Стабильное при хранении жидкое средство для мытья посуды, содержащее протеазу и амилазу

Стабильное при хранении жидкое средство для мытья посуды, содержащее протеазу и амилазу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к жидким средствам для мытья посуды. Изобретение относится, в частности, к содержащим ферменты жидким средствам для мытья посуды, которые содержат определенные протеазы в комбинации с амилазой, а также к способу применения указанных средств. Кроме того, изобретение относится к применению определенных протеаз в жидких средствах для мытья посуды, содержащих амилазу.

В средствах для мытья посуды предпочтительно используют протеазы типа субтилизина. Известные протеазы, которые согласно уровню техники используют в средствах для мытья посуды, характеризуются изначальным происхождением из микроорганизмов, например, видов Bacillus, Streptomyces, Humicola, Thermomyces или Pseudomonas, и/или их производят известными биотехнологическими методами посредством пригодных микроорганизмов, например, хозяев трансгенной экспрессии видов Bacillus или нитевидных грибков.

Современные средства для мытья посуды все чаще содержат другие ферменты, прежде всего амилазы. Амилаза является ферментом, который катализирует гидролиз гликозидных связей, в частности, содержащихся в полисахаридах, например, крахмале. В качестве амилаз в средствах для мытья посуды часто используют α-амилазы, которые гидролизуют α(1-4)-гликозидные связи амилозы. В соответствии с цифровой системой классификации ферментов Комиссией по ферментам (ЕС) α-амилазы характеризуются ЕС-номером 3.2.1.1, а, следовательно, относятся к третьему из шести основных классов ферментов, а именно к гидролазам (Е.С.3. -. -. -), далее, в рамках гидролаз, к гликозилазам (Е.С.3.2. -. -) и далее, в рамках гликозилаз, к гликозидазам (Е.С.3.2.1. -), то есть ферментам, гидролизующим О-гликозильные и/или S-гликозильные соединения. При деструкции крахмала посредством α-амилаз образуются декстрины, а из них мальтоза, глюкоза и разветвленные олигосахариды. Следовательно, амилазы во время мытья воздействуют прежде всего на содержащие крахмал остатки, катализируя их гидролиз.

В международных заявках WO 95/23221 и WO 92/21760 описаны варианты щелочной протеазы из Bacillus lentus DSM 5483 (DSM - Немецкий банк микроорганизмов), пригодные для использования в моющих или чистящих средствах, включая средства для мытья посуды, а также моющие и чистящие средства, которые содержат подобные протеазы. Наряду с этим в международной заявке WO 2011/032988 описаны моющие и чистящие средства, которые содержат также варианты щелочной протеазы из Bacillus lentus DSM 5483. Описанные в цитированных выше публикациях варианты протеазы помимо других положений могут быть изменены в положениях 3, 4, 193 и 199 согласно нумерации щелочной протеазы из Bacillus lentus DSM 5483, причем в указанных положениях в них могут находиться, например, аминокислоты 3Т, 4I, 193М или 199I. В указанных публикациях сообщается также, что моющие средства могут содержать другие ферменты, в том числе амилазу. Моющие средства могут быть твердыми или жидкими. Однако из цитированных публикаций не может быть сделан непосредственный и однозначный вывод о присутствии в жидком средстве для мытья посуды амилазы в сочетании с протеазой и описанных ниже комбинациях изменений.

Недостаток известных из уровня техники жидких средств для мытья посуды, содержащих протеазу и амилазу, состоит в их недостаточной стабильности при хранении, следствием которой является наблюдаемая спустя короткое время утрата значительной части ферментативной, в частности, амилотической и/или протеолитической активности. Присутствие протеазы часто обусловливает потерю амилотической активности, поскольку протеаза деактивирует амилазу. При этом средство для мытья посуды утрачивает способность обеспечивать оптимальную моющую способность.

В основу настоящего изобретения была положена задача устранить указанный недостаток и предложить содержащие протеазу и амилазу жидкие средства для мытья посуды, которые обладают достаточной, соответственно повышенной стабильностью при хранении, что прежде всего относится к их ферментативной, предпочтительно амилотической и/или протеолитической активности.

