, состоящей из Colletotrichum graminicola, Fusarium graminearum, Gibberella zeae, Monographella nivalis и Stagnospora nodurum.

В определенных вариантах воплощения диспергированная популяция патогена содержит клети патогена, формирующие клеточный слой на поверхности твердой микробной ростовой среды. В некоторых других вариантах воплощения диспергированная популяция патогена содержит клетки патогена, которые смешаны с упомянутой твердой микробной ростовой средой и, тем самым, инкорпорированы в твердую микробную ростовую среду перед застыванием среды.

В определенных вариантах воплощения раскрываемых здесь способов отбора мультитестовая платформа может включать многокамерное устройство, которое содержит одну или более отдельных камер. Каждая из камер способна действовать как резервуар для твердой микробной ростовой среды. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения мультитестовая платформа может содержать либо (a) один или более углублений, каждое углубление способно действовать в качестве резервуара для твердой микробной ростовой среды, содержащей ограниченную популяцию патогена; либо (б) углубление, способное действовать в качестве резервуара для твердой микробной ростовой среды; где углубление разделено на две или более отдельных камер, и один или более встроенных разделяющих элементов конструкции для разделения углубления на отдельные камеры. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения данного аспекта, по меньшей мере, одна из камер или углублений мультитестовой платформы отличается от других камер или углублений путем содержания диспергированной популяции другого патогена. В некоторых других предпочтительных вариантах воплощения ко-культивирование каждого из указанных микробных образцов с указанной диспергированной популяцией патогена производится в отдельных камерах мультитестовой платформы. В еще других предпочтительных вариантах воплощения мультитестовая платформа может быть форматом, отобранным из группы, состоящей из микропланшета, микротитровального планшета, многолуночной пластинки, чашки Петри, лотка, предметного стекла или тестовой пробирки.

В соответствии с определенными вариантами воплощения оценка ответа указанного патогена на каждый их указанных микробных образцов включает определение наличия зоны подавления роста, диаметра зоны подавления роста, выработки химического соединения, изменения в морфологии и/или физиологии патогена или комбинацию любого из этого.

В некоторых других вариантах воплощения выполнение раскрываемых здесь способов может далее включать этап рассортировки каждого из микробных образцов на субпопуляции клеток перед или одновременно с контактированием микробных образцов с диспергированной популяцией патогена. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения этап рассортировки может включать проточную цитометрическую методику клеточной сортировки (FACS).

В еще некоторых других вариантах воплощения раскрываемые здесь способы по изобретению могут далее включать этап определения таксономической классификации микроорганизма. Этап определения таксономической классификации может включать (a) гибридизацию зонда нуклеиновой кислоты с молекулой нуклеиновой кислоты избранного микроорганизма, (б) амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты избранного микроорганизма, (в) иммунодетекцию молекулы избранного микроорганизма, (г) секвенирование молекулы нуклеиновой кислоты, полученной из указанного избранного микроорганизма, или (д) комбинацию двух или более из них.

Также предоставляются в соответствии с другим аспектом настоящего раскрытия изолированные микроорганизмы, которые отбираются способом в соответствии со скрининговыми способами настоящего изобретения, где избранные микроорганизмы обладают антагонистической активностью против патогена.

Эти и другие объекты и характеристики изобретения станут более полно явными из дальнейшего детального описания изобретения и пунктов формулы изобретения.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к высокоэффективным способам скрининга биологических образцов для идентификации микроорганизмов, имеющих ценности в качестве биоконтролирующих агентов. Выполнения раскрываемых здесь способов могут включать использование мультитестовых платформ для быстрой и одновременной идентификации микроорганизмов, имеющих биоконтролирующую активность, включая микроорганизмы, пригодные в улучшении здоровья растений, животных и человека. В частности, настоящее изобретение предоставляет способы скрининга, пригодные для скрининга микроорганизмов для их потенциальных применений в борьбе с болезнями, вызванными патогенами растений. Раскрытие также предоставляет микроорганизмы, имеющие биоконтролирующую активность, которая идентифицируется при помощи раскрываемых здесь скрининговых способов.

