Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей с brachyury

Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей с brachyury

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается преимущество приоритета согласно 35 U.S.C. §119(e) временной заявки США с серийным номером № 61/453656, поданной 17 марта 2011 года. Полное содержание временной заявки США с серийным номером № 61/453656, поданной 17 марта 2011 года, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ПРАВА ПРАВИТЕЛЬСТВА

Настоящее изобретение осуществлено в соответствии с выполнением Соглашения о совместном исследовании и разработке с National Institutes of Health, Agency of the Department of Health and Human Services. Правительство США имеет определенные права на это изобретение.

ЗАЯВЛЕНИЕ, КАСАЮЩЕЕСЯ СОГЛАШЕНИЯ О СОВМЕСТНОМ ИССЛЕДОВАНИИ

Настоящее изобретение было осуществлено сторонами или от имени сторон Соглашения о совместном исследовании и разработке, подписанном 8 мая 2008 года. Сторонами Соглашения о совместном исследовании и разработке являются: GlobeImmune, Inc. и U.S. Department of Health and Human Services, который представлен National Cancer Institute, an Institute, Center or Division of the National Institutes of Health.

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка включает список последовательностей, предоставленный в электронном виде в качестве текстового файла через EFS-Web. Текстовый файл под названием "3923-34-PCT_ST25" имеет размер в байтах 76 кБайт, и он был записан 13 марта 2012 года. Информация, содержащаяся в текстовом файле, включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме согласно 37 CFR § 1.52(e)(5).

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, главным образом, относится к иммунотерапевтическим композициям на основе дрожжей и к способам профилактики и/или лечения злокачественных опухолей, характеризующихся экспрессией или сверхэкспрессией Brachyury.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Brachyury, также известный как "T", является мезодермальным фактором транскрипции и представителем комплекса генов T-box. Ген, кодирующий Brachyury (обозначаемый либо как ген T, либо как ген Brachyury, у человека) был первоначально идентифицирован в 1927 году Nadine Dobrovolskaïa-Zavadskaïa посредством мутации у мышей, которая влияла на длину хвоста и крестцовые позвонки у гетерозиготных животных. Ген Brachyury был клонирован у мышей в 1990 году Hermann и коллегами (Herrmann et al., 1990, Nature 343:617-622) и у человека в 1996 году Edwards и коллегами (Edwards et al., 1996, Genome Res. 6:226-223), которые также описали установленную аминокислотную последовательность Brachyury человека.

В качестве представителя семейства факторов транскрипции T-box, Brachyury содержит высоко консервативный мотив ДНК-связывающего домена, называемый "T-box" или T-доменом, который связывается с палиндромной консенсусной последовательностью. Было показано, что Brachyury, подобно другим белкам T-box, играет роль в раннем развитии, и является жизненно важным для формирования и дифференцировки задней мезодермы и развития осевых структур у позвоночных (см., например, Wilkinson et al., 1990, Nature 343(6259):657-659); Beddington et al., 1992, Development (Suppl.):157-165; Schulte-Merker et al., 1994, Development 120: 1009-1015; Kispert and Herrmann, 1994, Dev. Biol. 161:179-193; Showell et al., 2004, Dev Dyn 229:201-218). Позднее, Palena и коллеги продемонстрировали, что Brachyury экспрессируется в различных опухолевых тканях и злокачественных линиях человека, и показали, что пептиды Brachyury можно использовать для получения специфичных к Brachyury линий T-клеток у нормальных доноров и пациентов со злокачественной опухолью (Palena et al., 2007, Clin. Cancer Res. 13(8):2471-2478). Исследования Fernando et al. показали, что Brachyury стимулирует эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) в опухолевых клетках человека, сообщая опухолевым клеткам мезенхимальный фенотип, а также способности к миграции и инвазии, одновременно ослабляя прогрессирование клеточного цикла опухолей (Fernando et al., 2010, J. Clin. Invest. 120(2):533-544). Таким образом, Brachyury вовлечен в метастатическое прогрессирование злокачественной опухоли.