Исходя из вышеизложенного объектом настоящего изобретения является жидкое средство для мытья посуды, которое включает:

(a) протеазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации по меньшей мере с двумя другими аминокислотными замещениями, выбранными из группы, включающей S3T, V4I, V193M и V199I, и

(b) амилазу.

Неожиданно было обнаружено, что жидкое средство для мытья посуды, содержащее указанную выше протеазу в комбинации с амилазой, предпочтительно обладает стабильностью при хранении. Подобное средство прежде всего характеризуется улучшенным моющим действием, в частности, повышенной амилотической и/или протеолитической моющей эффективностью после хранения по сравнению со средством для мытья посуды, отличающимся от предлагаемого в изобретении средства лишь присутствующей в нем протеазой, причем протеаза в подлежащих сравнению средствах находится в одинаковой концентрации в пересчете на активный фермент. Таким образом, предусматриваемая в соответствии с настоящим изобретением протеаза обусловливает пониженную дезактивацию амилазы, причем уменьшенной потерей эффективности характеризуется также сама протеаза. Однако пониженная дезактивации амилазы и/или протеазы посредством предусматриваемой в соответствии с изобретением протеазы не обусловлена недостаточной эффективностью и/или активностью протеазы. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения предлагаемые в изобретении средства для мытья посуды отличаются указанной выше повышенной стабильностью при хранении также при повышенных температурах, например, при 30°С, 35°С и/или даже 40°С.

Предлагаемое в изобретении средство характеризуется соответствующей, а также преимущественно высокой, прежде всего предпочтительной эффективностью удаления чувствительных к протеазе загрязнений. Таким образом, указанное средство позволяет осуществлять удовлетворительное или улучшенное удаление по меньшей мере одного, предпочтительно нескольких чувствительных к протеазе загрязнений с твердых поверхностях, например, с поверхностей посуды или металла, в частности, столовых приборов. В соответствии с выбранными вариантами осуществления изобретения подобной эффективности удаления по меньшей мере одного чувствительного к протеазе загрязнения достигают, в частности, также при более высоких температурах, составляющих, например, от 40 до 70°С, от 40 до 60°С или от 45 до 55°С.

Таким образом, в отличие от цитированных в начале настоящего описания международных заявок WO 95/23221, WO 92/21760 и WO 2011/032988 в настоящем изобретении речь идет об особенно предпочтительном жидком средстве для мытья посуды, отличающемся моющей эффективностью и стабильностью при хранении, прежде всего протеолитической и/или амилотической моющей эффективностью и/или протеолитической и/или амилотической активностью после хранения.

Под моющей эффективностью подразумевают способность средства для мытья посуды, в частности, средства для машинного мытья посуды, частично или полностью удалять загрязнение с твердой поверхности посуды. Посуда может быть загрязнена, например, молоком, мясным фаршем, яичным желтком, овсяными хлопьями или крахмалом. Согласно изобретению соответствующей моющей эффективностью характеризуется как содержащее протеазу и амилазу средство для мытья посуды, соответственно образуемый этим средством моющий раствор, так и сама протеаза, соответственно амилаза. Таким образом, моющая эффективность ферментов является вкладом в моющую эффективность средства, соответственно образуемого средством моющего раствора. Под амилотической моющей эффективностью подразумевают эффективность удаления чувствительных к амилазе загрязнений. Под протеолитической моющей эффективностью подразумевают эффективность удаления чувствительных к протеазе загрязнений. Моющая эффективность предпочтительно определяют известным специалистам, описанным ниже методом.

Под моющим раствором подразумевают рабочий раствор, который содержит средство для мытья посуды и воздействует на твердые поверхности, а, следовательно, входит в контакт с находящимися на этих поверхностях загрязнениями. Моющий раствор обычно образуется, как только начинают процесс мытья и средство для мытья посуды разбавляют водой, например, в посудомоечной машине или другой пригодной емкости.

