Конструкт и способ для экспрессии трансгенов с использованием двунаправленного конститутивного промотора brassica

Конструкт и способ для экспрессии трансгенов с использованием двунаправленного конститутивного промотора brassica

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Эта заявка заявляет приоритет предварительной заявки США №61/656,634, поданной 7 июня 2012 года, описание которой включено здесь специально посредством ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ МАТЕРИАЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Посредством ссылки в полном объеме включен считываемый компьютером список последовательностей, представленный одновременно здесь и идентифицированный следующим образом: one 78,835 byte ASCII (text) file named «70136_ST25.txt», created on May 13, 2013.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение, в общем, относится к области молекулярной биологии и, более конкретно, к области стабильной экспрессии множественных генов в трансгенных растениях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Многие виды растений способны трансформироваться трансгенами из других видов для введения агрономически желательных признаков или характеристик, например, улучшения пищевой (питательной) ценности, увеличения урожая, придания устойчивости к насекомым-вредителям или устойчивости к болезням, увеличения толерантности к стрессу, вызванному засухой, и увеличения плодоовощных качеств (таких как пигментация и рост), передачи устойчивости к гербицидам, позволяя получать промышленным образом используемые соединения и/или материалы из этого растения и/или позволяя производить фармацевтические лекарственные средства. Введение трансгенов в клетки растений и последующее восстановление фертильных трансгенных растений, которые содержат стабильно интегрированную копию этого трансгена, может быть использовано для получения трансгенных растений, которые обладают желаемыми признаками.

Контроль и регуляция экспрессии генов могут осуществляться посредством многочисленных механизмов. Инициация транскрипции гена является доминирующим регулирующим механизмом экспрессии гена. Инициация транскрипции обычно регулируется полинуклеотидными последовательностями, локализованными в 5'-фланкирующей области или в области, расположенной выше транскрибирумого гена. Эти последовательности вместе называются промоторами и распределяются по категориям как регуляторный элемент гена. Промоторы в растениях, которые были клонированы и широко использовались как для научно-исследовательской работы, так и для биотехнологического применения, являются обычно однонаправленными, управляющими только одним геном, который был слит на его 3'-конце (т.е. ниже). См., например, Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9; США патент № 6,388,170.

Дополнительные регуляторные элементы гена включают в себя последовательности, которые взаимодействуют со специфическими ДНК-связывающими факторами. Эти мотивы последовательности называют иногда cis-элементами, и они обычно являются зависимыми от положения и зависимыми от ориентации, хотя они могут быть найдены 5'- или 3'- относительно кодирующей ген последовательности, или в интроне. Такие cis-элементы, с которыми связаны ткане-специфичные или развитие-специфичные факторы транскрипции, индивидуально или в комбинации, могут определять пространственно-временной паттерн промотора на транскрипционном уровне. Эти cis-элементы широко варьируются в типе контроля, который они оказывают на функционально связанные гены. Некоторые элементы действуют для увеличения транскрипции функционально-связанных генов в ответ на реакции окружающей среды (например, температуру, влажность и скарификацию). Другие cis-элементы могут реагировать на другие сигналы (например, прорастание, созревание семян и зацветание) или на пространственную информацию (например, специфичность ткани). См., например, Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23.

Часто необходимым является введение множественных генов в растения для метаболической инженерии и стекинга генов («стеллажных» генов), причем эти гены часто регулируются идентичными или гомологичными промоторами. Однако сайленсинг генов на основе гомологии (HBGS) повышается, по-видимому, когда множественные введенные трансгены имеют гомологичные промоторы, запускаемые ими. См., например, Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94. Сообщалось, что HBGS встречаются широко в трансгенных растениях. См., например, Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17:29-35. Предлагались несколько механизмов для объяснения феномена of HBGS, все из которых включают в себя признак, что гомология последовательности в этом промоторе запускает механизмы клеточного узнавания, которые приводят к сайленсингу повторяющихся генов. См., например, Matzke and Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679-85; Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63; Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2; и Steimer et al. (2000) Plant Cell 12:1165-78.

