Способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду

Способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины и фтизиатрии, в частности к области лечения туберкулеза, и касается способа определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду в биологическом образце с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Уровень техники

Множественная лекарственная устойчивость штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ МЛУ), определяемая как устойчивость патогенов туберкулеза к препаратам первого ряда - рифампицину и изониазиду, является одной из основных проблем борьбы с туберкулезом во всем мире. В 2010 г. в мире насчитывалось около 650 тыс. больных туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), т.е. с устойчивостью к двум основным противотуберкулезным препаратам - рифампицину и изониазиду (WHO. Global Tuberculosis Control, 2011). Одной из основных причин, способствующих подъему заболеваемости туберкулезом, является широкое распространение именно лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий, устойчивых к одному из наиболее эффективных противотуберкулезных препаратов - рифампицину. Устойчивость штаммов МТБ к рифампицину примерно в 95% случаев сопровождается устойчивостью к изониазиду, что делает рифампицин в значительной мере маркером мультирезистентности, и определение устойчивости к рифампицину имеет наибольшее значение для выбора адекватной терапии.

Классические методы определения лекарственной чувствительности МБТ основаны на культивировании на питательной среде с антибиотиками. Основным методом определения чувствительности МБТ к химиопрепаратам остается посев бактериологического материала на среду Левейштейна-Йенсена (Л-Й), содержащую различные концентрации антибиотиков. Данный метод довольно длителен и занимает 1-2 месяца до получения результата, полученные результаты становятся не всегда актуальными для назначения пациенту адекватного лечения. Современные автоматизированные системы, использующие жидкую питательную среду ВАСТЕС MGIT (Becton Dickinson), сокращают сроки получения результата до 7-14 дней, но кардинально не позволяют обеспечить экспресс-анализ определения чувствительности к рифампицину и изониазиду [1].

Развитие молекулярно-биологических методов открыло новые перспективы диагностики лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза, основанные на анализе последовательностей ДНК Mycobacterium, поскольку для ряда препаратов первого ряда известны гены, в участках которых мутации приводят к возникновению резистентности. Известно, что у 92-95% рифампицинустойчивых штаммов МБТ резистентность связана с мутациями в гене rpoB, который кодирует бета-субъединицу ДНК-зависимой РНК-полимеразы (мишенью для RIF в микробной клетке). 95-96% мутаций в rpoB расположено в коротком участке 81 пн (между кодонами 426-453 по современной номенклатуре [2] в области, детерминирующей устойчивость к рифампицину), при этом более 85% мутаций выявлено в трех кодонах 435, 445, 450 [3]. По данным секвенирования генома МБТ устойчивость к изониазиду определяется в основном при наличии мутаций в таких генах, как: katG, inhA, ahpC и kasA. Причем, наличие мутации в кодоне 315 гена katG определяет устойчивость к изониазиду в более чем 81% случаев МТБ МЛУ (см. изобретение № 2200323). Вклад мутаций в остальных генах составляет около 14-17%. Поэтому анализ работы каждого из генов важен для понимания механизма резистентности МБТ к изониазиду. Таким образом, по литературным данным, выявление мутаций в данных генах определяет чувствительность к изониазиду для 95-96% штаммов МБТ (предыдущее). Однако согласно данным авторов настоящего изобретения и других авторов при генетическом анализе доминирующих в московском и санкт-петербургском регионах штаммов МБТ МЛУ пекинских подтипов (Beijing) [4], наличие мутаций в кодоне 315 гена katG и/или промоторной области гена inhA в позиции -15 и -17 обеспечивает выявляемость устойчивости к изониазиду у приблизительно 98% штаммов МТБ МЛУ, тогда как мутации в генах ahpC и kasA являются вторичными.