В соответствии с настоящим изобретением предлагаемое в изобретении средство для мытья посуды обладает стабильностью при хранении прежде всего в том случае, если после хранения оно характеризуется более высокой моющей эффективностью по сравнению с контрольным составом, который отличается от предлагаемого в изобретении средства для мытья посуды лишь содержащейся в контрольном составе протеазой. Таким образом, в начале хранения оба подлежащих сравнению средства содержат одинаковые количества амилазы, соответственно обладают одинаковой концентрацией амилазы, и/или одинаковой исходной амилотической активностью. Кроме того, в начале хранения протеаза присутствует в обоих средствах в одинаковых концентрациях в пересчете на активный фермент, причем оба средства подвергают однотипной обработке, что в особенности относится к условиям хранения и определению ферментативной активности. Хранение предпочтительно осуществляют (в порядке возрастания) в течение по меньшей мере 24 часов, 48 часов, 72 часов, пяти дней, одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель. Более предпочтительно хранение осуществляют при температуре, составляющей по меньшей мере 35°С, особенно предпочтительно 40°С.

При этом ферментативную активность можно определять известными специалистам методами, которые зависят от типа фермента. Методы определения ферментативной активности, известные специалистам в области технологии ферментов, применяют, как обычно. Метод определения активности протеазы опубликован, например, в Tenside, том 7 (1970), сс. 125-132. Кроме того, протеолитическую активность можно определять посредством высвобождения пара-нитроанилина (pNa) в качестве хромофора из субстрата suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-п-нитро-анилид (suc-AAPF-pNA). Протеаза расщепляет субстрат и высвобождает pNA. Следствием высвобождения pNA является усиление поглощения при 410 нм, временной ход которого позволяет оценить ферментативную активность (смотри Del Маr и другие, 1979). Измерения выполняют при температуре 25°С, показателе рН 8,6 и длине волны 410 нм. Время измерения, выполняемого с интервалами от 20 до 60 секунд, составляет 5 минут. Активность протеазы предпочтительно указывают в РЕ (единицах протеазы).

Активность амилазы определяют известными специалистам методами. Активность амилазы предпочтительно определяют, как описано ниже. Амилазы превращают крахмал в глюкозу. Подлежащие исследованию образцы в определенных условиях реакции (трисмалеатный буфер, рН 6,5, 50°С, 15 минут) инкубируют с 0,67% растворимого крахмала, подвергнутого предварительной обработке при 190°С по Цулковскому глицерином. Посредством добавления динитросалициловой кислоты и нагревания при 100°С образцы восстанавливают в щелочных условиях глюкозой и другим восстанавливающим сахаром до оранжево-красного красителя, который по завершении реакции определяют фотометрически при 540 нм. При этом мерой ферментативной активности служит соответствующее окрашиванию количество высвобожденного сахара (смотри статью Самнера и других в J. Biol. Chem., 1921, 47 & 1924, 62).

В соответствии с настоящим изобретением стабилизацию ферментов особенно предпочтительно оценивают, как указано выше, используя содержащее протеазу и амилазу жидкое средство для мытья посуды, которое в течение четырех недель хранят при температуре 40°С, причем протеолитическую активность определяют по высвобождению пара-нитроанилина (pNa) в качестве хромофора из субстрата suc-AAPF-pNA, в то время как амилотическую активность определяют, как указано выше.

Протеаза, содержащаяся в предлагаемом в изобретении средстве для мытья посуды, включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации по меньшей мере с двумя другими аминокислотными замещениями, выбранными из группы, включающей S3T, V4I, V193M и V199I.

В другом варианте осуществления изобретения протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% и 98,8% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации по меньшей мере с двумя другими аминокислотными замещениями, выбранными из группы, включающей S3T, V4I, V193M и V199I.

SEQ ID NO. 1 является последовательностью зрелой щелочной протеазы из Bacillus lentus DSM 5483, описанной в международной заявке WO 92/21760, которую следует считать ссылкой, способствующей раскрытию сущности настоящего изобретения.