Стратегии для избегания HBGS в трансгенных растениях часто включают в себя развитие различных промоторов, которые являются функционально эквивалентными, но имеют минимальную гомологию последовательности. Таким образом, остается потребность в конструктах и способах для стабильной экспрессии множественных трансгенов эффективно с минимальным риском в отношении рекомбинации или потери трансгенов в результате бридинга или множественных генераций в трансгенных растениях.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обеспечены конструкты и способы для экспрессии множественных генов в клетках растений и/или тканей растений с использованием раскрытого двунаправленного промотора из Brassica napus или двунаправленного конститутивного промотора Brassica (BBCP). Эти обеспеченные конструкты содержат по меньшей мере один такой двунаправленный промотор, связанный с экспрессионными кассетами множественных генов, где каждая из этих экспрессионных кассет генов содержит по меньшей мере один трансген. В некоторых вариантах осуществления, эти обеспеченные конструкты и способы делают возможной экспрессию от двух до двадцати генов.

В одном аспекте обеспечен конструкт нуклеиновой кислоты для экспрессии множественных генов в клетках и/или тканях растений. Указанный конструкт нуклеиновой кислоты содержит: (а) двунаправленный промотор, содержащий последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность SEQ ID NO: 1; и (b) две экспрессионные кассеты генов на противоположных концах этого двунаправленного промотора.

В одном варианте осуществления, указанный двунаправленный промотор содержит по меньшей мере один энхансер. В другом варианте осуществления, указанный двунаправленный промотор не содержит энхансера. В другом варианте осуществления, указанный конструкт нуклеиновой кислоты содержит бинарный вектор для трансформации растений. В другом варианте осуществления, указанный конструкт нуклеиновой кислоты содержит бинарный вектор для Agrobacterium-опосредованной трансформации. В другом варианте осуществления, указанный двунаправленный промотор содержит по меньшей мере один интрон. В другом варианте осуществления, указанный двунаправленный промотор содержит по меньшей мере одну 5’-нетранслируемую область. В одном варианте осуществления, указанный двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 или 3. В другом варианте осуществления, указанный двунаправленный промотор, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100% идентичность SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления указанный двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 22-25 или их комплементов. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления, указанный двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 22-24 или их комплементов. В одном дополнительном или альтернативном варианта осуществления, указанный двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 22-23 или их комплементов. В одном дополнительном или альтернативном вариантах осуществления, указанный двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 22 или их комплементов.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере одна из экспрессионных кассет гена содержит два или более генов, связанных через ген-переключатель трансляции. В другом варианте осуществления, обе эти кассеты экспрессии генов содержат два или более генов, связанных через ген-переключатель трансляции. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления, указанный ген-переключатель трансляции выбран из группы, состоящей из внутреннего сайта вхождения в рибосому (IRES), альтернативного сайта сплайсинга, сайта связывания рибозима, полинуклеотидной последовательности, кодирующей 2А-подобный пептид, полинуклеотидной последовательности, кодирующей интеин, полинуклеотидной последовательности, кодирующей сайт расщепления протеазы, и их комбинаций. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления, указанный ген-переключатель содержит цис-действующий элемент гидролазы (CHYSEL). В одном дополнительном варианте осуществления, этим CHYSEL является последовательность пептида 2A или 2A-подобного пептида. В другом варианте осуществления, ген выше переключателя трансляции не содержит стоп-кодона трансляции.

В одном варианте осуществления, указанный конструкт нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере один трансген. В другом варианте осуществления, указанный конструкт нуклеиновой кислоты позволяет или допускает экспрессию по меньшей мере четырех генов. В дополнительном варианте осуществления все четыре гена являются трансгенами. В другом варианте осуществления, указанный конструкт нуклеиновой кислоты позволяет экспрессию от трех до двадцати генов. В другом варианте осуществления, указанный конструкт нуклеиновой кислоты позволяет экспрессию от четырех до восьми генов. В одном дополнительном или альтернативном варианте осуществления, указанные гены являются трансгенами. В другом варианте осуществления, по меньшей мере одна экспрессионная кассета генов содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок. В другом варианте осуществления, указанный слитый белок содержит три - пять генов. В другом варианте осуществления, обе эти экспрессионные кассеты не содержат гена EPSPS или паралога.