Злокачественная опухоль является ведущей причиной смертности по всему миру и разработка эффективных способов терапии злокачественной опухоли продолжает быть одной из наиболее активных областей исследований и клинической разработки. Хотя было предложено множество инновационных подходов для лечения и профилактики злокачественной опухоли, многие злокачественные опухоли продолжают иметь высокий уровень смертности, и могут с трудом поддаваться лечению, или могут быть относительно неотвечающими на общепринятые способы терапии. Злокачественные опухоли, ассоциированные с экспрессией Brachyury, могут быть найдены в различных тканях, включая молочную железу, тонкий кишечник, желудок, почку, мочевой пузырь, матку, яичник, яичко, легкое, толстый кишечник и предстательную железу, и включают метастатические злокачественные опухоли и злокачественные опухоли поздней стадии. Кроме того, Brachyury экспрессируется в опухолях B-клеточного происхождения, таких как хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), трансформированные вирусом Эпштейна-Барр B-клетки, лимфома Беркитта и лимфома Ходжкина. Таким образом, Brachyury, по-видимому, играет роль в большом количестве злокачественных опухолей человека. Хотя Brachyury был предложен в качестве мишени для иммунотерапии злокачественной опухоли (см., например, Palena et al., выше, Fernando et al., выше, и WO 2008/106551), поскольку он является относительно новой мишенью при злокачественной опухоли, в данной области остается потребность в новых иммунотерапевтических продуктах, которые эффективно лечат и/или предупреждают злокачественные опухоли, ассоциированные с экспрессией или сверхэкспрессией Brachyury.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один вариант осуществления изобретения относится к способу снижения, остановки, обращения вспять, замедления или предупреждения метастатического прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуума со злокачественной опухолью. Способ включает стадию введения индивидууму со злокачественной опухолью, которая претерпевает метастатическое прогрессирование, имеет риск метастатического прогрессирования, или начинает, согласно прогнозам, претерпевать метастатическое прогрессирование, иммунотерапевтическую композицию, содержащую: (a) дрожжевой носитель; и (b) антиген злокачественной опухоли, содержащий по меньшей мере один антиген Brachyury. Другой вариант осуществления изобретения относится к применению иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и антиген злокачественной опухоли, содержащий по меньшей мере один антиген Brachyury, для снижения, остановки, обращения вспять или предупреждения метастатического прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуума со злокачественной опухолью.

В одном аспекте этих вариантов осуществления изобретения Brachyury не выявляется в злокачественной опухоли индивидуума, когда композицию вводят впервые. В одном аспекте экспрессия Brachyury выявляется в злокачественной опухоли индивидуума, когда композицию вводят впервые. Индивидуум может иметь злокачественную опухоль стадии I, злокачественную опухоль стадии II, злокачественную опухоль стадии III или злокачественную опухоль стадии IV.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу предупреждения или замедления появления опухоли, экспрессирующей Brachyury. Способ включает стадию введения индивидууму иммунотерапевтической композиции, содержащей: (a) дрожжевой носитель; и (b) антиген злокачественной опухоли, содержащий по меньшей мере один антиген Brachyury. Другой вариант осуществления изобретения относится к применению иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и антиген злокачественной опухоли, содержащий по меньшей мере один антиген Brachyury, для предупреждения или замедления появления злокачественной опухоли, экспрессирующей Brachyury.

В одном аспекте этих вариантов осуществления злокачественная опухоль не выявляется у индивидуума. В одном аспекте индивидуум имеет высокий риск развития злокачественной опухоли (например, вследствие генетической предрасположенности). В одном аспекте индивидуум имеет предзлокачественный очаг повреждения.

