Не являющиеся человеком животные с модифицированными последовательностями тяжелых цепей иммуноглобулинов

Не являющиеся человеком животные с модифицированными последовательностями тяжелых цепей иммуноглобулинов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

С ПЕРЕКРЕСТНЫМИ ССЫЛКАМИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №61/766765, поданной 20 февраля 2013 г., и предварительной заявке на патент США №61/879338, поданной 18 сентября 2013 г., которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Перечень последовательностей в виде текстового файла (озаглавленного «1270WO_SL.txt», созданный 20 февраля 2014 г. и имеющий размер 87000 байт, полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, например, грызуны, такие как мыши и крысы, у которых имеется нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека (т.е. реаранжированная последовательность VDJ тяжелой цепи), функционально связанная с нуклеотидной последовательностью константной области. Согласно некоторым вариантам реализации указанные животные генетически сконструированы таким образом, что у них имеется иммуноглобулиновый локус, содержащий нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи (последовательность VDJ), функционально связанную с последовательностью гена константной области иммуноглобулина, при этом последовательность VDJ представляет собой последовательность VDJ человека, а последовательность гена константной области является человеческой или имеет нечеловеческое происхождение. Согласно некоторым вариантам реализации указанные не являющиеся человеком животные, у которых имеется генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус, содержат: (1) первую нуклеотидную последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи (т.е. первая нуклеотидная последовательность представляет собой реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека), при этом указанная первая нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностью гена константной области легкой цепи (например, легкой цепи κ или λ); и (2) вторую нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи человеческого происхождения или нечеловеческого происхождения (например, легкой цепи κ или λ) (т.е. вторая нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека), при этом указанная вторая нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностью гена константной области тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации указанные не являющиеся человеком животные содержат генетически модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, при этом указанный реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность сегмента V гена тяжелой цепи (V_H), функционально связанную через спейсер с последовательностью сегмента J гена тяжелой цепи (J_H), и при этом указанный спейсер содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток. Предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, например, грызуны, такие как мыши и крысы, в геноме которых содержатся: (i) нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью константной области; и (ii) локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или большее количество, но меньшее, чем у дикого типа, сегментов гена вариабельной области легкой цепи человека. Предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, в геноме которых содержатся: (i) нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью константной области; и (ii) локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере один из сегментов гена вариабельной области кодирует один или большее количество остатков гистидина, не кодируемых соответствующим сегментом гена вариабельной области легкой цепи зародышевой линии человека. Предложены способы получения описанных в настоящем документе генетически модифицированных не являющихся человеком животных. Предложены способы получения последовательностей вариабельной области легких цепей иммуноглобулина (например, легкой цепи κ или λ), которые способны связывать антиген в отсутствие тяжелой цепи, и/или могут быть связаны с реаранжированным вариабельным доменом тяжелой цепи, и/или проявляют рН-зависимые антигенсвязывающие свойства, подходящие для получения биспецифических антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Биспецифические антитела представляют собой многофункциональные антитела, содержащие антигенсвязывающие сайты, которые могут связывать две отдельные антигенные детерминанты, возникшие в качестве одного из основных биологических терапевтических средств для лечения многих заболеваний, в том числе раковых. Несмотря на то, что за последнее время были разработаны разнообразные биспецифические антитела с двойными антигенсвязывающими свойствами, специфичностью и аффинностью вариабельных доменов легких цепей или тяжелых цепей иммуноглобулина в обычных биспецифических антителах приходится в определенной степени жертвовать, поскольку в обычных биспецифических антителах в связывание с каждой антигенной детерминантой вносит вклад вариабельный домен либо только тяжелой цепи, либо только легкой цепи, тогда как в случае обычных антител в связывании одной и той же антигенной детерминанты могут участвовать вариабельные области как легких, так и тяжелых цепей. Кроме того, для достижения требуемого уровня эффективности терапевтических антител, например, биспецифических терапевтических антител, часто требуются высокие или множественные дозы антител ввиду их ограниченной циркуляцией in vivo.