В другом аспекте, обеспечен конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий регуляторный элемент, применимый для терминации экспрессии одного или множественных генов в клетках и/или тканях растений. Этот регуляторный элемент содержит 3'-нетранслируемую область паралога А (UTR) или поли А-область, которые могут быть слиты с 3'-концом трансгена. В одном варианте осуществления, 3'UTR паралога A содержит функциональную последовательность полиаденилирования, которая применима для терминации и регуляции транскрипции и трансляции. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления, этот регуляторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-, 85%-, 90%-, 95%- или 100%-ную идентичность SEQ ID NO: 26 или ее комплемента. В одном дополнительном варианте осуществления, этот регуляторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 26 или ее комплемент.

В другом аспекте, обеспечен способ генерирования трансгенного растения, предусматривающий трансформацию клетки растения конструктом нуклеиновой кислоты, обеспеченным здесь. В другом аспекте, обеспечен способ генерирования трансгенной клетки, предусматривающий трансформацию указанной клетки конструктом нуклеиновой кислоты, обеспеченной здесь. В другом аспекте, обеспечена клетка растения, содержащая конструкт нуклеиновой кислоты, обеспеченный здесь. В одном дополнительном или альтернативном варианте осуществления, указанный конструкт нуклеиновой кислоты стабильно трансформируют в указанную клетку растения. В другом аспекте, обеспечено трансгенное растение или семя, содержащие конструкт нуклеиновой кислоты, обеспеченный здесь. В одном дополнительном или альтернативном варианте осуществления, этот конструкт нуклеиновой кислоты стабильно трансформируют в клетки этого трансгенного растения или семени. В дополнительном варианте осуществления, указанное трансгенное растение является двудольным растением. В другом дополнительном варианте осуществления, указанное трансгенное растение является однодольным растением. В другом аспекте, обеспечен способ для экспрессии множественных генов в клетках и/или тканях растений, предусматривающий введение в эти клетки и/или ткани растения конструкта нуклеиновой кислоты, обеспеченного здесь. В одном дополнительном или альтернативном варианте осуществления, эти клетки и/или ткани растения стабильно трансформируют конструктом нуклеиновой кислоты, обеспеченным здесь. В другом аспекте, обеспечен бинарный вектор для Agrobacterium-опосредуемой трансформации. Этот бинарный вектор содержит конструкт нуклеиновой кислоты, обеспеченный здесь. В другом аспекте, обеспечено использование двунаправленного промотора, обеспеченного здесь, для экспрессии множественных трансгенов в растениях. В одном варианте осуществления, этот двунаправленный промотор, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-, 85%-, 90%-, 95%- или 100%-ную идентичность SEQ ID NO: 1. В другом аспекте, обеспечено использование двунаправленного промотора, обеспеченного здесь, в производстве трансгенных растений или семян. В одном варианте осуществления, этот двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-, 85%-, 90%-, 95%- или 100%-ную идентичность SEQ ID NO: 1.

В другом аспекте, обеспечен конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий по меньшей мере одну последовательность интрона Brassica в трансгенных клетках и/или тканях растений. В одном варианте осуществления, последовательность интрона Brassica выбрана из SEQ ID NO: 27-33. В другом аспекте обеспечено использование по меньшей мере одной последовательности интрона Brassica в приготовлении трансгенных растений или семян. В одном варианте осуществления, последовательность интрона Brassica выбрана из SEQ ID NO: 27-33.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Фиг. 1А показывает последовательность 739 nt центрального двунаправленного промотора Brassica, двунаправленного конститутивного промотора (BBCP) (SEQ ID NO: 1).

Фиг. 1В показывает модифицированную последовательность 1226 nt BBCP (SEQ ID NO: 2), где нуклеотидная последовательность «gg» добавлена для введения сайта расщепления рестрикционного фермента (рестриктазы).