В одном аспекте этих вариантов осуществления индивидуум имеет злокачественную опухоль, однако в злокачественной опухоли не выявляются злокачественные клетки, экспрессирующие Brachyury. В одном аспекте злокачественная опухоль еще не является метастазирующей. В одном аспекте злокачественная опухоль имеет высокий риск метастазирования. В одном аспекте индивидуум имеет злокачественную опухоль стадии I. В одном аспекте индивидуум имеет злокачественную опухоль стадии II.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу уменьшения или предупреждения устойчивости к химиотерапии или устойчивости к лучевой терапии опухолевых клеток у пациента со злокачественной опухолью. Способ включает стадии введения индивидууму со злокачественной опухолью, которому проводят химиотерапию и/или лучевую терапию, иммунотерапевтической композиции, содержащей: (a) дрожжевой носитель; и (b) антиген злокачественной опухоли, содержащий по меньшей мере один антиген Brachyury. Другой вариант осуществления изобретения относится к применению иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и антиген злокачественной опухоли, содержащий по меньшей мере один антиген Brachyury, для снижения или предупреждения устойчивости к химиотерапии или устойчивости к лучевой терапии опухолевых клеток у пациента со злокачественной опухолью. В одном аспекте этого варианта осуществления изобретения Brachyury не выявляется в злокачественной опухоли индивидуума, когда композицию вводят впервые. В одном аспекте экспрессия Brachyury выявляется в злокачественной опухоли, когда композицию вводят впервые.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения злокачественной опухоли. Способ включает стадии: (a) введение индивидууму со злокачественной опухолью, у которого экспрессия Brachyury не выявляется, первой иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и первый антиген злокачественной опухоли, который не содержит антиген Brachyury; и (b) введение индивидууму до, одновременно или после введения первой иммунотерапевтической композиции второй иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и второй антиген злокачественной опухоли, содержащий антиген Brachyury. В одном аспекте способ дополнительно включает на стадии (a) введение одной или нескольких дополнительных иммунотерапевтических композиций, где каждая из одной или нескольких дополнительных иммунотерапевтических композиций содержит дополнительный антиген злокачественной опухоли. В одном аспекте любого из описанных выше вариантов осуществления антиген злокачественной опухоли выбран из: мутантного Ras, карциноэмбрионального антигена (CEA), MUC-1, EGFR, BCR-Abl, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GAGE, GP-100, MUC-2, PSMA, тирозиназы, TRP-1 (gp75), NY-ESO-1, TRP-2, TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, hTERT, p73, B-RAF, антигена аденоматозного полипоза толстого кишечника (APC), Myc, белка фон Гиппеля-Ландау (VHL), Rb-1, Rb-2, рецептора андрогенов (AR), Smad4, MDR1, Flt-3, BRCA-1, BRCA-2, pax3-fkhr, ews-fli-1, HERV-H, HERV-K, TWIST, мезотелина и NGEP. В одном аспекте антиген злокачественной опухоли выбран из группы, состоящей из: мутантного Ras, карциноэмбрионального антигена (CEA) и MUC-1. Другой вариант осуществления изобретения относится к применению комбинации иммунотерапевтических композиций для лечения злокачественной опухоли, причем иммунотерапевтические композиции содержат: (a) первую иммунотерапевтическую композицию, содержащую дрожжевой носитель и первый антиген злокачественной опухоли, который не содержит антиген Brachyury; и (b) вторую иммунотерапевтическую композицию, содержащую дрожжевой носитель и второй антиген злокачественной опухоли, содержащий антиген Brachyury.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения злокачественной опухоли. Способ включает стадии: (a) введение индивидууму со злокачественной опухолью первой иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и мутантный антиген Ras; (b) введение индивидууму согласно (a) второй иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и антиген, выбранный из группы, состоящей из карциноэмбрионального антигена (CEA) и муцина-1 (MUC-1); и (c) введение индивидууму (a) и (b) третьей иммунотерапевтической композиции, содержащей дрожжевой носитель и антиген Brachyury. В одном аспекте стадии введения в (a), (b) и (c) являются одновременными. Другой вариант осуществления изобретения относится к применению комбинации иммунотерапевтических композиций для лечения злокачественной опухоли, причем иммунотерапевтические композиции содержат: (a) первую иммунотерапевтическую композицию, содержащую дрожжевой носитель и мутантный антиген Ras; (b) вторую иммунотерапевтическую композицию, содержащую дрожжевой носитель и антиген, выбранный из группы, состоящей из карциноэмбрионального антигена (CEA) и муцина-1 (MUC-1); и (c) третью иммунотерапевтическую композицию, содержащую дрожжевой носитель и антиген Brachyury.