[0005] Большинство разработанных на сегодняшний день антигенсвязывающих белков, нацеленных на два антигена или эпитопа, содержат два антигенсвязывающих фрагмента: (i) первый антигенсвязывающий фрагмент, содержащий пару вариабельный домен тяжелой цепи-вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, участвующую в связывании с первым антигеном или эпитопом; и (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вторую пару вариабельный домен тяжелой цепи-вариабельный домен легкой цепи, участвующую в связывании со вторым антигеном или эпитопом. Указанные антигенсвязывающие белки, несмотря на то, что они являются биспецифическими в контексте полного антигенсвязывающего белка, не обязательно являются биспецифическими в каждом антигенсвязывающем фрагменте, что ограничивает применение указанных антигенсвязывающих белков в мультиспецифическом формате, например, триспецифических антигенсвязывающих белков. Согласно настоящему описанию не являющееся человеком животное, у которого экспрессируется универсальный вариабельный домен тяжелой цепи, может быть использовано в качестве общего инструмента для получения антигенсвязывающих белков для применения в антигенсвязывающих белках разнообразных форматов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В данной области техники существует потребность в получении последовательностей вариабельных доменов легких цепей иммуноглобулинов, отличающихся тем, что специфичность и аффинность в отношении антигена происходит полностью или в основном, и/или основана полностью или в основном на разнообразии вариабельных доменов легких цепей иммуноглобулинов. Такие последовательности были бы чрезвычайно полезны при разработке антигенсвязывающих белков, например, биспецифических антител, в которых каждый вариабельный домен по отдельности отвечает за специфическое связывание отдельного антигена. Различные аспекты и варианты реализации, описанные в настоящем документе, основаны отчасти на неожиданном открытии того, что генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, у которых имеются вариабельные домены тяжелых цепей иммуноглобулинов, кодируемые последовательностью гена реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи (например, реаранжированной последовательностью VDJ тяжелой цепи), могут удовлетворять указанную потребность. У не являющихся человеком животных, кодирующих реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (т.е. универсальный вариабельный домен тяжелой цепи) механизмы обеспечения разнообразия антител основаны в основном на нереаранжированных (т.е. диверсифицируемых) вариабельных доменах легких цепей антител. Не являющиеся человеком животные включают, например, млекопитающих и, согласно конкретным вариантам реализации, грызунов (например, мышей, крыс или хомяков).

[0007] Предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, которые при стимуляции представляющим интерес антигеном продуцируют антитела, обладающие антигенсвязывающей специфичностью, основанной полностью или в основном на вариабельных доменах легких цепей антител. Могут быть идентифицированы аминокислоты вариабельных доменов легких цепей антител и соответствующие нуклеотидные последовательности антител, продуцируемых такими генетически модифицированными животными, и указанные последовательности могут использоваться в рекомбинантных антителах или других антигенсвязывающих белках для разработки вариабельных доменов легких цепей, связывающих антигенную детерминанту независимо (и при этом с достаточной специфичностью и аффинностью) от вариабельных доменов тяжелых цепей. Кроме того, полезные свойства генетически модифицированных животных с реаранжированным вариабельным доменом тяжелой цепи (т.е. содержащих последовательность гена реаранжированного вариабельного домена тяжелой цепи) могут применяться путем введения нуклеотидной последовательности, кодирующей реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи в разнообразные геномные контексты, например, в различные иммуноглобулиновые локусы. Последовательности генов реаранжированных вариабельных доменов тяжелых цепей могут быть нацелены в локус тяжелой цепи или локус легкой цепи таким образом, что реаранжированные последовательности вариабельных доменов тяжелых цепей могут быть функционально связаны с последовательностью константной области тяжелой или легкой цепи, человеческого происхождения или нечеловеческого происхождения. Последовательности генов реаранжированных вариабельных доменов тяжелых цепей могут быть размещены в любом месте генома, при этом они функционально связаны человеческими, имеющими нечеловеческое происхождение или смешанными человеческими/имеющими нечеловеческое происхождение последовательностями константных областей иммуноглобулинов. Кроме того, не являющиеся человеком животные, у которых имеется нуклеотидная последовательность, кодирующая реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи могут быть скомбинированы с дополнительными генетическими модификациями иммуноглобулиновых локусов (например, могут скрещиваться с животными, у которых имеется дополнительные генетические модификации иммуноглобулиновых локусов). Например, направленное разнообразие, обеспечиваемое реаранжированной последовательностью гена вариабельного домена тяжелой цепи, нацеленного на локус легкой цепи, может сочетаться с последовательностью гена вариабельного домена легкой цепи, встроенного в локус тяжелой цепи, с получением таким образом животных, у которых в полной мере используются временные характеристики и разнообразие выбранного геномного контекста (например, механизмы, обеспечивающие разнообразие локуса тяжелой цепи) для увеличения разнообразия последовательности выбранного гена вариабельной области антитела (например, последовательностей гена вариабельной области легкой цепи антитела). Кроме того, за счет использования мышей, имеющих ограниченный (лимитированный) репертуар сегментов гена вариабельной области легкой цепи (например, ограниченное число последовательностей гена вариабельной области легкой цепи, которые содержат один или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена V_L человека в комбинации с единственной реаранжированной последовательностью тяжелой цепи, описанной выше), можно получить вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, способный более эффективно сочетаться с вариабельным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0008] Соответственно, предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные (например, грызуны такие как мыши, крысы или хомяки), у которых имеется иммуноглобулиновый локус, содержащий реаранжированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека (т.е. нуклеотидную последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи; т.е. реаранжированная последовательность VDJ тяжелой цепи).