Фиг.1C показывает SEQ ID NO: 3, которая является обратным комплементом SEQ ID NO: 2, где добавленная последовательность «gg» SEQ ID NO: 2 показана как последовательность «cc» SEQ ID NO: 3.

Фиг. 2А показывает идентификацию BBCP из генома Brassica napus, где экспрессия гена паралога А запускается BBCP. На противоположном конце BBCP от гена паралога А EPSPS, также идентифицирован предложенный неизвестный ген.

Фиг. 2В показывает полинуклеотидную последовательность нативной геномной последовательности (SEQ ID NO: 4), содержащую (1) предположенный неизвестный ген, (2) BBCP и (3) ген паралога А EPSPS.

Фиг. 3А дополнительно показывает предсказанную последовательность белка этого предложенного неизвестного гена (SEQ ID NO: 5) и

Фиг. 3В показывает соответствующую кодирующую последовательность (SEQ ID NO: 6).

Фиг. 4А показывает частичную последовательность гена паралога А EPSPS (SEQ ID NO: 7), которая является такой же, как SEQ ID NO: 10 US 2009/0205083.

Фиг. 4В показывает полную последовательность гена паралога А EPSPS.

Фиг. 4С дополнительно показывает последовательность белка паралога А EPSPS (SEQ ID NO: 9), и

Фиг. 4D показывает соответствующую кодирующую последовательность паралога А EPSPS (SEQ ID NO: 10).

Фиг. 5А показывает последовательность гена паралога В EPSPS (SEQ ID NO: 11), которая является такой же, что и SEQ ID NO: 11 US 2009/0205083.

Фиг. 5В дополнительно показывает последовательность белка паралога В EPSPS (SEQ ID NO: 12), и

Фиг. 5С показывает соответствующую кодирующую последовательность паралога В EPSPS (SEQ ID NO: 13).

Фиг. 6А показывает последовательность гена паралога С EPSPS (SEQ ID NO: 14), которая является такой же, что и SEQ ID NO: 12 US 2009/0205083.

Фиг. 6В дополнительно показывает последовательность белка паралога С EPSPS (SEQ ID NO: 15), и

Фиг. 6С показывает соответствующую кодирующую последовательность паралога С EPSPS (SEQ ID NO: 16).

Фиг. 7А показывает последовательность гена паралога Е EPSPS (SEQ ID NO: 17), которая является такой же, что и SEQ ID NO: 14 US 2009/0205083.

Фиг. 7В дополнительно показывает последовательность белка паралога Е EPSPS (SEQ ID NO: 18), и Фиг. 7С показывает соответствующую кодирующую последовательность паралога С EPSPS (SEQ ID NO: 19).

Фиг. 8 показывает сопоставление примерных последовательностей среди белковых последовательностей паралога А EPSPS (SEQ ID NO: 9), паралога В EPSPS B (SEQ ID NO: 12), EPSPS паралога C (SEQ ID NO: 15) и паралога Е EPSPS (SEQ ID NO: 18).

Фиг. 9 показывает примерную последовательность из pDAB100331 (SEQ ID NO: 20), содержащую экспрессионные кассеты генов для GUS и GFP на противолежащих концах BBCP. Экспрессия как GUS, так и GFP запускается BBCP.

Фиг. 10 показывает примерную последовательность из pDAB100331 (SEQ ID NO: 21), содержащую экспрессионные кассеты генов для GUS и GFP на противолежащих концах BBCP. Экспрессия как GUS, так и GFP запускается BBCP.

Фиг. 11A и 11B показывают альтернативные последовательности BBCP, включающие в себя SEQ ID NO: 22-25.

Фиг. 12 показывает репрезентативные карты плазмид pDAB100331 и pDAB100333.

Фиг. 13 показывает репрезентативные карты плазмид pDAB108710 и pDAB108711.