Применение молекулярно-генетических методов детекции генетических детерминант устойчивости, не требующих длительного выращивания чистой культуры, позволяет решить проблему детекции мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду, и создания на этой основе экспресс-диагностики МБТ МЛУ. В настоящее время предлагаются многочисленные методы определения мутаций в rpoB либо путем определения факта их наличия (PCR-SSCP [5], RNA/RNA mismatch [6]), либо путем выявления конкретных мутаций (дот-блот [7], InnoLIPA [8], микрочипы [9] и HRM анализ [10]), при этом предпочтительным методом остается прямое секвенирование ДНК. Недостатками указанных методов являются большая трудоемкость и длительность, сложность и/или высокая стоимость оборудования и не всегда превосходная воспроизводимость и интерпретируемость результата. Кроме того, современные коммерческие наборы для выявления МТБ МЛУ, такие как биочипы, INNO-LiPA, Genotype MTBDR, GeneXpert MTB/RIF, довольно ограниченно могут использоваться в клинико-лабораторной практике. В частности, важными недостатками наборов на основе биочипов является трудоемкость, низкая производительность (один чип на анализируемый образец), а также затруднение интерпретации результатов при анализе клинических образцов, содержащих смесь микобактерий дикого и мутантного штаммов. Применение HRM-анализа in mass для быстрой детекции мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость у микобактерий туберкулеза, довольно сложно представить из-за неоднозначной интерпретации результатов, а также недостаточно высокой воспроизводимости результатов, что особенно важно в клинической практике. Недостатками GeneXpert MTB/RIF являются определение лекарственной устойчивости только к одному рифампицину, а также очень высокая стоимость расходных материалов. INNO-LiPA и Genotype MTBDR трудоемки и многостадийны, т.к. включают несколько стадий постамплификационных процедур, что требует использования для предотвращения внутрилабораторной контаминации дополнительных изолированных помещений.

Прототипом заявленного способа определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду для экспресс-детекции мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду является метод генотипического анализа штаммов M.tuberculosis при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени c использованием "молекулярных беконов", флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов [11]. При этом олигонуклеотидный зонд гибридизуется с продуктом ПЦР-амплификации только при отсутствии в нем мутации и выделяет флуоресцентное излучение. Основным недостатком прототипа является проведение ПЦР-реакции в режиме “одна матрица и один гибридизационный зонд“, что означает постановку нескольких ПЦР в отдельных пробирках, что трудоемко и крайне неудобно. Кроме того, в прототипе применяются сравнительно длинные (24-30 нуклеотидов) олигонуклеотидные зонды, нет информации о принципах подбора зондов разного GC состава для проведения ПЦР в одном температурном режиме и эффективной гибридизации зондов к матрицам (ампликонам). Разная стабильность олигонуклеотидных комплексов повышенной длины и разного GC-состава приводит к разной селективности комплексообразования некоторых зондов с матрицей ампликонов. Кроме того, селективное комплексообразование олигонуклеотидов одинаковой длины может быть реализовано только в определенных для каждого олигонуклеотида условиях (например, концентрация, температура).

Также в прототипе был выбран зонд на позиции -8 вместо -15/-17 промоторной области гена inhA, которая не содержит диагностическую мутацию и тем самым не обеспечивает достаточный уровень выявляемости мутаций устойчивости к изониазиду.

Еще одним прототипом заявленного способа является способ выявления анализируемой последовательности ДНК, предусматривающий ее гибридизацию с зондами с малобороздочными лигандами с укороченной длиной до 15-22 нуклеотидов, комплементарных участкам того же размера в последовательности ДНК вирусов семейства Arenaviridae и вирусов Ebola семейства Filoviridae [12].

В данном способе стабилизация ДНК-дуплексов (зонд и комплементарный участок ДНК) достигается дополнительным комплексообразованием с A-T-специфичными малобороздочными лигандами (МБЛ). МБЛ сами по себе повышают специфичность связывания зондов с комплементарными нуклеотидными последовательностями-мишенями при гибридизации за счет повышения термостабильности образующихся комплексов. Для повышения температуры плавления ДНК-дуплексов в МБЛ были использованы двухцепочечные олигопиррольные лиганды с антипараллельной ориентацией олигокарбоксамидных цепей, поскольку такие лиганды обеспечивают наибольшую термостабильность дуплексов. Однако в случае детекции мутаций гена rpoB задача поиска дискриминирующих зондов существенно осложняется при анализе близких по структуре нуклеотидных последовательностей (высокая консервативность участка), что, в частности, имеет место в структуре анализируемых последовательностей участка гена rpoB. Помимо этого, в отношении подбора зондов для дискриминации указанных последовательностей патогенов существуют дополнительные сложности, связанные с высокой консервативностью участков геномов рода Mycobacterium, с одной стороны, и вариабельностью нуклеотидных последовательностей, вызванных наличием дополнительных нуклеотидных замен, с другой стороны.