Хотя некоторые особенно предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения включают отбор микроорганизмов, имеющих биоконтролирующие способности против распространенных фитопатогенов, следует понимать, что настоящее изобретение также охватывает отбор микроорганизмов, имеющих одну или более из широкого диапазона других биоконтролирующих активностей, включая, но не ограничиваясь, бактерицидной, фунгицидной, гербицидной, инсектицидной, нематоцидной и подобным. Далее подразумевается, что настоящее изобретение охватывает отбор микроорганизма из любых источников.

Все упомянутые в этом описании публикации и заявки на патенты включены в настоящую заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы о каждой индивидуальной публикации или заявке на патент было конкретно и индивидуально указано то, то она включена в настоящую заявку посредством ссылки. Источники информации включают, например, статьи в научных журналах, патентные документы, руководства и браузер-неактивные адреса страниц во Всемирной паутине. Ссылка на такие информационные источники делается исключительно в целях предоставления указания на общее состояние области техники на время подачи заявки. В то время, как на содержания и учения каждого и всех из информационных источников можно полагаться и использовать специалисту в области техники для приготовления и использования вариантов воплощения изобретения, любое обсуждение и комментарии в конкретном источнике информации никоим образом не должны считаться как принятие того, что такой комментарий считается общепринятым в качестве общего мнения в области техники.

Если не было определено иным образом, все термины области техники, изображения условными знаками и другие научные и технические термины или терминология, используемые здесь, предназначены иметь значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которому имеет отношение данное изобретение. Многие из методик и процедур, описываемых здесь, или на которые делается ссылка, хорошо понимаются и широко используются с применением традиционной методологии специалистом в области техники. Следующие термины определяются для целей изобретения, как описано здесь. В некоторых случаях термины с обычно понимаемыми значениями определяются здесь для четкости и/или для справочного материала, и включение здесь таких определений не должно обязательно истолковываться как значительное отличие от того, что обычно понимается в области техники.

Единичные формы (английских) артиклей "a", "an", и "the" включают множественные ссылки, если только контекст ясно указывает на противное. Так, например, ссылка на "a host cell" (клетка хозяина) включает множественное число таких клеток хозяина, и ссылка на "a stress" (стресс) является ссылкой на один или более стрессов и их эквивалентов, известных специалисту в области техники, и так далее.

Антибиотик: Для целей настоящего раскрытия термины «антибиотик», «антимикробный агент» и «антипатогенный агент» используются взаимозаменяемо для ссылки на любое вещество, соединение или композицию, способную ингибировать или отменять рост микроорганизма. Антибиотики могут продуцироваться любым одним или более из следующего: 1) микроорганизмом, 2) синтетическим процессом, или 3) полусинтетическим процессом. Как таковой, антибиотик может быть микроорганизмом, который секретирует летучее органическое соединение. Более того, антибиотик может быть летучим органическим соединением, секретируемым микроорганизмом.

В данном контексте термины «антагонистические микроорганизмы» и «микробные антагонисты» используются взаимозаменяемо для ссылки на микроорганизмы, которые действуют для предотвращения, подавления, лечения или контроля развития патогена или патогенного заболевания в растении, животном или человеке. Например, антагонистический микроорганизм может действовать, чтобы предотвратить, подавить, лечить или контролировать предуборочное или послеуборочное заболевание в растениях, включая их плоды и другие, собираемые в качестве урожая, части. Как раскрывается более детально здесь в ином месте, антагонистическая активность микроорганизмов по отношению к патогенам может быть достигнута разнообразными механизмами. Например, антагонистический микроорганизм может ингибировать развитие контролируемого субъекта путем продукции и выделения определенных биоактивных материалов, например, антибиотиков, которые обладают избирательной токсичностью и/или деструктивным действием против контролируемого субъекта путем предоставления угнетающего или конкурентного механизма. Как таковые, антагонистические(й) микроорганизм(ы), как подразумевается, охватывают археи, бактерии, микроскопические водоросли, грибки (включая плесень и виды дрожжей), микоплазмы, микроспоровые, нанобактерии, оомицеты и простейшие. В некоторые случаях антагонистический(е) микроорганизм(ы) могут быть антагонистическими по отношению к, например, патогену растений, который сам по себе может являться бактерией, грибком или другим типом микроорганизмов.