Особенно предпочтительными являются следующие предлагаемые в изобретении протеазы.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% и 98,8% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями S3T и V4I, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями S3T, V4I и L211D.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% и 98,8% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями S3T и V193M, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями S3T, V193M и L211D.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% и 98,8% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями S3T и V199I, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями S3T, V199I и L211D.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% и 98,8% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями V4I и V193M, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями V4I, V193M и L211D.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% и 98,8% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями V4I и V199I, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями V4I, V199I и L211D.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% и 98,8% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями V193M и V199I, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями V193M, V199I и L211D.

В другом варианте осуществления изобретения протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98% и 98,5% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации по меньшей мере с тремя другими аминокислотными замещениями, выбранными из группы, включающей S3T, V4I, V193M и V199I.

К соответствующим особенно предпочтительным предлагаемым в изобретении протеазами относятся следующие ферменты.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98% и 98,5% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями S3T, V4I и V193M, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями S3T, V4I, V193M и L211D.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98% и 98,5% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями S3T, V4I и V199I, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями S3T, V4I, V199I и L211D.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98% и 98,5% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями V4I, V193M и V199I, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями V4I, V193M, V199I и L211D.

Протеазы, которые соответствуют особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения, отличаются тем, что они характеризуются аминокислотным замещением L211D в комбинации с четырьмя другими аминокислотными замещениями S3T, V4I, V193M и V199I. К соответствующим еще более предпочтительным протеазам относятся, в частности, следующие.

Протеаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98% и 98,5% ее общей длины идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 характеризуется аминокислотным замещением L211D в комбинации с аминокислотными замещениями S3T, V4I, V193M и V199I, в частности, протеаза согласно SEQ ID NO. 1 с аминокислотными замещениями S3T, V4I, V193M, V199I и L211D. Подобная протеаза указана в SEQ ID NO. 2 и является еще более предпочтительной.

Другими особенно предпочтительными протеазами являются аналогичные указанным выше протеазы, которые в положении 99 при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 содержат аминокислоту аргинин (R) и/или в положении 188 при нумерации согласно SEQ ID NO. 1 содержат аминокислоту аланин (А).

В соответствии с настоящим изобретением положения аминокислот определяют путем сравнения аминокислотной последовательности подлежащей использованию протеазы с указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательностью протеазы из Bacillus lentus. Поскольку протеаза из Bacillus lentus в соответствии с уровнем техники состоит из базовых молекул, важных для идентификации протеаз и аминокислотных изменений, при характеристике положений аминокислот предпочтительно следует руководствоваться нумерацией протеаз из Bacillus lentus (SEQ ID NO. 1). Кроме того, при нумерации протеаз ориентируются на зрелый белок. Подобное сопоставление прежде всего следует использовать также в том случае, если аминокислотная последовательность подлежащей использованию протеазы включает большее количество аминокислотных остатков, нежели протеаза из Bacillus lentus согласно SEQ ID NO. 1. Исходя из указанных положений в аминокислотной последовательности протеазы из Bacillus lentus положения аминокислот в подлежащей использованию согласно изобретению протеазе аналогичны тем, которые соответствуют именно этим положениям при сравнении последовательностей.

В соответствии с этим кроме положения 211 особенно предпочтительными положениями, подлежащими сопоставлению при сравнении с SEQ ID NO. 1, а, следовательно, при нумерации согласно SEQ ID NO. 1, являются положения 3, 4, 193 и 199. В указанных положениях в молекулах протеазы дикого типа из Bacillus lentus находятся аминокислотные остатки S3, V4, V193, V199 и L211. Таким образом, в зависимости от числа отклонений от SEQ ID NO. 1 существуют отличающиеся от SEQ ID NO. 1 максимальные показатели идентичности последовательностей, которыми может характеризоваться подлежащая использованию согласно изобретению протеаза, даже если она во всех прочих аминокислотах должна соответствовать SEQ ID NO. 1. Данное обстоятельство в каждом случае следует учитывать для любой возможной комбинации предлагаемых согласно изобретению изменений последовательностей, причем оно зависит также от длины аминокислотной последовательности протеазы. Так, например, максимальная идентичность в случае трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или девяти изменений последовательностей составляет 98,88%, 98,51%, 98,14%, 97,77%, 97,40%, 97,03%, соответственно 96,65% в случае последовательности из 269 аминокислот, или 98,91%, 98,55%, 98,18%, 97,82%, 97,45%, 97,09%, соответственно 96,73% в случае последовательности из 275 аминокислот.