Таким образом, существует потребность в улучшенных способах определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду в биологическом образце, в которых были бы устранены недостатки известных способов, в частности в способах определения близко расположенных мутаций устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду в биологическом образце, где указанный способ включает одновременную детекцию в ДНК микобактерий биологического образца мутаций, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, в участках гена rpoB, гена katG и промоторной области гена inhA посредством мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) в режиме реального времени с использованием зондов детекции, которые комплементарны указанным участкам генов rpoB, katG и промоторной области гена inhA, не содержащим мутацию. В частности, указанный способ включает одновременную детекцию мутаций, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, в по меньшей мере в одном участке каждого из гена rpoB, гена katG и промоторной области гена inhA.

В предпочтительном варианте осуществления указанный биологический образец представляет собой непосредственно материал клинического образца или предварительно выращенную культуру микроорганизмов, более предпочтительно, клинический образец представляет собой мокроту, экссудат, смыв или бронхо-альвеолярный лаваж.

В еще одном аспекте способ по изобретению может быть проведен для более чем одного клинического образца.

Согласно одному из вариантов заявленного изобретения указанные участки выбраны из группы, включающей кодоны 430, 431, 445, 450 и 452 гена rpoB, кодон 315 гена katG, -15/-17 позицию промоторной области гена inhA или их комбинации.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения указанные зонды детекции представляют собой зонды длиной 12-18 нуклеотидов с добавлением малобороздочных лигандов для детекции мутаций в кодонах 445, 450 и 452 гена rpoB, и зонды длиной 20-24 нуклеотидов без добавления малобороздочных лигандов для детекции мутаций в кодонах 430-431 и 435 гена rpoB, кодоне 315 гена katG и -15/-17 позиции гена inhA.

Настоящее изобретение также относится к применению способа по изобретению для подтверждения клинического диагноза туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору зондов детекции для осуществления способа по изобретению, в котором указанные зонды включают последовательности, представленные в SEQ ID NO:1-5.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к способу определения устойчивости микобактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в биологическом образце, где указанный способ включает одновременную детекцию в ДНК микобактерий биологического образца мутаций, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, в участках гена rpoB, гена katG и промоторной области гена inhA посредством МПЦР-амплификации в режиме реального времени.

Принцип заявленного способа основан на использовании процесса мультиплексной ПЦР-амплификации ДНК, заключающегося в повторяющихся циклах температурной денатурации одной или нескольких разных матриц ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей элонгации полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой.

В смесь для амплификации вносятся гибридизационные зонды, содержащие флуоресцентные метки, позволяющие детектировать генетические варианты дикого типа в кодонах 445, 450 и 452 гена rpoB. При этом к зондам добавлены малобороздочные лиганды для уменьшения длины зондов и увеличения специфичности гибридизации. Нуклеотидный состав и размер зондов c малобороздочными лигандами (МБЛ, MGB) и гасителями (BHQ) может различаться, что существенно не влияет на их гибридизацию с матрицей ДНК. Например, предлагается зонд к кодону 450 для детекции предоминантной мутации устойчивости к рифампицину. Зонд выбирается так, чтобы не захватывать кодон 452, в котором тоже может быть мутация:

SEQ ID NO: 1: Fl -1-ACTACTGTCGGCG-MGB--BHQ как вариант 1, где Fl -1 - флуорофор.

Возможно также использовать последовательность зонда со сдвигом вправо на один нуклеотид, тогда как сдвиг влево или вправо на большее число нуклеотидов приведет к ухудшению стабилизации дуплекса или пространственным затруднениям из-за близости другого зонда:

SEQ ID NO: 2: Fl -1-CTACTGTCGGCG-MGB--BHQ как вариант 2.

Чтобы избежать пространственных осложнений при гибридизации близкорасположенных зондов возможен более предпочтительный вариант 3, при котором используется зонд, комплементарный (-) цепи ДНК матрицы, такой как:

SEQ ID NO: 3: Fl -1-CAGCGCCGACAGT-MGB-BHQ (вариант3).