Бактерицидный: Термин «бактерицидный» в данном контексте относится к способности композиции или вещества повышать смертность или ингибировать скорость роста бактерий.

Биологический контроль: термин «биологические контроль» и его сокращенная форма «биоконтроль» в данном контексте определяется как контроль патогена, такого, как, например, грибок, насекомое или любой другой нежелательный организм путем использования другого организма или его производного. В большинстве случаев биологический контроль является ингибированием роста, инфекции или репродукции одного организма с использованием другого организма. Примером известного механизма использования биологического контроля является использование микроорганизмов, контролирующих корневую гниль, путем конкурирования грибка за пространство на поверхности корня, или микроорганизмов, которые либо ингибируют рост, либо убивают патоген. «Растение-хозяин» в контексте биологического контроля является растением, восприимчивым к болезни, вызываемой патогеном. В контексте изолирования микроорганизма, такого, как виды грибков, из их природной среды «растение-хозяин» - это растение, которое поддерживает рост грибка, например, растение того рода, для которого грибок является эндофитом.

Хромогенное соединение: В данном контексте термины «хромогенное соединение» и «хромогенный субстрат» относятся к любому соединению, пригодному для использования в системах детекции, из-за их характеристик абсорбировать или эмитировать свет. Термин подразумевает охват любых продуктов ферментного расщепления, как растворимых, так и нерастворимых, которые могут определяться как визуально, так и с помощью оптического оборудования. Под обозначение «хромогенные» включены все ферментные субстраты, которые продуцируют конечный продукт, который может определяться по изменению цвета. Это включает, но не ограничивается, любым цветом, как используется в традиционном смысле «цветов», таких, как индиго, синий, красный, желтый, зеленый, оранжевый, коричневый, и т.п., наряду с флуорохромными или флуорогенными соединениями, которые испускают цвета, определяемые флуоресценцией, (например, желто-зеленый у флуоресцеина или красный у родамина, и т.п.). Подразумевается, что такие другие индикаторы, как красящие (например, pH) и люминогенные соединения охватываются данным определением.

Композиция: «Композиция» предназначена обозначать комбинацию активного агента и другого соединения, носителя или композиции, инертной (например, определяемый агент или ярлык или жидкий носитель) или активной, такой, как пестицид.

Культура, изолированная культура, биологически чистая культура и обогащенная культура. В данном контексте изолированный штамм микроба - это штамм, который был удален из своей природной среды. «Чистые культуры» или «изолированные культуры» - это культуры, в которых присутствуют микроорганизмы только одного штамма определенного рода или вида. Это отличается от «смешанных культур», в которых присутствуют культуры более одного рода и/или вида микроорганизма. В некоторых вариантах воплощения микроорганизмы и культуры не являются генно-инженерными продуктами, в то время, как в других вариантах воплощения микроорганизмы и культуры являются генно-инженерными продуктами.

Как таковой, термин «изолированный» не обязательно отражает уровень, до которого микроб был очищен. «В значительной степени чистая культура» штамма микроба относится к культуре, которая в значительной степени не содержит другие микробы, отличные от желательного штамма или штаммов микробов. Другими словами, в значительной степени чистая культура штамма микроба в значительной степени свободна от других контаминантов, которые могут включать микробные контаминанты, наряду с нежелательными химическими контаминантами. Далее в данном контексте «биологически чистый» штамм предназначен означать штамм, отделенный от материалов, с которыми он обычно связан в природе. Обратите внимание, что штамм, ассоциированный с другими штаммами, или с соединениями и материалами, с которыми он обычно не находится в природе, все еще определяется как «биологически чистый». Монокультура определенного штамма, конечно, «биологически чистая». В данном контексте термин «обогащенная культура» изолированного микробного штамма относится к микробной культуре, которая содержит более, чем 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% изолированного штамма.

Культивирование: Термин «культивирование» в данном контексте относится к воспроизведению организмов на или в средах различных видов.