Фиг. 14 показывает примерную последовательность гена 3’UTR паралога А EPSPS (SEQ ID NO: 26) и семь последовательностей интронов паралога А (SEQ ID No: 27-33).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Развитие трансгенных продуктов становится все более сложным, что требует стекинга множественных трансгенов в единый локус. Традиционно каждый трансген обычно требует уникального промотора для экспрессии, так что множественные промоторы требуются для экспрессии различных трансгенов в одной стопке генов. Кроме этого, увеличение размера стопки генов часто приводит к повторяемому использованию одного и того же промотора для получения сходных уровней паттернов экспрессии различных трансгенов для экспрессии единственного полигенного признака. Известно, что мультигенные конструкты, запускаемые одним и тем же промотором, вызывают сайленсинг генов, делая таким образом трансгенные продукты менее эффективными в данной области. Избыток сайтов связывания фактора транскрипции (TF) вследствие повторения промотора может вызывать истощение эндогенных TF, приводя к инактивации транскрипции. Этот сайленсинг трансгенов будет вероятно нежелательным образом влиять на производительность трансгенного растения, полученного для экспрессии трансгенов. Повторяющиеся последовательности в трансгене могут приводить к интра-локусной гомологичной рекомбинации, приводящей к реаранжировкам полинуклеотидов.

Обеспечены способы и конструкты, использующие двунаправленный конститутивный промотор Brassica (BBCP) для экспрессии трансгенов в растении. Также обеспечены способы и конструкты, объединяющие систему двунаправленного промотора с бицистронной организацией генов на каждом одном конце или на обоих концах промотора, например, с использованием последовательности 2A из вируса Thosea asigna. Белок 2A, который имеет в длину только 16-20 аминокислот, расщепляет этот полипротеин на его собственном карбоксил-конце. Это «саморасщепление» или свойство «пропуска (скачка) рибосомы» пептида 2A или 2A-подобного пептида могут быть использованы для процессирования искусственных полипротеинов, продуцируемых в трансгенных растениях. В одном варианте осуществления, гены Cry34 и Cry35 сливают в другую экспрессионную кассету генов, где гены GFP (или YFP или PhiYFP) и AAD1 слиты в другую экспрессионную кассету генов (с единственной открытой рамкой считывания (ORF) с копией гена белка 2А, расположенной между этими двумя генами в каждой комбинации). Например, каждая из этих экспрессионных кассет (или пар генов) могут быть помещены на любом конце двунаправленного промотора для запуска 4 трансгенов с использованием единственного промотора. Таким образом, конструкты и способы, обеспеченные здесь, применимы для избегания повторяемого использования одного и того же промотора и значимого уменьшения размера коммерческих конструктов. Кроме того, регуляция четырех или более генов одним промотором также обеспечивает способность ко-экспрессии генов, контролирующих единственный полигенный признак.

Некоторые раскрытые аббревиатуры перечислены в таблице 1.

Таблица 1Аббревиатуры, используемые в этом описании
Фраза	Аббревиатура
бицинхониновая кислота	BCA
вирус мозаики цветной капусты	CaMV
хлоропластный транспортный пептид	CTP
сайленсинг гена на основе гомологии	HBGS
ZmUbi1 минимальный центральный промотор	minUbi1P
олиго лигирование амплификация	OLA
забуференный фосфатом солевой раствор	PBS
забуференный фосфатом солевой раствор с 0,05% Твином 20	PBST
полимеразная цепная реакция	PCR
амплификация по типу катящегося кольца	RCA
обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция PCR	RT-PCR
праймерное удлинение одним нуклеотидом	SNuPE
регуляторная последовательность против хода транскрипции	URS

Промоторы растений, используемые для научных исследований или биотехнологического применения, обычно являются однонаправленными, направленными только на один ген, который был слит на его 3'-конце (по ходу транскрипции). Часто является необходимым введение множественных генов в растения для метаболической инженерии и стекинга признака, и, следовательно, множественные промоторы обычно являются необходимыми в будущих трансгенных культурах для запуска экспрессии множественных генов. Желательной является разработка стратегий, которые могут экономить количество используемых промоторов и делать возможной одновременную совместно регулируемую экспрессию для укладки (стекинга) генов. В одном варианте осуществления, обеспеченные двунаправленные промоторы могут запускать транскрипцию множественных единиц транскрипции, включающих в себя последовательности RNAi, искусственные miRNA или имеющие «шпилечную петлю» последовательности РНК.