Зонды детекции близкорасположенных мутаций в позициях 445 и 452

SEQ ID NO: 4: Fl -2--CGGGGTTGACCCACA-MGB-BHQ

SEQ ID NO: 5: Fl -3-ACTGTCGGCGCTG -MGB-BHQ

являются предпочтительными при постановке вместе c зондом, комплементарным кодону 450.

Остальные зонды без добавления малобороздочных лигандов используются для детекции наличия или отсутствия мутаций в кодонах 430 и 435 гена rpoB, кодоне 315 гена katG и -15 позиции гена inhA. Об отсутствии генетической мутации (вариант дикого типа) судят по наличию кривой накопления с высокой эффективностью прироста флуоресценции при экспоненциальном росте кривой специфического продукта с эффективностью прироста флуоресенции не менее 90%. Отсутствие кривой накопления либо низкая эффективность прироста флуоресценции в пробе свидетельствуют о наличии мутации определённого типа. Положительные контроли дикого типа свидетельствуют о детекции набором вариантов дикого типа и позволяют исключить ложноположительные результаты. Для одновременной детекции наличия или отсутствия мутаций все реакции ПЦР-амплификации проводятся в одном температурном режиме. Положительные контроли мутаций позволяют выявлять образцы MTB, содержащие мутации определённого типа, и свидетельствуют об отсутствии ложноотрицательных результатов. Отрицательные контроли позволяют исключить кросс-контаминацию образцов и неспецифические реакции. В образцах, не содержащих ДНК MTB, результат должен быть отрицательным.

Задача выявления устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину решается при помощи мультиплексной ПЦР-амплификации специфических мутаций устойчивости к рифампицину в кодонах 435, 445, 450 и 452 гена rpoB, а также в кодоне 430, ранее не используемом для детекции мутаций. Добавление последней к известному набору мутаций устойчивости к рифампицину позволяет увеличить выявляемость в устойчивых штаммах МБТ на 2-3%. Выявление устойчивости МБТ к изониазиду обеспечивается детекцией предоминантной мутации в кодоне 315 гена katG и заменами в позициях -15/-17 промоторной области гена inhA, что является минимально достаточным набором мутаций для выявления не менее 97,5% устойчивых изониазиду штаммов МБТ. Предлагаемый нами способ и выбранный набор детектируемых мутаций позволяет одновременное определение устойчивости к рифампицину и изониазиду с общей выявляемостью не ниже 97%, что выше, чем у аналогичных коммерческих тест–систем GeneXpert MTB/RIF, INNO-LiPA, Genotype MTBDR и др. Выбранный алгоритм позволяет проводить быстрое определение множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза путем анализа наличия мутаций среди минимально достаточного набора из восьми диагностически значимых мутаций. Одновременно проводится реакции ПЦР-амплификации c гибридизационными зондами на детекцию наиболее представленных мутаций в кодонах 435, 445, 450 и 452 в гене rpoB. При этом выявляются мутации в первых и вторых основаниях данных кодонов, что обеспечивает выявляемость >97% рифампицинустойчивых штаммов. В другой реакционной смеси одновременно и в тех же температурных условиях можно проводить реакции мультиплексной ПЦР-амплификации для детекции наличия или отсутствия мутаций в кодоне 430 гена rpoB, кодоне 315 гена katG и -15/-17 позиций промоторной области гена inhA, что позволяет выявлять >97% изониазидустойчивых штаммов.

Предлагаемый авторами подход с использованием МБЛ ранее не применялся для создания гибридизационных зондов детекции мутаций, определяющих устойчивость к рифампицину и изониазиду. Авторы предлагают к применению короткие (12-18-нуклеотидные) гибридизационные зонды с добавлением малобороздочных лигандов, что позволяет специфично узнавать близкорасположенные нуклеотидные последовательности кодонов 435, 445, 452 гена rpoB на наличие мутаций устойчивости к рифампицину.