Эффективное количество: «Эффективное количество» в данном контексте - это количество, достаточное для вызывания полезных или желательных результатов. Эффективное количество может быть введено в одном или более введений. В терминах лечения ингибирования или защиты эффективное количество - это количество, достаточное, чтобы улучшить, стабилизировать, обратить, замедлить или отложить прогрессирование таргетных инфекционных или болезненных состояний.

Фунгицидный: В данном контексте «фунгицидный» относится к способности композиции или вещества снижать скорость роста грибков или увеличивать смертность грибков.

«Высокоэффективный» (ВЭ), как в высокоэффективном скрининге (ВЭС), относится к процессу, разработанному с целью выполнения большого количества анализов, включая анализ(ы) на большом количестве клеток, предпочтительно, автоматизированным или полу-автоматизированным способом. Насколько большое это количество - это будет зависеть от контекста конкретного анализа, однако для примера по скринингу генетических отличий желательно исследовать миллион клеток. В других контекстах ВЭС может считаться, по меньшей мере, как сотни и тысячи анализов или скринингов за день, однако также скрининг значительно более низких количеств клеток все еще считается высокоэффективным в контексте данного изобретения. Термин «высокоэффективный» также охватывает «ультра высокоэффективный» (УВЭ). «Многопараметрический» (МП) относится к вариации ВЭС, в которой количество и качество информации является высшим приоритетом, иногда за счет пропускной способности, однако все еще имеющей дело с большим количеством анализов. Термин «высокоэффективный» в контексте данного изобретения также охватывает много параметров, и, таким образом, ВЭС также относится к «многопараметрическому скринингу» (МПС).

Микробный образец: Термин «микробный образец» в настоящем описании и пунктах формулы изобретения используется в самом широком смысле. Он означает включение как биологических образцов, так и образцов окружающей среды, содержащих микробы, и образцы, приготовленные из них. Образцы окружающей среды включают материалы, происходящие из, например, опасных отходов, материала поверхности, почвы, воды, ила, сточных вод и промышленных образцов, наряду с материалами, полученными при переработке пищевых и молочных продуктов, аппаратуры, оборудования, одноразовых и неодноразовых предметов. Биологические образцы могут происходить из растений, человека или животного, включая грибки, людей, жидкость или ткань, пищевые продукты и ингредиенты, такие, как молочные продукты, овощи, мясо и мясные субпродукты, клеточные культуры, организмы и отходы. Однако не подразумевается, что тип образца, применимый в данном изобретении, будет ограниченным.

Являясь биологическим или происходящим из окружающей среды, микробный образец, предположительно содержащий антагонистические микроорганизмы, может быть или может не быть вначале подвергнут воздействию способов обогащения для создания «изолированной культуры», «биологически чистой культуры», «обогащенной культуры» микроорганизмов. Под «способами обогащения» или «обогатительной обработкой» настоящее изобретение рассматривает (i) традиционные методики для изолирования конкретного исследуемого микроорганизма от других микроорганизмов методами жидкой, твердой, полужидкой или любой другой культуральной среды и/или методики, и (ii) новые методики для изолирования конкретных микроорганизмов от других микроорганизмов. Не подразумевается, что настоящее изобретение будет ограничено только один этапом обогащения или типом методов обогащения. Например, в рамках настоящего изобретения находится то, что, после того, как образец подвергнут традиционным методам обогащения, получаемый в результате препарат подвергается дальнейшей очистке так, что в итоге получаются чистые или в значительной степени чистые культуры штамма изучаемого вида. Эта чистая культура затем может анализироваться при помощи настоящего изобретения.

Микроорганизм: В данном контексте термин «микроорганизм» используется для ссылки на любой вид или тип микроорганизма, включая, но не ограничиваясь, археями, бактериями, микроскопическими водорослями, грибками (включая плесень и виды дрожжей), микоплазмами, микроспоровыми, нанобактериями, оомицетами и простейшими. Как таковой, термин охватывает отдельные клетки (например, одноклеточные микроорганизмы) или множество клеток (например, многоклеточные микроорганизмы). «Популяция микроорганизмов» таким образом может относиться к множеству клеток единичного микроорганизма или к множеству клеток двух или более различных микроорганизмов, например, смеси грибковых клеток и бактериальных клеток.