В любом из вариантов осуществления или аспектов изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, когда индивидуум имеет злокачественную опухоль или предзлокачественную опухоль, в одном аспекте изобретения индивидуума лечат или лечили другим способом терапии злокачественной опухоли. Например, такой способ терапии может включать, но не ограничиваться ими, химиотерапию, направленную терапию злокачественной опухоли, лучевую терапию, адоптивный перенос T-клеток и/или введение одной или нескольких дополнительных иммунотерапевтических композиций. В одном аспекте дополнительная иммунотерапевтическая композиция содержит дрожжевой носитель и второй антиген злокачественной опухоли, который не включает антиген Brachyury. Второй антиген злокачественной опухоли может включать, но не ограничиваться ими, мутантный Ras, карциноэмбриональный антиген (CEA), MUC-1, EGFR, BCR-Abl, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GAGE, GP-100, MUC-2, PSMA, тирозиназу, TRP-1 (gp75), NY-ESO-1, TRP-2, TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, hTERT, p73, B-RAF, белок аденоматозного полипоза толстого кишечника (APC), Myc, белок фон Гиппеля-Ландау (VHL), Rb-1, Rb-2, рецептор андрогенов (AR), Smad4, MDR1, Flt-3, BRCA-1, BRCA-2, pax3-fkhr, ews-fli-1, HERV-H, HERV-K, TWIST, мезотелин и NGEP. В одном аспекте второй антиген злокачественной опухоли выбран из: мутантного Ras, карциноэмбрионального антигена (CEA) и MUC-1.

В одном аспекте любого из вариантов осуществления или аспектов изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, способ или применение снижают опухолевую нагрузку у индивидуума, повышают выживаемость индивидуума и/или ингибируют рост опухоли у индивидуума.

В одном аспекте любого из вариантов осуществления или аспектов изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, способ дополнительно включает хирургическое удаление опухоли из индивидуума.

В одном аспекте любого из вариантов осуществления или аспектов изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, злокачественная опухоль имеет происхождение из эпителиальных клеток. В одном аспекте злокачественная опухоль может включать, но не ограничиваться ими, рак молочной железы, рак тонкого кишечника, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак мочевого пузыря, рак тела матки, рак яичника, рак яичка, рак легкого, рак толстого кишечника, рак предстательной железы, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), трансформированные вирусом Эпштейна-Барр B-клетки, лимфому Беркитта, лимфому Ходжкина или их метастатические злокачественные опухоли.

В одном аспекте любого из вариантов осуществления или аспектов изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, антиген Brachyury представляет собой полноразмерный Brachyury человека. В одном аспекте антиген Brachyury является неполноразмерным Brachyury. В одном аспекте антиген Brachyury имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит по меньшей мере от положения 1 или 2 вплоть до от положения 255 до C-конца SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит по меньшей мере от положения 1 или 2 вплоть до от положения 430 до C-конца SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит положения 246-254 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 6, положения 2-435 SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 18, положения 2-435 SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 18. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 2, положения 2-435 SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 6, положения 2-435 SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 6. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 18, положения 2-435 SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 18. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 2, положения 2-435 SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген злокачественной опухоли имеет длину по меньшей мере 25 аминокислот. В одном аспекте антиген Brachyury имеет длину по меньшей мере 25 аминокислот. В одном аспекте антиген Brachyury имеет длину более 30 аминокислот. В одном аспекте антиген злокачественной опухоли содержит два или более иммуногенных домена Brachyury.

В одном аспекте любого из вариантов осуществления или аспектов изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, антиген злокачественной опухоли представляет собой слитый белок. В одном аспекте слитый белок имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 8. В одном аспекте слитый белок имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 20, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 20.

Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury, где иммунотерапевтическая композиция содержит: (a) дрожжевой носитель; и (b) антиген, экспрессируемый дрожжевым носителем и содержащий по меньшей мере один антиген Brachyury, где антиген Brachyury содержит более 30 аминокислот аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген содержит Brachyury от по меньшей мере положения 1 или 2 вплоть до от положения 255 до C-конца SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит от по меньшей мере положения 1 или 2 вплоть до от положения 430 до C-конца SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит положения 246-254 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 6, положения 2-435 SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 18, положения 2-435 SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 18. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 2, положения 2-435 SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 6, положения 2-435 SEQ ID NO: 6, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 6. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 18, положения 2-435 SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 18. В одном аспекте антиген Brachyury содержит SEQ ID NO: 2, положения 2-435 SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 2. В одном аспекте антиген злокачественной опухоли представляет собой слитый белок. В одном аспекте слитый белок имеет аминокислотную последовательность, которая представляет собой SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 8. В одном аспекте слитый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 20. В одном аспекте дрожжевым носителем являются целые дрожжи. В одном аспекте целые дрожжи инактивированы нагреванием.

Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury, содержащей: (a) целые инактивированные дрожжи; и (b) слитый белок Brachyury, содержащий аминокислотную последовательность положений 2-435 SEQ ID NO: 6. Экспрессия слитого белка Brachyury находится под контролем промотора CUP1, слитый белок Brachyury экспрессируется дрожжами и композиция индуцирует специфичный к Brachyury T-клеточный ответ. В одном аспекте слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury, содержащей: (a) целые инактивированные дрожжи; и (b) слитый белок Brachyury, содержащий аминокислотную последовательность положений 2-435 SEQ ID NO: 18. Экспрессия слитого белка Brachyury находится под контролем промотора CUP1, слитый белок Brachyury экспрессируется дрожжами и композиция индуцирует специфичный к Brachyury T-клеточный ответ. В одном аспекте слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

В одном аспекте любого из вариантов осуществления или аспектов изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, дрожжевым носителем являются целые дрожжи. В одном аспекте целые дрожжи являются убитыми. В одном аспекте целые дрожжи являются инактивированными нагреванием. В одном аспекте дрожжи экспрессируют антиген. В одном аспекте дрожжи взяты из рода, выбранного из группы, состоящей из: Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces и Yarrowia. В одном аспекте дрожжи взяты из Saccharomyces. В одном аспекте дрожжи взяты из Saccharomyces cerevisiae.

В одном аспекте любого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше или где-либо еще в настоящем описании, композицию составляют в фармацевтически приемлемом эксципиенте, пригодном для введения индивидууму.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению любой из иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей с Brachyury, описанных в настоящем описании, для лечения заболевания. В одном аспекте заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В одном аспекте заболевание ассоциировано с инфекционным агентом. В одном аспекте заболевание ассоциировано с вирусом или вирусной инфекции. Такой вирус может включать, но не ограничиваться ими, вирус Эпштейна-Барр (EBV).