Также авторами предложено проводить отбор олигонуклеотидных зондов без малой бороздки и длиной 20-24 нт для гибридизации с участками генов katG и inhA, что существенно дешевле зондов с малобороздочными лигандами. Однако в данном случае приходится предварительно подбирать варианты зондов, обеспечивающих оптимальную температуру плавления дуплексов, образуемых зондами и комплементарными им участками ДНК. Частичное выравнивание температур плавления дуплексов, образуемых анализируемой ДНК и отобранными олигонуклеотидными зондами, достигалось изменением протяжённости (укорачивании или удлинении) последних. Использованный в настоящей работе температурный интервал выбран равным 2-3 градуса (от 66 до 69°С), чтобы обеспечить специфичную гибридизацию всех зондов в одном температурном режиме в одной мультиплексной ПЦР. Модифицированные подобным образом зонды для каждого из выбранных участков комплементации зондов также подвергали проверке на наличие в последовательностях дополнительных однонуклеотидных полиморфизмов.

В настоящем способе предлагается проводить мультиплексную ПЦР-амплификацию с использованием нескольких специфичных зондов на одну или несколько матриц. При этом авторами решена задача дифференцировать близкорасположенные кодоны 450 и 452, 430 и 435 гена rpoB на одной матрице амплификации, а также возможность детектировать близкорасположенные мутации -15 и -17 промоторной области гена inhA, мутации устойчивости к изониазиду.

Основные преимущества предлагаемого способа заключаются в следующем:

- одновременное и быстрое определение наличия/отсутствия мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду, в частности, непосредственно после выделения ДНК МБТ из клинического образца;

- необходимость только оборудования для проведения стандартной ПЦР-амплификации в режиме реального времени;

- экспресс-диагностика (1,5 часа от момента выделения ДНК до получения результата);

- простая и однозначная интерпретация результатов по наличию/отсутствию кривых накопления;

- возможность быстрого анализа больших количеств образцов ДНК микобактерий туберкулеза на наличие МЛУ.

- существенное сокращение (за счёт значительного увеличения термостабильности гибридных ДНК-дуплексов) длины используемых зондов олигонуклеотидов;

- увеличение количества зондов против матрицы ампликона гена rpoB для детекции большего количества нуклеотидных замен;

- возможность определения наличия или отсутствия мутаций в восьми позициях трех генов, снизить процент ложноотрицательных результатов за счет детекции дополнительных мутаций, а также обеспечивается снижение себестоимости анализа и сокращение времени его проведения;

- обеспечивается легкий подбор единого, унифицированого температурного режима для проведения мультиплиплексной ПЦР-амплификации при одновременной детекции мутаций в генах rpoB, katG и inhA.

Представленный способ позволяет проводить эффективную ПЦР-диагностику и посттерапевтический мониторинг случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ основан на ПЦР-амплификации фрагментов генов rpoB, katG и промоторной области гена inhA методом двустадийной ПЦР-амплификации с одновременной детекцией продуктов амплификации гибридизационными зондами с малобороздочным лигандом и гасителем на 3'-конце и флюоресцентно меченным 5'-концом с последующей регистрацией и интерпретацией результатов детекции. В частности, способ предусматривает использование на стадии ПЦР включение детекции не на первых циклах амплификации, что позволяет преамплифицировать немеченый продукт небольшого размера для повышения чувствительности детекции. Размеры амплифицированных фрагментов ДНК при использовании предложенной пары праймеров составляют около 127 п.о. для katG, 138 п.о. для гена rpoB. ПЦР-амплификацию проводят, используя ДНК, выделенную из материала клинических образцов, включая мокроту, экссудат, смыв или бронхо-альвеолярный лаваж. Детекцию мутантных или диких форм МТБ проводят при помощи гибридизационных зондов с малобороздочными лигандами. Такие зонды размером 12-18 нт, комплементарные дикому типу, т.е. немутантным вариантам нуклеотидных последовательностей, позволяют с высокой специфичностью детектировать точечные мутации в участке гена rpoB и дифференцировать кодоны 430, 435, 445 , 450 и 452. Порядок расположения олигонуклеотидов обеспечивает возможность визуально оценить наличие мутации и ее точную локализацию. Разработанные условия ПЦР-амплификации согласно протоколу «МЛУ ТИПИРОВАНИЕ» обеспечивают высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами и позволяют осуществлять процедуру в условиях ординарной диагностической лаборатории. Интерпретацию зарегистрированных результатов выполняют путем сравнения интенсивности флюоресценции сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Способ может быть применен для эпидемиологического генотипирования.