[0009] Согласно различным аспектам единственная геномная нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, экспрессируемые генетически модифицированными не являющимися человеком животными, представлена реаранжированный вариабельным доменом тяжелой цепи. Соответственно, разнообразие вариабельных доменов тяжелых цепей антител, продуцированных генетически модифицированными не являющимися человеком животными, крайне ограничено.

[00010] Согласно некоторым вариантам реализации предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, в геноме которых имеется иммуноглобулиновый локус, который был генетически модифицирован таким образом, что последовательности его вариабельных областей состоят по существу из единственной реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека. Понятно, что разные клетки таких генетически модифицированных не являющихся человеком животных не обязательно всегда содержат полностью идентичные последовательности в указанной единственной реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека (например, за счет ошибок репликации, соматических гипермутаций или других механизмов), но в любом случае у таких генетически модифицированных не являющихся человеком животных наблюдается резкое ограничение разнообразия вариабельных доменов тяжелых цепей антител по сравнению с животными, у которых имеются нереаранжированные вариабельные последовательности тяжелых цепей, и/или животными, в геномах которых содержится несколько сегментов гена вариабельной области тяжелых цепей (например, несколько сегментов V, D и/или J, в частности, нереаранжированных).

[00011] Согласно различным аспектам предложен генетически модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (т.е. содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи). Согласно различным аспектам нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека и реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи, который она кодирует, происходят из сегмента V, D и J гена человека. Согласно различным аспектам нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека и реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи, который она кодирует, происходят из гена V_H человека и сегмента J_H человека. Согласно различным аспектам нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой. цепи иммуноглобулина человека функционально связана с последовательностью гена константной области тяжелой цепи. Согласно различным аспектам нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека функционально связана с последовательностью гена константной области легкой цепи. Согласно различным аспектам генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус присутствует в зародышевой линии не являющегося человеком животного. Согласно различным аспектам у указанных генетически модифицированных не являющихся человеком животных имеется полный набор сегментов гена нереаранжированной вариабельной области легкой цепи, способных к реаранжировке с образованием гена легкой цепи, функционально связанного с последовательностью гена константной области легкой цепи. Согласно другим аспектам у указанных генетически модифицированных не являющихся человеком животных имеется совокупность, но не полный набор (т.е. меньшее количество, чем у животных дикого типа) сегментов гена нереаранжированной вариабельной области легкой цепи. Согласно различным аспектам сегменты гена неаранжированной вариабельной области легкой цепи функционально связаны с последовательностью гена константной области тяжелой цепи. Согласно конкретным вариантам реализации указанное не являющееся человеком животное представляет собой грызуна, например, мышь, крысу или хомяка. Согласно другому аспекту предложена содержащая нуклеиновые кислоты конструкция, содержащая реаранжированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека (т.е. содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи; т.е. предварительно реаранжированную последовательность VDJ тяжелой цепи) согласно описанию в настоящем документе.

[00012] В настоящем документы описаны разнообразные варианты генетически модифицированных не являющихся человеком животных, у которых имеется иммуноглобулиновый локус, содержащий нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (т.е. иммуноглобулиновый локус, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи). Каждый вариант способен обеспечивать механизмы разнообразия антител за счет нуклеотидных последовательностей вариабельных областей легких цепей иммуноглобулина.

[00013] Согласно различным аспектам нуклеотидная последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи (т.е. вариабельный домен тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека), функционально связана с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение последовательностью гена константной области тяжелой цепи (например, последовательность гена константной области тяжелой цепи, которая кодирует изотип иммуноглобулина, выбранный из IgM, IgD, IgA, IgE, IgG и их комбинаций). Например, предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, у которых имеются иммуноглобулиновые локусы, в которых: (а) первая нуклеотидная последовательность кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи (т.е. первая нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека), при этом указанная первая нуклеотидная последовательность функционально связана с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение последовательностью (или комбинированной последовательностью человека/не человека) гена константной области тяжелой цепи; и (b) вторая нуклеотидная последовательность кодирует вариабельный домен легкой цепи (т.е. вторая нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность нереаранжированной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека), при этом указанная вторая нуклеотидная последовательность функционально связана с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение последовательностью гена константной области легкой цепи.