Согласно изобретению обнаружено, что добавление подобной протеазы к жидкому средству для мытья посуды, содержащему амилазу, позволяет получать особенно стабильное при хранении жидкое средство для мытья посуды, что прежде всего относится к эффективности мытья подобным средством после его хранения, длительность которого предпочтительно составляет (в порядке возрастания) 24 часа, 48 часов, 72 часа, 5 дней, одну неделю, две недели, три недели или четыре недели.

Протеаза, содержащаяся в предлагаемом в изобретении средстве для мытья посуды, обладает протеолитической активностью, то есть способностью к гидролизу пептидных связей полипептида, соответственно белка. Таким образом, она является ферментом, катализирующим гидролиз пептидных связей, а, следовательно, способным расщеплять пептиды или белки. Протеаза является, в частности, субтилазой, особенно предпочтительно субтилизином.

Амилаза представляет собой указанный в начале настоящего описания фермент. Для обозначения амилаз можно использовать термины-синонимы, например, 1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза или гликогеназа. Используемыми согласно изобретению амилазами предпочтительно являются α-амилазы. Решающим критерием для утверждения, что фермент является соответствующей изобретению α-амилазой, является его способность к гидролизу α-(1-4)-гликозидных связей в амилозе крахмала.

Используемыми согласно изобретению амилазами, являются, например, α-амилазы из Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens или Bacillus stearothermophilus, а также, в частности, соответствующие варианты, усовершенствованные применительно к использованию в моющих или чистящих средствах и средствах для мытья посуды. Фермент из Bacillus licheniformis может быть поставлен фирмой Novozymes под торговым названием Termamyl® и фирмой Danisco/Genencor под торговым названием Purastar®ST. Продукты усовершенствования указанной α-амилазы могут быть поставлены фирмой Novozymes под торговыми названиями Duramyl® и Termamyl®ultra, фирмой Danisco/Genencor под торговым названием Purastar®OxAm и фирмой Daiwa Seiko Inc. (Токио, Япония) под торговым названием Keistase®. α-Амилазу из Bacillus amyloliquefaciens под торговым названием Ban® поставляет фирма Novozymes, в то время как производные α-амилазы из Bacillus stearothermophilus под торговыми названиями BSG® и Novamyl® также поставляет фирма Novozymes. Кроме того, для указанной цели пригодна α-амилаза из Bacillus sp. А 7-7 (DSM 12368) и циклодекстрин-глюканотрансфераза (CGTase) из Bacillus agaradherens (DSM 9948). Наряду с этим можно использовать продукты слияния молекул любых указанных выше ферментов. Пригодными являются также улучшенные варианты α-амилазы из Aspergillus niger и A. oryzae, которые могут быть поставлены фирмой Novozymes под торговым названием Fungamyl®. Другими предпочтительно используемыми торговыми продуктами являются, например, Amylase-LT® и Stainzyme® или Stainzyme ultra®, соответственно Stainzyme plus®, причем последние также поставляет фирма Novozymes. Согласно изобретению можно использовать также варианты указанных ферментов, которые могут быть получены путем точечных мутаций. Особенно предпочтительные амилазы описаны в международных заявках WO 00/60060, WO 03/002711, WO 03/054177 и WO 07/079938, которые следует считать ссылками, способствующими раскрытию сущности настоящего изобретения.

Особенно пригодными для использования в предлагаемых в изобретении средствах являются варианты α-амилазы АА560 согласно SEQ ID NO. 3, причем особенно предпочтительными являются следующие варианты.

(a) Вариант α-амилазы, который в отличие от α-амилазы АА560 согласно SEQ ID NO. 3 характеризуется одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью следующими изменениями последовательности в соответствии с нумерацией α-амилазы АА560: R118K, D183* (делеция), G184* (делеция), N195F, R320K и R458K. Вариант α-амилазы особенно предпочтительно характеризуется всеми шестью указанными изменениями последовательности.