На основе способа определения нуклеотидных замен в ДНК предложен способ диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду. Для оптимизации детекции мутаций в низконагруженных образцах в данном изобретении предлагается проводить МПЦР-амплификацию по протоколу с преамплификацией.

Протокол «МЛУ ТИПИРОВАНИЕ» с преамплификацией, в котором денатурация при 95,0°C проходит 7 мин., далее 9 циклов без чтения флуорофоров в режиме 95,0°C при 15 сек, 62,0°C при 20 сек, 72,0°C при 15 сек, далее 25 циклов с чтением флуорофоров в режиме 95,0°C при 15 сек, 66,0°C при 40 сек, окончательная элонгация - 72,0°C при 6 мин.

Проведение МПЦР без преамплификации, но при той же температуре отжига (66,0°C) позволяет детектировать мутации только в образцах с бактериальной нагрузкой более 500 KOE/мл, что существенно ограничит эффективность детекции.

Реакции ПЦР-амплификации выполняют на термоциклерах с оптическим блоком для детекции флуоресценции CFX96 (Bio-Rad, US), или ДТ-96 (ДНК-технологии, Россия), или аналогичных. Качество реакции ПЦР-амплификации считают приемлемым при выполнении следующих условий:

- эффективность реакции амплификации больше 90% (Е>0,8);

- разница между значениями Ct для повторяющихся точек калибровочной кривой не превышает 0,5 цикла;

- отсутствие неспецифичных продуктов амплификации.

Непосредственно ПЦР в режиме «реального времени» с последующим анализом детекции гибридизационными зондами проводят при смешивании равного количества тестируемого образца ДНК и 1Х реакционной смеси. ПЦР проводят в объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис-HCl (pH 8,9), 16 мМ сульфат аммония, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% Твин 20, 0,2 мМ дНТФ, 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров (Rpo11 5'-GACGTGGAGGCGATCACAC-3' и Rpo12 5'-GGCACGCTCACTTGACAGAC-3'), специфичные зонды и 3 ЕД/акт Taq-полимеразы (Fermentas). Реакцию проводят на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США) по указанному протоколу «МЛУ ТИПИРОВАНИЕ». Алгоритм интерпретации результатов представлен в Таблице 1.

Варианты проведения мультиплексной ПЦР-амплификации для определения чувствительности или устойчивости к рифампицину и изониазиду по предлагаемому способу.

I. Вариант определения мутаций устойчивости к рифампицину.

Для этого проводят мультиплексную ПЦР-амплификацию с тремя зондами и праймерами для ПЦР-амплификации фрагмента гена rpoB. Материал для реакции - чистая ДНК достаточно хорошего качества и количества от 0.2 до 10 нг. Проводят три одновременных реакции, направленные на детекцию наиболее распространенных мутаций устойчивости к рифампицинцину в кодонах 450, 435и 445 гена rpoB. Фрагмент длиной 138 пн амплифицируется консервативными праймерами и служит для контроля качества реакции ПЦР (ложноотрицательных результатов). Следующие праймеры были использованы для трех реакций M-ПЦР для анализа трех кодонов гена rpoB: два праймера, прямой (5'-GACGTGGAGGCGATCACAC) и обратный (5'-TGACCCGCGCGTACAC), и зонды R435 (5'-CAATTCATGGaccag-3), или R445 (5'-CGGGGTTGACCCACA-MGB-BHQ2), или R450 (5'-ACTGTCGGCGCTG-MGB-BHQ1). Все ПЦР-реакции проводятся в одинаковых условиях по протоколу «МЛУ ТИПИРОВАНИЕ».