В данном контексте артикли, «a», «an» и «the» включают в себя множественные ссылки, если этот контекст не диктует ясно и недвусмысленно другое.

В данном контексте, фраза «обратное скрещивание» относится к процессу, в котором селекционер скрещивает гибридного потомка обратно с одним из родителей, например, гибрида первого поколения F1 с одним из родительских генотипов гибрида F1.

В данном контексте, фраза «интрон» относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в гене (или экспрессируемой представляющей интерес последовательности), которая транскрибируется, но не транслируется. Интроны включают в себя нетранслируемую последовательность нуклеиновой кислоты в экспрессируемой последовательности ДНК, а также соответствующую последовательность в молекулах РНК, транскрибируемых из них.

Этот обеспеченный конструкт может также содержать последовательности, которые усиливают трансляцию и/или стабильность мРНК, такие как интроны. Примером одного такого интрона является первый интрон гена II варианта гистона H3.III Arabidopsis thaliana или любую другую обычно известную интронную последовательность. Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992). В данной области известно, что интроны могут быть использованы в комбинации с последовательностями промоторов для усиления трансляции и/или стабильности мРНК.

В данном контексте, фраза «5' нетранслируемая область» или «5’UTR» относится к нетранслируемому сегменту в 5' конце пре-мРНК или зрелых мРНК. Например, на зрелых мРНК, этот 5’UTR обычно захватывает на его 5' конце 7-метилгуанозиновый кэп и участвует во многих процессах, таких как сплайсинг, полиаденилирование, экспорт мРНК в направлении к цитоплазме, идентификация 5' конца этой мРНК посредством аппарата трансляции и защита мРНК против деградации.

В данном контексте, фраза «3' нетранслируемая область» или «3’UTR» относится к нетранслируемому сегменту в 3'-конце пре-мРНК или зрелых мРНК. Например, на зрелых мРНК эта область захватывает поли (A) хвост и, как известно, играет многие роли в стабильности мРНК, инициации трансляции, экспорте мРНК.

В данном контексте, фраза «сигнал полиаденилирования» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в транскриптах мРНК, что позволяет этим транскриптам мРНК, в присутствии поли (А)-полимеразы, быть полиаденилированными на сайтах полиаденилирования, например, расположенных в 10-30 основаниях ниже поли (А)-сигнала. Многие сигналы полиаденилирования известны в данной области и применимы для данного изобретения. Примеры включают в себя сигнал полиаденилирования варианта гормона роста человека, поздний сигнал полиаденилирования SV40 (вируса обезьяны) и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.

В данном контексте, фраза «выделенный» относится к биологическому компоненту (в том числе нуклеиновой кислоте или белку), который был по существу отделен, получен отдельно или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в котором этот компонент встречается в природе (т.е. других хромосомных и внехромосомных ДНК и РНК и белков), хотя и с вызыванием химического или функционального изменения в этом компоненте (то есть, нуклеиновая кислота может быть выделена из хромосомы разрушением химических связей, соединяющих эту нуклеиновую кислоту с остальной ДНК в хромосоме). Молекулы нуклеиновых кислот и белков, которые могут быть «изолированы», включают в себя молекулы нуклеиновых кислот и белков, очищенные стандартными способами очистки. Фраза «выделенные» включает в себя также нуклеиновые кислоты и белки, полученные рекомбинантной экспрессией в клетке-хозяине, а также химически синтезированные молекулы нуклеиновых кислот, белков и пептидов.

В данном контексте, фраза «экспрессия генов» относится к процессу, при помощи которого кодируемая информация транскрипционной единицы (в том числе, например, геномной ДНК) превращается в функциональную, нефункциональную или структурную часть клетки, часто с включением синтеза белка. На экспрессию генов могут влиять внешние факторы; например, подвергание клетки, ткани или организма действию агента, который увеличивает или уменьшает экспрессию гена. Экспрессия гена может также регулироваться где-нибудь в пути от ДНК до РНК к белку. Регуляция экспрессии гена осуществляется, например, через контроли, действующие на транскрипцию, трансляцию, транспорт и процессинг РНК, деградацию промежуточных молекул, таких как мРНК, или через активацию, инактивацию, компартментализацию или деградацию молекул специфического белка, после их получения, или их комбинаций. Экспрессия гена может быть измерена на уровне РНК или уровне белка любым способом, известным в данной области, включающим в себя, без ограничения, Нозерн-блоттинг, RT-PCR, Вестерн-блот, или анализом (анализами) активности белка in vitro, in situ или in vivo.

