Способ диагностики и прогноза при гиперпролиферативных заболеваниях молочной железы

Способ диагностики и прогноза при гиперпролиферативных заболеваниях молочной железы

Реферат

ОБЛАСТЬ НАУКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ.

Изобретение относиться к области медицины, в частности онкологии, и наиболее эффективно может быть предназначено для лабораторной диагностики рака молочной железы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ.

Рак молочной железы на сегодняшний день является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний в женской популяции. Данное заболевание также лидирует в причине смертности от злокачественных новообразований у женщин и составляет 17,1%, обусловливая основную долю онкологической смертности в возрастных группах 40-69 лет, 85 лет и старше (Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2011). Одновременно необходимо отметить, что достаточно большие успехи достигнуты в ранней диагностике и скрининге РМЖ, что позволило значительно увеличить количество заболеваний, выявляемых на ранних стадиях (Харченко В.П., Рожкова Н.И.).

В настоящее время клиницисты располагают достаточно широким арсеналом диагностических возможностей, однако, в целом необходимо признать, что существующие сегодня методы как дооперационной оценки характера и распространенности заболевания, так и послеоперационной верификации и стадирования РМЖ малоэффективны в отношении прогноза безрецидивной и общей выживаемости, что, несомненно, предопределяет интуитивный выбор клинициста в пользу более агрессивной тактики терапии как попытку компенсировать системные прогностические ошибки при использовании «классических факторов прогноза» (Ст Гален, 2011). Именно поэтому все большее внимание уделяется изучению биологии опухоли и поиску более чувствительных молекулярных маркеров для дифференциальной диагностики, прогноза прогрессирования и рецидивирования РМЖ.

Наиболее сложным для дифференциальной диагностики злокачественного процесса в молочной железе, а именно рака молочной железы, представляются заболевания, сопровождающиеся гиперпролипролиферативными процессами, поскольку типичные критерии для злокачественных заболеваний для них нехарактерны. Малая невыраженная симптоматика требует дополнительных критериев диагностики. Именно к ним можно отнести ряд молекулярно-генетических показателей, характерных для гиперпролиферативных процессов. Спектр подобных состояний достаточно широко представлен в классификации ВОЗ (гистологическая классификация ВОЗ 2003 год).

Одним из фундаментальных свойств злокачественной клетки является нарушение контроля пролиферативной активности и апоптоза, проявляющаяся, в частности, в повышении активности генов активаторов пролиферации и ингибиторов апоптоза. Изменение активности экспрессии генов, определяемое на уровне мРНК или белка, описано, например, в патенте US 2009/0286856 A1 «Method of diagnosing breast cancer», основанном на анализе-710 генов, в патенте US 2010/ 7,662,580 Tissue diagnostics for breast cancer, где для диагностики рака молочной железы используются 4 гена fcytokeratin 19, cathepsin D, ezrin, and slc9a3rl, а в патенте US2008/ 7,348,142 Cancer diagnostic panel - приводится способ создания панели для диагностики злокачественной патологии.

НЕДОСТАТКИ ИЗВЕСТНОГО СПОСОБА: недостатком способа, описанного в патенте US 2009/0286856 A1, является необходимость использования технологии «чипов», в основе которой лежит метод гибридизации, для которого характерна относительно низкая чувствительность, что обусловливает низкую эффективность диагностики, Недостатком способа, описанного в патенте US2010/ 7,662,580, является также низкая диагностическая чувствительность, связанная, по-видимому, с характеристиками входящих в диагностический комплекс генов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Изобретение относится к онкологии области медицины. Предназначено для диагностики начала развития злокачественного опухолевого процесса молочных желез на основе определения относительного уровня мРНК генов: Ki67, Aurca, BIRC5, CCNB1, ММР11, MGB1.

Общий алгоритм использования молекулярно-генетических исследований уровня экспрессии мРНК генов заключается в следующем. После получения биопсийного, операционного материала или жидкости из образования проводится определение уровня экспрессии генов Ki67, Aurca, BIRC5, CCNB1, ММР1, MGB1. Параллельно проводится цитологическое или гистологическое исследование полученного материала.

1. При получении заключения о злокачественной природе процесса (раке молочной железы) по данным морфологических методов далее поступают согласно имеющимся клиническим стандартам для лечения данной нозологии.

2. При получении морфологического заключения о доброкачественной природе процесса или «не информативности» полученного материала анализируют данные молекулярно-генетических исследований. В случае увеличения экспрессии одного и более генов из группы: Ki67, Aurca, BIRC5, CCNB1, ММР1, MGB1 в два и более раза по сравнению со средними значениями, приведенными в таблице 2 для группы фиброаденом, делается заключение о возможной злокачественной природе процесса и назначается проведение повторного забора биопсийного материала (а в случае операционного материала более тщательное его исследование). При многократном получении неинформативных морфологических исследований может быть дана рекомендация на проведение минимального хирургического вмешательства со срочным гистологическим исследованием или проведение динамического наблюдения с периодичностью не реже раза в 3 месяца.

Определение уровня экспрессии (относительного количества мРНК соответствующего гена) осуществляется относительно гена HPRT1 с использованием наборов производства фирмы ЗАО «ДНК Технология» Россия согласно инструкции производителя с использованием количественного амплификатора ДТ96, производства ЗАО «ДНК Технология».