II. Вариант ПЦР-амлификации для одновременной детекции мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду.

Материал для реакции - ДНК из клинических образцов мокроты (пробы с малым количеством ДНК МТБ ). Сначала проводится амплификация фрагмента rpoB длиной 138 пн при 17 циклах ПЦР без детектирования зондами. Далее проводят одновременно три специфические ПЦР-реакции с детектированием зондами при 30 циклах, в которых используют в качестве субстрата продукт первой ПЦР амплификации. При проведении ПЦР-амплификации ДНК образцов разной бактериальной нагруженности необходимо параллельно ставить положительные контроли мутантного и дикого типа, а также отрицательные контроли на отсутствие контаминации. Очищенная ДНК (0,1-0,5 мкл) или клеточный лизат (7-10 мкл) доводится до 12 мкл водой и добавляется в 2-кратную реакционную смесь (конечный объем 30 мкл), содержащую 5 пмоль каждого из праймеров, 5-10 пмоль каждого зонда, 1,5 мM MgCl₂, 2-4 ЕД. Taq ДНК полимеразы (MBI Fermentas), и 200 μМ каждого из дНТФ. Все ПЦР-реакции проводятся в одинаковых условиях по протоколу «МЛУ ТИПИРОВАНИЕ».

По предлагаемому способу одновременно в МПЦР-анализе можно поставить до 46 клинических образцов и 4 контроля. Число анализируемых образцов ограничивается лишь емкостью 96-луночной платформы ПЦР-РВ машины.

Как показано в таблице 1, предлагаемый способ детекции позволяет выявлять и интерпретировать результаты ПЦР-анализа по отсутствию или наличию кривых накопления в ходе проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени, что отражает наличие или отсутствие мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду. Предлагаемый способ может быть применен для быстрого подтверждения клинического диагноза туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.

Таблица 1Алгоритм интерпретации результатов МЛУ типирования с использованием предлагаемого способа детекции МТБ МЛУ
Исследуемый образец	Положительный контроль дикого типа	Положительный контроль мутации	Отрицательный контроль	Интерпретация
кривая накопления с высокой эффективностью прироста флуоресценции	кривая накопления с высокой эффективностью прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления либо кривая имеет низкую эффективность прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления	дикий тип (wt)
отсутствие кривой накопления либо кривая имеет низкую эффективность прироста флуоресценции	кривая накопления с высокой эффективностью прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления либо кривая имеет низкую эффективность прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления	мутация –наличиеустойчивости к антибиотику
кривая накопления с высокой эффективностью прироста флуоресценции	кривая накопления с высокой эффективностью прироста флуоресценции	кривая накопления с высокой эффективностью прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления	невалидный результат (ложноотрицательный)
отсутствие кривой накопления либо кривая имеет низкую эффективность прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления либо кривая имеет низкую эффективность прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления либо кривая имеет низкую эффективность прироста флуоресценции	отсутствие кривой накопления	невалидный результат (ложноположи-тельный)
Отсутствие кривых накопления одновременно по всем мишеням либо значение Ct более 19-20	не учитывается	не учитывается	не учитывается	невалидный результат

Техническим результатом настоящего изобретения является одновременное и быстрое определение устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду с высокой выявляемостью (общая выявляемость не ниже 97%). Также техническим результатом является возможность быстрого анализа больших количеств образцов ДНК микобактерий туберкулеза на наличие МЛУ. Дополнительно, техническим результатом также является возможность использовать для определение устойчивости микобактерий туберкулеза не только ДНК, выделенную из выросших культур МБТ, но также ДНК, выделенную непосредственно из биологических секретов (мокрота, БАЛ) полученных от больных с разными формами туберкулеза.

Примеры

Пример 1

Анализ проб из 191 изолятов, монокультур, выделенных из клинических образцов был проведен слепым методом с использованием ПЦР. Во всех случаях результаты анализа ДНК из тех же штаммов совпадали с фенотипическими данными.

10-12 мкл очищеной ДНК, выделенной из изолятов сорбцией на магнитных частицах коммерческим набором Promega, добавляли в 2-кратную реакционную смесь (конечный объем 30 мкл), содержащую 5 пмоль каждого из праймеров, 5-10 пмоль каждого зонда, 1.5 мМ MgCl₂, 3 ед. Taq ДНК полимеразы (MBI Fermentas), и 200 мкМ каждого из дНТФ. Все ПЦР-реакции проводятся в одинаковых условиях по протоколу без преамплификации: 95,0°C при 7 мин, 95,0°C - 15 сек, 66,0°C при 40 сек, на 45 циклах. Конечная элонгация - при 72,0°C, 6 мин.