В данном контексте, фраза «сайленсинг гена на основе гомологии» (HBGS) относится к родовому термину, который включает в себя как транскрипционный сайленсинг гена, так и пост-транскрипционный сайленсинг гена. Сайленсинг локуса-мишени несвязанным локусом связывания может происходить из ингибирования транскрипции (транскрипционный сайленсинг гена; TGS) или деградации мРНК (пост-транскрипционный сайленсинг гена; PTGS), вследствие продуцирования двухцепочечной РНК (dsRNA), соответствующей промотору или транскрибируемым последовательностям, соответственно. Участие отдельных клеточных компонентов в каждом процессе предполагает, что dsRNA-индуцируемые TGS и PTGS, происходят, по-видимому, из диверсификации старого общего механизма. Однако строгое сравнение TGS и PTGS было трудно получить, так как оно обычно основано на анализе индивидуальных локусов сайленсинга. Было описано, что один локус трансгена запускает как TGS, так и PTGS, вследствие продуцирования dsRNA, соответствующей промотору и транскрибируемым последовательностям различных генов-мишеней. См., например, Mourrain et al. (2007) Planta 225:365-79. Вероятно, что siRNA являются фактическими молекулами, которые запускают TGS и PTGS на гомологичных последовательностях: siRNA могли бы в этой модели запускать сайленсинг и метилирование гомологичных последовательностей в cis и в trans через распространение метилирования трансгенных последовательностей в эндогенный промотор.

В данном контексте, фраза «молекула нуклеиновой кислоты» (или «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотид») относится к полимерной форме нуклеотидов, которая может включать в себя как смысловые, так и антисмысловые цепи РНК, кДНК, геномной ДНК и синтетические формы и смешанные полимеры описанные выше. Один нуклеотид может быть рибонуклеотидом, дезоксирибонуклеотидом или модифицированной формой нуклеотида любого типа. «Молекула нуклеиновой кислоты» в данном контексте является синонимом «нуклеиновой кислоты» и «полинуклеотида». Молекула нуклеиновой кислоты обычно имеет длину по меньшей мере 10 оснований, если нет других указаний. Этот термин может также относиться к молекуле РНК или ДНК неопределенной длины. Этот термин включает в себя одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может включать в себя каждый или оба природно-встречающихся и модифицированных нуклеотидов, связанных вместе природно-встречающимися и/или не встречающимися в природе нуклеотидными связями.

Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химически или биохимически или могут содержать неприродные или дериватизованные нуклеотидные основания, а также будут легко оцениваться квалифицированными в данной области специалистами. Такие модификации включают в себя, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких природно-встречающихся нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации (например, незаряженные связи: например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.; заряженные связи: например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.; свисающие части: например, пептиды; интеркаляторы: например, акридин, псорален и т.д.; хелаторы; алкиляторы; и модифицированные связи; например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Термин «молекула нуклеиновой кислоты» включает в себя также любую топологическую конформацию, в том числе одноцепочечную, двухцепочечную, частично дуплексную, триплексную, шпилечную, кольцевую и висячую конформации.

Транскрипция протекает от 5' к 3' вдоль цепи ДНК. Это означает, что РНК образуется последовательным добавлением рибонуклеотид-5'-трифосфатов к 3'-концу растущей цепи (с необходимым элиминированием пирофосфата). В каждой линейной или в кольцевой молекуле нуклеиновой кислоты, отдельные элементы (например, конкретные нуклеотидные последовательности) могут называться как находящиеся «выше» относительно дополнительного элемента, если они связаны или могли бы быть связаны с той же самой нуклеиновой кислотой в направлении 5' от этого элемента. Подобным образом, отдельные элементы могут находиться «ниже» относительно дополнительного элемента, если они связаны или могли бы быть связаны с той же самой нуклеиновой кислотой в направлении 3' от этого элемента.