(b) Вариант α-амилазы, который в отличие от α-амилазы АА560 согласно SEQ ID NO. 3 характеризуется следующими изменениями последовательности в соответствии с нумерацией α-амилазы АА560:

При этом еще более предпочтительными являются следующие варианты α-амилазы:

(с) Вариант α-амилазы согласно пункту (b), который дополнительно характеризуется всеми шестью указанными в пункте (а) изменениями последовательности, под которым еще более предпочтительно подразумевают вариант 31 с шестью указанными в пункте (а) изменениями последовательности.

Согласно изобретению еще более предпочтительным является указанный в пункте (а) вариант α-амилазы, а также указанный в пункте (с) вариант α-амилазы 31 с шестью указанными в пункте (а) изменениями последовательности.

Идентичность последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислоты определяют путем сравнения последовательностей. Подобное сравнение выполняют, сопоставляя друг с другом подобные последовательности в нуклеотидных последовательностях или аминокислотных последовательностях. Подобное сравнение последовательностей, которое предпочтительно выполняют на основе известного из уровня техники и обычно используемого алгоритма BLAST (смотри, например, Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment searsc tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, а также Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database searsc programs"; Nucleic Acids Res., 25, cc. 3389-3402), в принципе заключается в сопоставлении друг с другом подобных последовательностей нуклеотидов или аминокислот в последовательностях нуклеиновой кислоты, соответственно аминокислоты. Упорядочение соответствующих положений, представленное в табличной форме, называют сравнением последовательностей. Другим известным из уровня техники алгоритмом является алгоритм FASTA. Сравнения последовательностей, в частности, многократные сравнения последовательностей, обычно выполняют с помощью компьютерных программ. Часто используют, например, режим Clustal (смотри, например, Chenna и другие (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500), T-Coffee (смотри, например, Notredame и другие (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) или программы, основанные на указанных выше программах, соответственно алгоритмах. В соответствии с настоящим изобретением сравнения последовательностей предпочтительно выполняют с использованием компьютерной программы Vector NTI® Suite 10.3 (фирма Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Карлсбад, Калифорния, США) с заданными стандартными (принимаемыми по умолчанию) параметрами.

Подобное сравнение позволяет судить о сходстве сравниваемых последовательностей друг с другом. Сходство обычно указывают в процентах идентичности, то есть указывают долю идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков в одинаковых положениях, соответственно в положениях, совпадающих при сравнении последовательностей друг с другом. Другое общее понятие гомологии учитывает консервированные в аминокислотных последовательностях аминокислотные замещения, то есть аминокислоты с похожими свойства, поскольку в пределах белка они чаще всего выполняют сходные действия, соответственно функции. В соответствии с этим сходство сравниваемых последовательностей может быть указано также в процентах гомологии или процентах сходства. Касающиеся идентичности и/или гомологии данные могут относиться к целым поли-пептидам, генам или только к отдельным участкам. Таким образом, гомо-логичные, соответственно идентичные участки разных последовательностей нуклеиновых или аминокислот определяются совпадениями в последовательностях. Указанные участки нередко выполняют одинаковые или сходные функции. Они могут быть короткими и могут включать небольшое количество нуклеотидов, соответственно аминокислот. Подобные короткие участки часто выполняют чрезвычайно важные функции для совокупной активности белка. Таким образом, может быть целесообразным, если совпадения последовательностей относятся лишь к отдельным, в некоторых случаях коротким участкам. Однако в соответствии с настоящим изобретением данные, касающиеся идентичности и/или гомологии, в отсутствие особых указаний относятся ко всей длине соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной после-довательности.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаемое в изобретении средство для мытья посуды отличается также тем, что его моющей эффективности соответствует по меньшей мере одно жидкое средство для мытья посуды, которое содержит протеазу согласно SEQ ID NO. 2. Моющую эффективность определяют в системе мытья, которая включает содержащее амилазу жидкое средство для мытья посуды в дозировке от 4,0 до 11,0 граммов на литров моющего раствора, а также протеазу, причем подлежащие сравнению протеазы используют в одинаковых концентрациях (в пересчете на активный белок), моющую эффективность посуды, загрязненной мясным фаршем и/или яичным желтком, измеряют путем определения соответствующего загрязнения, оставшегося по завершении процесса мытья, длительность которого составляет по меньшей мере 30 минут, предпочтительно 60 минут, процесс мытья осуществляют при температуре 50°С и жесткость воды составляет от 20 до 22 немецких градусов, предпочтительно 21 немецких градуса.