Микробная ростовая среда: В данном контексте термины «микробная ростовая среда» и «культуральная среда» и «среда» относятся к любому субстрату для роста и репродукции микроорганизмов. «Среда» может использоваться в ссылке на твердую среду в чашке, которая поддерживает рост микроорганизмов. Также определением охватываются полужидкие и жидкие ростовые системы, включая те, которые инкорпорируют живые организмы хозяина, наряду с любым типом ростовой среды. Выражение «твердая микробная ростовая среда» или «полужидкая микробная ростовая среда» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к ростовой среде, которая позволяет микроорганизмам образовывать колонии на своей поверхности, такой, как среда вида геля или в форме геля, гель при этом является коллоидной системой, в которой пористая сеть взаимосвязанных частиц охватывает объем жидкой среды. Далее понимается, что гель в большинстве своем жидкий по составу и тем самым демонстрирует плотности, схожие с плотностями определенной жидкости, однако имеет структурное сцепление твердого вещества. Предпочтительно, твердая или полужидкая микробная ростовая среда в данном контексте готовится путем добавления к жидкой микробной ростовой среде достаточного количества вещества, которое при нагревании плавится и отвердевает тогда, когда вновь охлаждается, такого, как желатин или агар. Следует понимать, что пористая сеть взаимосвязанных частиц в среде будет позволять питательным веществам и антимикробным агентам диффундировать через среду и становиться доступными для микроорганизмов.

Микротитровальный планшет: В данном контексте термин «микротитровальный планшет» относится к пластинке с лунками либо резервуарами различных дизайнов, используемой в биологическом и химическом анализе. Он предназначен означать субстрат, имеющий один или множество дискретных камер, подходящих для содержания жидкости. Примерный микротитровальный планшет включает, например, «микропланшеты» «многолуночные планшеты» либо «n-луночные планшеты», где «n» является количеством лунок, включая, например, 8-, 12-, 16-, 24-, 96-, 384- или 1536-лунок. Микротитровальный планшет может иметь лунки с любой из форм поперечного сечения, включая, например, цилиндрические, квадратные, прямоугольные, многогранные, смыкающиеся формы, где дно лунок плоское, коническое, заостренное или круглое. Термины «микротитровальный планшет» призваны охватить стандартные микротитровальные планшеты и микропланшеты, обычно используемые в области техники и коммерчески доступные из множества источников научного снабжения, включая Corning (Corning, NY), BD Bioscience (Bedford, MA), Greiner Bio-One (Monroe, NC). Однако не подразумевается, что настоящее изобретение должно быть ограничено определенным типом формата. Например, в настоящем изобретении пригодны планшеты с 384, 96, 48, 24 и 12 лунками, однако могут использоваться планшеты с другими количествами лунок. Форма лунок не ограничена круглой или в значительной степени круглой лункой. Например, в настоящем изобретении могут использоваться преимущественно квадратные лунки, наряду с лунками, которые преимущественно прямоугольные, треугольные, овальные или неправильной формы. Сама форма самого микротитровального планшета также не ограничена любой конкретной формой, хотя он обычно в значительной степени плоский и, в общем, может быть прямоугольным или квадратным.

Мультиплексная и мультитестовая платформа: В данном контексте термин «мультитестовая платформа» подразумевает охватывать любые удобные способы содержания одной или более реакционных смесей, суспензий, или микробных ростовых сред. Как таковые, результаты ряда скрининговых событий могут быть собраны на одной поверхности, приводящей в результате к «мультитестовой платформе», имеющей или состоящей из множества элементов или частей, чтобы работать в более чем одном эксперименте. Подразумевается, что термин «мультитестовая платформа» охватывает микротитровальные планшеты, многолуночные планшеты, микрокарты, тестовые пробирки, чашки Петри, чашки Петри с внутренними разделителями для разделения пространства в чашке на две или более отдельных камер, каждая камера пригодная для содержания отдельной микробной ростовой среды. Термин «мультиплексный» в данном контексте подразумевает означать одновременное и отдельное проведение множества анализов на одной или более мультитестовых платформ. Мультиплексирование далее может включать одновременное проведение множества скрининговых событий в каждом из множества отдельных образцов. Например, количество анализируемых образцов может быть основ