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения или профилактики заболевания или состояния, ассоциированного с инфекцией вирусом Эпштейна-Барр (EBV). Способ включает стадию введения индивидууму любых из иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей с Brachyury, описанных в настоящем описании.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу получения иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury. Способ включает стадии: (a) культивирование дрожжей, которые трансформированы рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген Brachyury под контролем промотора CUP1, в подходящей среде в отсутствие CuSO₄ до тех пор, пока дрожжи не достигнут середины логарифмической фазы роста; (b) индукция экспрессии антигена Brachyury в дрожжах путем добавления CuSO₄ в среду; (c) культивирование дрожжей после стадии (b) в течение вплоть до 6-8 часов; и (d) сбор дрожжей. В одном аспекте дрожжи на стадии (a) культивируют до плотности клеток от 1,0 до 2,0 Д.Е. на миллилитр общего объема культуры. В одном аспекте дрожжи на стадии (a) культивируют для плотности клеток от 1,0 до 1,5 Д.Е. на миллилитр общего объема культуры. В одном аспекте дрожжи культивируют на стадиях (a)-(c) в среде, где pH поддерживается на уровне pH 5,5 или выше. В одном аспекте способ дополнительно включает стадию инактивации нагреванием дрожжей после стадии (d). Например, в одном аспекте дрожжи инактивируют нагреванием при приблизительно 56°C в течение приблизительно 1 часа. В следующем аспекте этого варианта осуществления дрожжи можно составлять для инъекции с фармацевтически приемлемым эксципиентом. В одном аспекте дрожжи взяты из Saccharomyces. В одном аспекте дрожжи взяты из Saccharomyces cerevisiae.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A представлено оцифрованное изображение вестерн-блота, на котором показано выявление с помощью антитела против Brachyury экспрессии Brachyury в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury, в случае как среды U2, так и среды UL2.

На фиг.1B представлено оцифрованное изображение вестерн-блота, на котором показано выявление с помощью антитела против His экспрессиии Brachyury в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury, в случае как среды U2, так и среды UL2.

На фиг.2 представлено оцифрованное изображение вестерн-блота, демонстрирующее экспрессию Brachyury в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury, где варьировали плотность клеток при индукции антигеном и время до сбора после индукции антигеном.

На фиг.3A-3C представлены графики, на которых показано, что мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от двух из трех здоровых доноров, обработанные дрожжами с Brachyury посредством двух циклов стимуляции с последующей обработкой пептидом Brachyury CTL, были способны генерировать CD8⁺ CTL, которые могли уничтожать клетки карциномы SW480 (положительные по HLA-A2/высокая экспрессия Brachyury), при минимальном лизисе клеток карциномы MCF7 (положительные по HLA-A2/низкая экспрессия Brachyury); (фиг.3A, донор 07706; фиг.3B, донор 17663; фиг.3C, донор 26532).

На фиг.4A представлен график, на котором показано, что специфичные к Brachyury T-клетки из PBMC здорового донора, стимулированные иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей с Brachyury, специфически лизируют опухолевые клетки, которые имеют соответствующий MHC (SW480, положительные по HLA-A2/с высокой экспрессией Brachyury) относительно клеток карциномы H226 (отрицательные по HLA-A2/с высокой экспрессией Brachyury).

На фиг.4B представлен график, на котором показана экспрессия мРНК Brachyury относительно экспрессии мРНК контрольного гена (GAPDH) в клетках опухоли SW480 и H226, используемых в эксперименте, представленном на фиг.4A.

На фиг.5 представлен график, на котором показана пролиферация CD4⁺ T-клеток, выделенных из селезенки мышей, которых вакцинировали дрожжами с Brachyury (GI-6301, круги) или контрольными дрожжами (дрожжевой контроль, треугольники), в ответ на указанные дозы очищенного белка Brachyury или контрольного белка β-gal.

На фиг.6 представлен график, на котором показано, что введение иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей с Brachyury (GI-6301, круги) по изобретению проявляет тенденцию в отношении уменьшения экспрессирующих Brachyury опухолей у мышей по сравнению с мышами, которым вводили дрожжи отдельно (без антигена Brachyury).

На фиг.7A и 7B представлены данные анализа способом проточной цитометрии, демонстрирующие, что специфическая с Brachyury линия T-клеток T-2-BR-A связывается со специфичным к Brachyury тетрамером HLA-A2 (фиг.7B) и не связывается с контрольным тетрамером (фиг.7A).