Средство для мытья посуды в моющей системе предпочтительно является двухфазным жидким средством для машинного мытья посуды, которое обладает следующим составом (все данные указаны в массовых процентах).

(а) Фаза ферментов:

добавка для усиления моющего действия	15,0-20,0
сахарный спирт	8,0-12,0
неионное поверхностно-активное вещество (этоксилат	3,0-5,0
жирного спирта с 8-10 атомами углерода и 22 единицами
этиленоксида)
щелочное соединение (основание)	3,0-4,0
борная кислота	2,5-3,5
фосфонат (1-гидроксиэтан-1,1-дифосфонат)	1,5-2,5
амилаза	1,0-2,0
протеаза	смотри
	описание
кальциевая соль	0,8-1,2
цинковая соль	0,15-0,25
загуститель	0,8-1,2
краситель, отдушка, консервант	0,25-0,5
вода	до 100

Под амилазой предпочтительно подразумевают препарат варианта α-амилазы (фирма Novozymes), который отличается от α-амилазы АА560 согласно SEQ ID NO. 3 следующими изменениями последовательности: R118K, D183* (делеция), G184* (делеция), N195F, R320K, R458K.

(b) Щелочная фаза:

добавка для усиления моющего действия	7,5-12,5
карбонат натрия	7,5-12,5
сульфополимер	5,0-8,0
щелочное соединение (основание)	3,0-5,0
моноэтаноламин	2,0-4,0
фосфонат (1-гидроксиэтан-1,1-дифосфонат)	2,0-5,0
загуститель	0,8-1,2
краситель, отдушка, консервант	0,25-0,5
вода	до 100

Протеаза присутствует в средстве в концентрации от 0,01 до 1% масс., предпочтительно от 0,1 до 0,5% масс. в пересчете на активный белок. Для осуществления процесса мытья в посудомоечную машину дозируют одинаковые количества соответствующих фаз (по 20 г). Процесс мытья осуществляют при показателе рН в диапазоне от 9 до 10 в обычной посудомоечной машине, например, машине G698SC фирмы Miele. В начале процесса мытья активность как протеазы, так и амилазы в моющем растворе не равна нулю.

Моющая эффективность визуально оценивают стандартным методом IKW (Союза промышленников гигиенических и моющих средств) в соответствии со шкалой от 1 до 10 баллов, причем 10 баллов означает наивысшую оценку (отсутствие заметного остаточного загрязнения).

Особенно предпочтительно моющую эффективность в посудомоечной машине определяют, используя указанное выше двухфазное жидкое средство для машинного мытья посуды, загрязненной мясным фаршем и яичным желтком.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаемое в изобретении средство для мытья посуды отличается также тем, что его стабильность при хранении по меньшей мере аналогична стабильности при хранении средства для мытья посуды, содержащего протеазу согласно SEQ ID NO. 2. Предлагаемое в изобретении средство для мытья посуды обладает подобной стабильностью при хранении в том случае, если после четырехнедельного хранения при 40°С оно характеризуется такой же или более высокой моющей эффективностью, как и используемое для сравнения средство для мытья посуды, причем предлагаемое в изобретении средство отличается от последнего лишь содержащейся в нем протеазой.

Под используемым для сравнения средством особенно предпочтительно подразумевают двухфазное жидкое средство для машинного мытья посуды, аналогичное указанному выше, причем моющую эффективность определяют, как указано выше.

В начале хранения оба подлежащих сравнению средства обладают одинаковой исходной амилотической активностью и с