Существенным отличием заявляемого решения от известного является использование шести высокоспецифических для ткани рака молочной железы гена-маркера.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

В основу изобретения положено исследование 154 образцов ткани молочной железы, из них 57 образцов рака молочной железы (РМЖ) 1-1 V стадии, 57 образцов неизмененной ткани молочной железы в качестве контрольной группы и 40 образцов ткани фиброаденомы и простой протоковой гиперплазии (далее ФА). В группу больных раком молочной железы вошли больные в возрасте от 36 до 87 лет, средний возраст составил 57,2±11,6 лет. По гистологическому строению в 63% случаев опухоль представляла собой инфильтративный протоковый рак. Более чем в 70% размер первичной опухоли не превышал 5 см. Все пациентки проходили обследование и получали лечение в хирургических отделениях ФГБУ Российский Научный Центр Рентгенрадиологии в период с ноября 2008 по июль 2011 года. Патоморфологическое исследование проводилось в соответствии с гистологической классификацией опухолей молочной железы (ВОЗ, 2004 г.). Оценка степени злокачественности РМЖ проводилась в соответствие с критериями Elston-Ellis Scarff-Bloom-Richardson.

Выделение РНК проводили согласно инструкции с помощью наборов реагентов для выделения РНК RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, USA). Реакцию обратной транскрипции ставили, используя наборы НПО «ДНК Технология» согласно инструкции. Для контроля отсутствия амплификации на геномной ДНК ставили ПЦР с образцами, не прошедшими реакцию обратной транскрипции (ОТ). Уровень экспрессии генов определялся в относительных единицах по сравнению с уровнем экспрессии референсного гена HPRT с помощью наборов для количественного ПЦР фирмы ЗАО «ДНК Технология» согласно инструкции производителя на ДНК амплификаторе ДТ96 производства ЗАО «ДНК Технология.

Таблица 1
Наименование исследованных генов согласно номенклатуре HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) database и их идентификационный номер GCID.
Наименование гена в тексте	Наименование в базе HUGO	Идентификационный номер GCID
MGB1 (маммаглобин)	secretoglobin, family 2A	GC11P062038
ММР11	matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3)	GC22P024110
Aurca	aurora kinase A, STK15	GC20M054377
CCNB1	cyclinBl	GC05P068462
BIRC5	baculoviral IAP repeat containing 5	GC17P076210
Ki67	antigen identified by monoclonal antibody Ki67	GC10M129824

В таблице 1 приводятся характеристики используемых генов, включенных в диагностическую панель.

Нами было получено, что для ткани РМЖ характерно увеличение уровня экспрессии мРНК генов, ответственных за процессы пролиферации -Ki67, Aurca, CCNB1.

Уровень экспрессии гена ММР11 также повышается в ткани РМЖ. ММР1 (матриксная металлопротеаза) - поверхностная молекула клетки способна расщеплять элементы межклеточного матрикса, принимает участие в активации/инактивации цитокинов и регулировании апоптоза. Однако основной функцией ММР11 является участие в процессах миграции и клеточной адгезии.

При РМЖ происходит также увеличение экспрессии маммаглобина, особенно важно, что наибольшее повышение уровня экспрессии характерно для 1-2 стадии РМЖ, что делает этот показатель важным для дифференцировки начальных стадий рака. Уровень BIRC5 антиапоптотического гена возрастает и достоверно выше, чем в неизмененной ткани молочной железы. BIRC5 кодирует белок, который принадлежит к семейству ингибиторов апоптоза, действуя путем инактивации каспаз. Повышенная экспрессия белка описана для большого количества злокачественных опухолей, но практически отсутствует в дифференцированных клетках.

Таким образом, данная панель генов отражает основные характеристики процессов, происходящие в клетках эпителия молочной железы при злокачественной трансформации: в группе РМЖ увеличивается уровень экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации (Ki67, Аurса, CCNB1), увеличивается уровень экспрессии проапоптотического гена, что является молекулярной основой развития злокачественных пролиферативных заболеваний.

В таблице 2 приводятся средние значения относительной экспрессии генов Ki67, Aurca, BIRC5, CCNB1, ММР1, BCL2, NDRG1 и достоверность их отличия в ткани РМЖ и фиброаденомы и простой протокой гиперплазии (ФА).

Показатель (ген)	Среднее РМЖ	Среднее ФА	t-value	P
MGB 1 (маммаглобин)	77683,78	13120,05	2,244351	0,026849
KI 67	115,34	21,10	2,972018	0,004125
Aurca(STK15)	230,16	52,54	2,093814	0,040122
BIRC5 (survivm)	113,66	15,96	2,090608	0,040478
CCNB1 (cyclinBl)	54,45	13,89	2,016180	0,047854
MМР1 (stromolysin3)	237,78	18,51	2,051907	0,044090

На рисунке 1 проиллюстрированы отличия значений уровней экспрессии в нормальной ткани молочной железы, ткани фиброаденомы и рака молочной железы.

Способ диагностики рака молочной железы на основании анализа уровня экспрессии 6 генов MGB1, Ki67, Aurca, BIRC5, CCNB1, ММР11 в ткани молочной железы, при этом, если уровень относительной экспрессии относительно гена HPRT1 для одного или нескольких из этих генов превышает значения соответственно: 13120,05; 21,1; 52,54; 15,96; 13,89; 18,51, делается заключение о злокачественной природе процесса и рекомендуется провести биопсию ткани для получения морфологического подтверждения и/или проведения специфического лечения.