В данном контексте, фраза «положение основания» относится к местоположению этого основания или нуклеотидного остатка в определенной нуклеиновой кислоте. Эта определенная нуклеиновая кислота может быть определена сопоставлением (см. ниже) со ссылочной нуклеиновой кислотой.

В данном контексте, фраза «гибридизация» относится к процессу, в котором олигонуклеотиды и их аналоги гибридизуются водородным связыванием, которое включает в себя связывание Уотсона-Крика, Хугстиновское спаривание или обращенное водородное Хугстиновское спаривание, между комплементарными основаниями. Обычно, молекулы нуклеиновых кислот состоят из азотистых оснований, которые являются либо пиримидинами (цитозин (C), урацил (U) и тимин (T)), либо пуринами (аденин (A) и гуанин (G)). Эти азотистые основания образуют водородные связи между пиримидином и пурином, и это связывание пиримидина с пурином называют «спариванием оснований». Более конкретно, А будет водородной связью с Т или U, а G будет связью с С. Термин «комплементарный» относится к спариванию оснований, которое осуществляется между двумя разными последовательностями нуклеиновых кислот или двумя разными областями одной и той же последовательности нуклеиновой кислоты.

В данном контексте, фразы «специфически гибридизируемые» и «специфически комплементарные» относятся к достаточной степени комплементарности, так что осуществляется стабильное и специфическое связывание между этим олигонуклеотидом и ДНК- или РНК-мишенью. Этот олигонуклеотид не должен быть на 100% комплементарным его последовательности-мишени, чтобы быть специфически гибридизируемым. Олигонуклеотид является специфически гибридизируемым, когда связывание этого олигонуклеотида с ДНК-мишенью или РНК мешает нормальной функции ДНК- или РНК-мишени, и имеется достаточная степень комплементарности для избегания неспецифического связывания этого олигонуклеотида с последовательностями, не являющимися мишенями, при условиях, в которых желаемым является специфическое связывание, например, при физиологических условиях в случае анализов или систем in vivo. Такое связывание называют специфической гибридизацией.

Условия гибридизации, приводящие к конкретным степеням строгости, будут варьироваться в зависимости от характера выбранного способа гибридизации и состава и длины гибридизующихся последовательностей нуклеиновых кислот. Обычно, температура гибридизации и ионная сила (особенно концентрация Na+ и/или Mg2+) буфера гибридизации будут способствовать строгости гибридизации, хотя периоды времени промывок также влияют на строгость. Расчеты в отношении условий гибридизации, требуемых для получения конкретных степеней строгости, обсуждаются в Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 и 11.

В данном контексте, фраза «строгие условия» включает в себя условия, при которых гибридизация будет осуществляться только в случае, если имеется меньшее, чем 50%, ошибочное спаривание между молекулой гибридизации и ДНК-мишенью. «Строгие условия» включают в себя дополнительно конкретные уровни строгости. Таким образом, в данном контексте, условиями «средней строгости» являются условия, при которых молекулы с более чем 50%, ошибочного спаривания последовательности, не будут гибридизироваться; условиями «высокой строгости» являются условия, при которых последовательности с более, чем 20%, ошибочного спаривания не будут гибридизироваться; и условиями «очень высокой строгости» являются условия, при которых более, чем 10% ошибочного спаривания, не будут гибридизироваться.

В конкретных вариантах осуществления строгие условия могут включать в себя гибридизацию при 65°C, с последующими промываниями при 65°C с использованием 0,1× SSC/0,1% SDS в течение 40 минут.

Далее следуют репрезентативные, не ограничивающие гибридизацию условия:

Очень высокая строгость: Гибридизация в буфере 5× SSC при 65°C в течение 16 часов; дважды в буфере 2× SSC при комнатной температуре в течение 15 минут каждый раз; и промывание дважды в буфере 0,5× SSC при 65°C в течение 20 минут каждый раз.

Высокая строгость: Гибридизация в буфере 5-6× SSC при 65