На фиг.8 представлены данные анализа способом проточной цитометрии, демонстрирующие экспрессию перфорина в специфичной к Brachyury линии T-клеток T-2-BR-A после стимуляции с помощью обработанных пептидом-агонистом Brachyury аутологичных B-клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, главным образом, относится к иммунотерапевтическим композициям на основе дрожжей и способам профилактики и/или лечения злокачественных опухолей, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют Brachyury. Изобретение относится к применению иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей (также называемой иммунотерапией на основе дрожжей), содержащей дрожжевой носитель и антигены Brachyury или их иммуногенные домены (также называемой в настоящем описании "иммунотерапией на основе дрожжей с Brachyury" или "иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей с Brachyury"). Авторы изобретения описывают в настоящем описании конструирование и получение новых иммунотерапевтических продуктов на основе дрожжей с Brachyury, и демонстрируют, что иммунотерапия на основе дрожжей с Brachyury увеличивает в количестве специфичные к Brachyury T-клетки, в том числе CD8⁺ CTL, от нормальных индивидуумов и пациентов со злокачественной опухолью. Кроме того, у мышей, иммунизированных иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей с Brachyury, формировались специфичные к Brachyury T-клеточные ответы in vivo, и у этих мышей ингибировался рост опухоли, экспрессирующей Brachyury. Взятые вместе, эти данные, представленные в настоящем описании, демонстрируют, что иммунотерапия на основе дрожжей с Brachyury пригодна для индукции специфичных к Brachyury клеточных иммунных ответов (CD4⁺ и CD8⁺) и для профилактики и лечения экспрессирующих Brachyury опухолей, обеспечивая новую терапию для профилактики и/или лечения метастатических опухолей и ассоциированных с ними состояний.

Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей с Brachyury, пригодные в рамках настоящего изобретения, уникальным образом адаптированы для эффективного нацеливания на злокачественные опухоли, экспрессирующие Brachyury, по нескольким причинам. Во-первых, Brachyury вовлечен в процессы EMT, и, таким образом, без связи с теорией, авторы изобретения полагают, что он играет роль в опухолях поздней стадии и метастатических опухолях. Таким образом, в одном аспекте изобретения иммунотерапия на основе дрожжей с Brachyury является эффективной в отношении нацеливания на опухолевые клетки до момента или в момент, когда они начинают приобретать подвижность и инвазировать другие ткани, тем самым предупреждая, ингибируя, останавливая, обращая вспять или замедляя возникновение метастатической злокачественной опухоли и/или прогрессирование злокачественной опухоли, и особенно метастатической злокачественной опухоли. Существует значительная потребность в эффективных способах лечения злокачественных опухолей поздней стадии, особенно метастатических злокачественных опухолей, которые могут иметь мало вариантов лечения после неуспеха общепринятой терапии злокачественной опухоли. Дрожжи с Brachyury обеспечивают новый подход для лечения таких злокачественных опухолей или для замедления, ингибирования, обращения вспять или предупреждения их всецело. Кроме того, иммунотерапию на основе дрожжей с Brachyury можно использовать для предупреждения или замедления метастазирования злокачественной опухоли или прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуумов со злокачественной опухолью ранней стадии. В одном варианте осуществления терапия пригодна при злокачественных опухолях, которые имеют высокий уровень метастатического прогрессирования, и могут быть пригодны для остановки прогрессирования злокачественной опухоли. Более того, иммунотерапия на основе дрожжей с Brachyury пригодна у индивидуумов, которые имеют предраковый (предзлокачественный) очаг повреждения или опухоль, у индивидуумов, которые имеют высокий риск развития злокачественной опухоли, в частности злокачественной опухоли, которая имеет высокий уровень метастазирования, и даже у здоровых индивидуумов в качестве профилактического средства для предупреждения злокачественной опухоли, которое можно использовать совместно с другой профилактической иммунотерапией против злокачественной опухоли, как описано в настоящем описании.

Иммунотерапия на основе дрожжей с Brachyury также обеспечивает пользу индивидуумам, которым проводят другую терапию злокачественной опухоли, в том числе химиотерапию и лучевую терапию. Более конкретно, известно, что метастатические опухоли в некоторых случаях являются более устойчивыми к химиотерапии и/или лучевой терапии, чем первичные опухоли. Таким образом, иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей с Brachyury по изобретению можно использовать для ингибирования или снижения или устранения устойчивости к химиотерапии или устойчивости к лучевой терапии, которая может появляться в метастатической злокачественной опухоли, путем ингибирования экспрессии Brachyury в злокачественной опухоли (и, тем самым, ингибирования антипролиферативных влияний), и композиции по изобретению могут усиливать эффективность химиотерапии или лучевой терапии у индивидуума.