[00014] Согласно другому аспекту предложены модифицированные не являющиеся человеком животные, отличающиеся тем, что у них имеется реаранжированная нуклеотидная последовательность, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи, при этом указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи (V_H), функционально связанную через спейсер с последовательностью сегмента J тяжелой цепи (J_H), причем указанный спейсер кодирует по меньшей мере один аминокислотный остаток.

[00015] Согласно другому аспекту предложено не являющееся человеком животное, у которого имеется генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус, который содержит нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (т.е. имеется нуклеотидная последовательность, кодирующая реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи; т.е. реаранжированную последовательность VDJ тяжелой цепи), при этом указанный генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус присутствует в зародышевой линии не являющегося человеком животного. Согласно некоторым вариантам реализации указанный генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации указанный генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус представляет собой локус легкой цепи

[00016] Согласно другому аспекту предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные (например, грызуны, такие как мыши, крысы или хомяки), у которых имеется генетически модифицированный иммуноглобулиновый геномный локус с нуклеотидной последовательностью реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение последовательностью гена константной области легкой цепи (например, легкой цепи κ или λ).

[00017] Согласно другому аспекту предложено не являющееся человеком животное, у которого имеется генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус, содержащий: (а) нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанную с последовательностью гена константной области легкой цепи; и (b) нереаранжированную человеческую или имеющую нечеловеческое происхождение нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (например, легкой цепи κ или λ), функционально связанную с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение последовательностью гена константной области тяжелой цепи (например, последовательностью гена константной области тяжелой цепи, которая кодирует изотип иммуноглобулина, выбранный из IgM, IgD, IgA, IgE, IgG и их комбинации).

[00018] Согласно другому аспекту предложено генетически модифицированное не являющееся человеком животное с иммуноглобулиновым локусом, содержащим:

(а) первый аллель, содержащий:

(i) первую нуклеотидную последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи (т.е. первая нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека), функционально связанную с последовательностью гена константной области тяжелой цепи, и

(ii) вторую нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи (т.е. вторая нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность нереаранжированной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека), функционально связанную с последовательностью гена константной области легкой цепи; и

(b) второй аллель, содержащий

(i) третью нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи (т.е. третья нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность нереаранжированной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека), функционально связанную с последовательностью гена константной области тяжелой цепи, и

(ii) четвертую нуклеотидную последовательность, которая кодирует реаранжированный вариабельный домен тяжелой цепи (т.е. четвертая нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека), функционально связанную с последовательностью гена константной области легкой цепи.

[00019] Согласно различным аспектам предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные с локусами или последовательностями гена неаранжированной вариабельной области тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации у указанных генетически модифицированных не являющихся человеком животных имеется соответствующее дикому типу число сегментов (т.е. все или по существу все сегменты) гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (т.е. последовательностей). Согласно другим аспектам у не являющихся человеком животных, описанных в настоящем документе, имеется ограниченный набор сегментов гена вариабельной области легкой цепи, например, (i) один, два или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена V_L человека; и (ii) один или большее количество сегментов гена J_L человека, функционально связанных с имеющей нечеловеческое происхождение нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи и/или сегменты легких цепей могут содержаться, например, в трансгене или в эндогенном иммуноглобулиновом локусе.

[00020] Согласно различным аспектам предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, отличающиеся тем, что все вариабельные домены тяжелых цепей иммуноглобулина у указанного животного происходят из одной и той же последовательности гена реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи, и тем, что указанные вариабельные домены экспрессируются совместно с вариабельным доменом легкой цепи, происходящим из одного из по меньшей мере одного, двух, трех или большего количества сегментов гена V_L и по меньшей мере одного, двух, трех или большего количества сегментов гена J_L. Дополнительно предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные (например, грызуны, такие как мыши и крысы), в геноме которых содержатся: (i) локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит нуклеотидную последовательности реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека, функционально связанную с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи; и (ii) локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (например, два сегмента гена V_κ человека и один или большее количество сегментов гена J_κ человека), функционально связанных с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации указанная константная область легкой цепи представляет собой константную область крысы или мыши, например, константную область Сκ крысы или мыши.

[00021] Согласно другому аспекту генетически модифицированные не являющиеся человеком животные согласно описанию в настоящем документе при стимуляции представляющим интерес антигеном экспрессируют антигенсвязывающий белок, содержащий последовательность аминокислот тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, при этом указанная последовательность аминокислот тяжелой цепи получена из генетически модифицированного локуса тяжелой цепи, содержащего нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи. Согласно определенным аспектам последовательность аминокислот легкой цепи получена из генетически модифицированного локуса легкой цепи иммуноглобулина, содержащего один или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена V_L человека и (ii) два или большее количество сегментов гена J_L человека, функционально связанных с имеющей нечеловеческое происхождение нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи.

