Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1

Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена DGATI (диацилглицерол О-ацилтрансфераза 1) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Разработанный нами способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования кр.рог.ск. по аллелям А и K гена DGAT1 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции вместе с его ближайшим прототипом [1] относятся к категории анти-праймер-опосредованной количественной ПЦР в реальном времени (anti-primer-based quantitative real-time PCR, aQRT-PCR), предложенной J.Li & G.M. Makrigiorgos (2009) [2], способной эффективно генотипировать биологические объекты на основе полиморфизма единичных нуклеотидных замен.

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену DGAT1 на основе ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Нами разработан способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K гена DGAT1 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции, предусматривающий использование двух 5'-флуоресцентно-меченых прямых аллель-специфичных праймеров (DGAT1-A + DGAT1-K), одного обратного общего праймера (DGAT1-R), и одного анти-праймера (DGAT1-S), меченого гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида (табл. 1, фиг. 1)

Основное отличие разработанного нами способа от прототипа [1] кроется в конструктивных особенностях 5'-флуоресцентно-меченых прямых аллель-специфичных праймеров, полностью состоящих из ген-специфичных последовательностей, на которых, в том числе и путем конкурентной гибридизации, отжигается комплементарный анти-праймер меньшей длины, меченый гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида.

Условия проведения реакции

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб Б», ЦНИИЭМ, Россия).

Разработанный способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K гена DGAT1 выполняли на амплификаторе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно протоколу, представленному в табл. 1.

В работе использовали реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и ООО «ДНК-синтез» (Россия).

Апробацию разработанного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K гена DGAT1 провели на пробах ДНК 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан Российской Федерации.

Заключение

В результате практических исследований, направленных на апробацию разработанного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K гена DGAT1 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции нами был получен обеспечиваемый предложенным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (АА, KK, AK) ввиду корректной интерпретации данных кривых увеличения интенсивности флуоресценции (фиг. 2).

Источники информации

2. Rashydov, A.N. Identification of allele variants of cattle milk productivity genes using PCR and the anti-primer method / A.N. Rashydov, V.G. Spiridonov, O.N. Konoval, M.D. Melnychuk // Cytology and Genetics. - 2010. - V. 44. - N. 5. - P. 272-275.

2. Li, J. Anti-primer quenching-based real-time PCR for simplex or multiplex DNA quantification and single-nucleotide polymorphism genotyping / J. Li, G.M. Makrigiorgos // Nature protocols. - 2007. - V. 2. - N. 1. - P. 50-58.

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг. 1

Выравнивание фланкируемых с праймерами DGAT1-A + DGAT1-K + DGAT1-R нуклеотидных последовательностей аллелей А и K гена DGAT1 Bos Taurus

Пояснение к фиг. 2

Результат предложенного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования кр.рог.ск. по аллелям А и K гена DGAT1 (праймеры DGAT1-A + DGAT1-K + DGAT1-R и анти-праймер DGAT1-S)

Обозначения

Слева - канал детекции Orange. Справа - канал детекции Red. Кривые роста флуоресценции для генотипов АА (1-3), AK (7-9) и KK (4-6). OKO (10).

Способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся тем, что используются:

5'-флуоресцентно-меченый прямой A-аллель-специфичный праймер DGAT1-А: 5'-ROX-CGTAGCTTTGGCAGGTAAAGC-3' (SEQ ID NO: l),

5'-флуоресцентно-меченый прямой K-аллель-специфичный праймер DGAT1-К: 5'-Cy5-CGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO: 2),

обратный общий праймер DGAT1-R: 5'-GGCAGCTCCCCCGTTGG-3' (SEQ ID NO: 3),

анти-праймер DGAT1-S, меченый гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида: 5'-ACCTGCCAAAGCTACG-3'-BHQ2 (SEQ ID NO: 4).