Иммунотерапию на основе дрожжей с Brachyury также можно использовать для лечения состояний или заболеваний, ассоциированных с экспрессией Brachyury, которые могут быть неонкологическими по своей природе, или которые могут предшествовать злокачественной трансформации. Например, Brachyury может активироваться в клетках, которые инфицированы инфекционным агентом, например, вирусом, таким как вирус Эпштейна-Барр (EBV). Таким образом, иммунотерапию на основе дрожжей с Brachyury можно использовать для лечения или профилактики любого заболевания или состояния, ассоциированного с экспрессией Brachyury, включая, но не ограничиваясь ими, инфекционные заболевания, такие как вирусная инфекция, включая, но не ограничиваясь ими, ассоциированные с EBV состояния (например, мононуклеоз).

Иммунотерапию на основе дрожжей с Brachyury также легко адаптировать для применения дополнительных опухолевых антигенов в той же дрожжевой композиции, или для применения в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами на основе дрожжей, которые нацелены на другие опухолевые антигены (последовательно или одновременно) или другие иммунотерапевтическими средствами и способами лечения/терапии злокачественной опухоли. Таким образом, иммунотерапию на основе дрожжей с Brachyury можно адаптировать к типу злокачественной опухоли, стадии злокачественной опухоли, степени злокачественной опухоли, антигенам, экспрессируемым опухолью, и общему медицинскому состоянию индивидуума (т.е. терапию легко персонализировать), и для индивидуума, который уже имеет злокачественную опухоль, ее можно модифицировать по мере прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуума для обеспечения максимальной эффективности различных стадий опухоли. Иммунотерапия на основе дрожжей с Brachyury обеспечивает возможность создания продуманных и эффективных индивидуализированных подходов для широкого профилактического и/или терапевтического лечения широкого диапазона злокачественных опухолей.

Композиции на основе дрожжей с Brachyury, описанные в настоящем описании, могут индуцировать врожденные иммунные ответы, а также адаптивные иммунные ответы против антигена-мишени (Brachyury), включая CD4-зависимые ответы TH17 и TH1 T-клеток и антигенспецифические ответы CD8⁺ T-клеток, которые включают ответы цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), во всех случаях без использования экзогенных адъювантов, цитокинов или других иммуностимулирующих молекул, многие из которых имеют проблемы токсичности. Кроме того, иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей с Brachyury ингибируют количества и/или функциональность регуляторных T-клеток (Treg), тем самым усиливая ответы эффекторных T-клеток, которые обычно могут подавляться, например, присутствием опухоли. Более того, полагают, что по сравнению с иммунотерапевтическими композициями, которые иммунизируют путем формирования антительных ответов, антигенспецифические, всеобъемлющие и мощные клеточные иммунные ответы, индуцируемые иммунотерапией на основе дрожжей с Brachyury, являются особенно эффективными при нацеливании на опухолевые клетки. Действительно, многочисленные исследования показали, что иммунотерапевтические подходы усиливаются, когда на опухолевые клетки осуществляют нацеливание CD8⁺ CTL, которые распознают пептиды опухоли в контексте молекул MHC класса I.

Иммунотерапия на основе дрожжей с Brachyury обладает высокой способностью активировать антигенпредставляющие клетки, и обладает уникальной способностью перекрестно стимулировать иммунный ответ, формируя ответы CD8⁺ CTL, которые, как правило, эффективны против опухолей, даже несмотря на условия, которые в ином случае могут быть подавляющей окружающей средой. Поскольку для этого типа иммунотерапии используется естественная способность антигенпредставляющей клетки представлять соответствующие иммуногены, н