[00022] Предложены генетически модифицированные не являющиеся человеком животные, в геноме которых имеется нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которая содержит последовательность сегмента V гена тяжелой цепи (V_H), функционально связанную через спейсер с последовательностью сегмента J гена тяжелой цепи (J_H), причем указанный спейсер кодирует по меньшей мере одну аминокислоту (например, 2 аминокислоты, 3 аминокислоты или 4 аминокислоты), и/или модифицированный сегмент D гена. Согласно различным вариантам реализации нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи функционально связана с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи. Согласно различным вариантам реализации в геномах указанных не являющихся человеком животных дополнительно содержится генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, например, два сегмента гена V_κ человека и один или большее количество сегментов гена J_κ человека, функционально связанных с человеческой или имеющей нечеловеческое происхождение нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи.

[00023] Также предложены способы получения и применения генетически модифицированных не являющихся человеком животных, описанных в настоящем документе. Предложены способы обеспечения функциональной связи нуклеотидной последовательности реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина в геноме не являющегося человеком животного.

[00024] Согласно другому аспекту предложены способы получения последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V_L), способных к связыванию антигена независимо от последовательности аминокислот вариабельной области тяжелой цепи.

[00025] Согласно другому аспекту предложен генетически модифицированный иммуноглобулиновый локус, который может быть получен с помощью любого из способов согласно описанию в настоящем документе.

[00026] Согласно различным аспектам предложены антигенсвязывающие белки (например, антитела), продуцированные генетически модифицированными не являющимися человеком животными или происходящие из генетически модифицированных не являющихся человеком животных, описанных в настоящем документе. Также предложены способы получения антигенсвязывающих белков, в том числе мультиспецифических (например, биспецифических или триспецифических) антигенсвязывающих белков. Также предложены способы получения эффекторных вариабельных доменов легкой цепи иммуноглобулина.

[00027] Согласно другому аспекту предложены плюрипотентная клетка, индуцированные плюрипотентные или тотипотентные стволовые клетки, происходящие из не являющегося человеком животного, у которого имеются различные геномные модификации согласно настоящему описанию. Также предложены клетки, имеющие ядро, содержащее генетическую модификацию согласно описанию в настоящем документе, например, модификацию, введенную в клетку посредством пронуклеарной инъекции.

[00028] Согласно различным аспектам предложен эмбрион не являющегося человеком животного, содержащий клетку, геном которой содержит локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий нуклеотидную последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области. Согласно определенным аспектам указанный эмбрион не являющегося человеком животного также содержит локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий два или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи.

[00029] Также предложены способы получения нуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V_L), способную к связыванию антигена или его эпитопа независимо от вариабельного домена тяжелой цепи, включающие: (а) иммунизацию не являющегося человеком животного представляющим интерес антигеном или его иммуногеном, при этом в геноме указанного не являющегося человеком животного содержатся: (i) нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью тяжелой цепи константной области, и (ii) нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи; (b) обеспечение возможности развития иммунного ответа у указанного не являющегося человеком животного; (с) выделение из указанного иммунизированного не являющегося человеком животного клетки, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи, способный связывать антиген; и (d) получение из указанной клетки нуклеотидной последовательности, которая кодирует указанный вариабельный домен легкой цепи (домен V_L), способный связывать антиген. Согласно различным вариантам реализации указанная клетка представляет собой лимфоцит, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, естественные киллерные клетки, Т-клетки и В-клетки. Согласно различным вариантам реализации указанный способ дополнительно включает (с)' слияния указанного лимфоцита с раковыми клетками, например, клеткой миеломы.

[00030] Также предложены способы получения нуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V_L), способную к связыванию антигена или его эпитопа независимо от вариабельного домена тяжелой цепи, включающие: (а) иммунизацию не являющегося человеком животного представляющим интерес антигеном или его иммуногеном, при этом в геноме указанного не являющегося человеком животного содержатся: (i) нуклеотидная последовательность реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью тяжелой цепи константной области, и (ii) два или более, но меньше, чем у дикого типа, сегментов гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (V_L и J_L), функционально связанных с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи; (с) выделение из указанного иммунизированного не являющегося человеком животного клетки, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи, способный связывать антиген; и (d) получение из указанной клетки нуклеотидной последовательности, которая кодирует указанный вариабельный домен легкой цепи (V_L домен), способный связывать антиген. Согласно различным вариантам реализации указа