По результатам детекции мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду предложенным способом и верификации секвенированием некоторых изолятов были определены диагностические характеристики (чувствительность и специфичность), как представлено в таблицах 2а и 2б.

Таблица 2аДиагностические характеристики детекции мутаций устойчивости к рифампицину на выборке изолятов предлагаемым способом
Фенотип	Кол-во изолятов	ПЦР+	rpoBL430 /P/Q (%)	rpoBD435/V /Y(%)	rpoBH445/D/Y (%)	rpoBS450 /L (%)	rpoBL452 /P	Чувствительность/Специфичность(%)
Rif-R	130	128	4 (3,1)	12(9,3)	4(3,1)	114(84,3)	1	98,5
Rif-S	61	53*	-	-	-	-	-	100,0

Таблица 2бДиагностические характеристики детекции мутаций устойчивости к изониазиду на выборке изолятов предлагаемым способом
Фенотип	Кол-во изолятов	ЦР+	katGS315T(%)	inhAc-15t(%)	KatG S351T +inhA c-15t	KatG S351T +inhAa-17g	Чувствительность/ Специфичность(%)
INH-R	130	126	113 (89,7)	13 (10,3)	21	3	97,0
INH-S	61	53*	-	-	-	-	100,0
* - использовались только валидные образцы, т.е. при значении Ст < 32.

Таким образом, предлагаемый способ при проверке на выборке из 191 изолятов, выделенных из больных туберкулезом, обеспечивает диагностическую эффективность определения основных мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду выше чем 97,0%.

Пример 2

Определение мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду предложенным способом при МПЦР-анализе ДНК, выделенной из 67 мокротных клинических образцов больных туберкулезом, фенотипически устойчивых к рифампицину и изониазиду (МТБ МЛУ), и 45 чувствительных к рифампицину и изониазиду, выделенных от эпидемиологически несвязанных больных в 2012-2014 гг. (ЦНИИТ, Москва).

Проводили МПЦР-амплификацию добавлением 12 мкл тестируемого образца ДНК и равного количества 1Х реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (pH 8,9), 16 мМ сульфат аммония, 1,5 мМ MgCl₂, 0,01% Твин 20, 0,2 мМ дНТФ, 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, специфичные зонды и 3 ЕД Taq-полимеразы (MBI Fermentas). Реакцию проводили на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США) по указанному протоколу «МЛУ ТИПИРОВАНИЕ» с преамплификацией: денатурация при 95,0°C проходит 7 мин, далее 9 циклов без чтения флуорофоров в режиме 95,0°C при 15 сек, 62,0°C при 20 сек, 72,0°C при 15 сек, далее 25 циклов с чтением флуорофоров в режиме 95,0°C при 15 сек. 66,0°C при 40 сек, окончательная элонгация – при 72,0°C, 6 мин.

В результате в 65 из 67 образцов (97,0%) МТБ МЛУ были выявлены мутации как минимум в одном из пяти анализировавшихся кодонов гена rpoB (Таблица 3). Мутации в гене katG и промоторной области гена inhA были выявлены в 66/67 (98,5%) образцов МТБ МЛУ. Таким образом, предложенный способ обеспечивает высокую чувствительность определения устойчивости к рифампицину и изониазиду в клинических образцах больных туберкулезом с разной бактериальной нагрузкой – не менее 97.5% в клинических образцах мокроты больных туберкулезом. Следует отметить, что генетическое определение устойчивости к рифампицину на основе мутаций в кор участке детерминирования устойчивости гена rpoB в принципе не обеспечивает 100% определение чувствительности, так как не выявляет те редкие штаммы, которые имеют другие мутации вне данного участка. Анализ 45 образцов, чувствительных к рифампицину и изониазиду, методом МПЦР не выявил мутации в анализируемых кодонах генов rpoB; таким образом, специфичность метода составила 100,0%. Данные результатов определения устойчивости или чувствительности к рифампицину и изониазиду для каждого из клинических образцов мокроты по предлагаемому способу представлены в Таблице 3.

Т