Антитела анти-angptl3 и их применение

Антитела анти-angptl3 и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к антителам человека и антигенсвязывающим фрагментам антител человека, которые специфически связывают ангиопоэтин-подобный белок 3 (hANGPTL3) человека, и к терапевтическим методам применения указанных антител.

УРОВЕНЬТЕХНИКИ

[0002] Ген ангиопоэтин-подобного белка 3 (ANGPTL3) был идентифицирован в базе данных EST по сигнальным последовательностям и амфипатическим спиралям, а затем из библиотеки кДНК эмбриона печени/селезенки человека была выделена полная последовательность кДНК ANGPTL3 (см. Conklin et al., 1999, Genomics62:477-482). Прогнозируемый белок DANGPTL3 из 460 аминокислот содержит на 76% идентичную мышиному ANGPTL3 аминокислотную последовательность и имеет характерную структуру ангиопоэтинов; то есть сигнальный пептид, протяженный спиральный домен, которые прогнозируемо образует димерные или тримерные суперспирали, короткий пептидный линкер и глобулярный фибриноген-гомологичный домен (FD) (см. Conklin et al., 1999, supra). ANGPTL3 содержит 4 консервативных цистеиновых остатка задействованых во внутримолекулярных дисульфидных связях в FD; при этом ANGPTL3 не содержит ни двух дополнительных цистеинов, ни характерного связывающего кальций мотива, присутствующего в FD ангиопоэтинов (ANG; то есть ANG1, ANG2 и ANG4) (см. Conklin et al., 1999, supra), которые являются белковыми факторами роста, способствующими ангиогенезу. Кроме того, в отличие от ANG, ANGPTL3 не связывается с Tie2; тем не менее, возможно, что он также индуцирует ангиогенез, связываясь с интегрином α_vβ₃ через его С-терминальный FD (см. Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277:17281-17290).

[0003] Полные данные in vivo были получены в рамках модели аутбредных мышей КК, которые отличаются умеренным ожирением с аномально высокими уровнями инсулина, глюкозы и липидов в плазме, подобно сахарному диабету 2 типа у человека (см. Koishi et al., 2002, Nature Genetics 30:151-157). При этом у одной из сублиний мышей, KK/San, были обнаружены аномально низкие уровни липидов в плазме (гиполипидемия), которые наследовались как рецессивные по Менделю. Локус был локализован на хромосоме 4 и в итоге был идентифицирован как ген, кодирующий ANGPTL3, который в экзоне 6 содержал вставку нуклеотидной последовательности из 4 пн (см. Koishi et at., 2002, supra). Напротив, уровни липидов в плазме увеличивались после опосредованного аденовирусом переноса гена ANGPTL3 или после введения рекомбинантного человеческого ANGPTL3 мышам KK/San. Такой эффект не был вызван изменениями в генах, участвующих в синтезе холестерина, клиренсе липопротеинов или окислении NEFA (см. Koishi et al., 2002, supra). Кроме того, анализ in vitro рекомбинантного белка показал, что ANGPTL3 напрямую ингибирует активность липопротеинлипазы (LPL), что свидетельствует о том, что он является модулятором метаболизма липидов, регулирующим уровни триглицеридов липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) за счет ингибирования активности LPL (см. Shimizugawa et al., 2002, J б/о/ Chem 277(37):33742-33748). Продемонстрировано, что N-терминальный суперспиральный домен, особенно остатки 17-165 N-терминальной области, а не С-терминальный FD ANGPTL3, определяют его активность в отношении увеличения уровней триглицеридов в плазме у мышей (см. Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809).

[0004] Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности для ANGPTL3 человека приведены в последовательностях SEQ ID №:161 и 162, соответственно. Антитела к ANGPTL3 раскрываются, например, в W02008/073300 и патенте США 7,935,796.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В первом аспекте изобретения предлагаются полностью человеческие моноклональные антитела (mAb) и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются и нейтрализуют, ингибируют, блокируют, аннулируют, снижают по крайней мере один аспект активности человеческого ANGTPL3, в частности человеческого ANGTPL3 (SEQ ID №:161), или препятствуют ему. Активность ANGPTL3, которую можно нейтрализовать, ингибировать, блокировать, аннулировать, снижать или которой можно препятствовать с помощью антител настоящего изобретения или их фрагментов, включает, среди прочего, ингибирование активности ЛПЛ, индуцирование ангиогенеза и пр. В одном из осуществлений антитело настоящего изобретения или его фрагмент может нейтрализовать, ингибировать, блокировать, аннулировать, снижать активность hANGPTL3 или препятствовать ей, связываясь с эпитопом hANGPTL3, который напрямую задействован в целевой активности hANGPTL3. В другом осуществлении антитело настоящего изобретения или его фрагмент может нейтрализовать, ингибировать, блокировать, аннулировать, снижать активность hANGPTL3 или препятствовать ей, связываясь с эпитопом hANGPTL3, который напрямую не задействован в целевой активности hANGPTL3, но связывание с ним антитела или фрагмента стерически или конформационно ингибирует, блокирует, аннулирует, снижает целевую активность hANGPTL3 или препятствует ей. В еще одном осуществлении антитело настоящего изобретения или его фрагмент связывается с эпитопом hANGPTL3, который напрямую не задействован в целевой активности (например, ингибировании активности ЛПЛ, включая ангиогенез и пр.) hANGPTL3 (то есть неблокирующее антитело), но связывание с ним антитела или фрагмента приводит к повышению клиренса hANGPTL3 из кровообращения по сравнению с клиренсом hANGPTL3 в отсутствие антитела или его фрагмента, а значит, косвенно ингибирует, блокирует, аннулирует, снижает активность hANGPTL3 или препятствует ей. Клиренс hANGPTL3 из кровообращения может заметно повышаться за счет сочетания двух или более различных неблокирующих антител, которые не конкурируют друг с другом в процессе специфического связывания с hANGPTL3.

[0006] Антитела (Abs) могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или lgG4) или включать только антигенсвязывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')2 или scFv) и могут быть модифицированы с целью воздействовать на функциональность, например удалять остаточные эффекторные функции (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

[0007] В одном осуществлении настоящее изобретение включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146 и 180, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией, имеющей идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В другом осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит HCVR с аминокислотной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:2, 18, 34, 66, 82; 114 и 180. В другом осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID №:66.

[0008] В одном осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела включает вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154 и 188, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией, имеющей идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В другом осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела включает LCVR с аминокислотной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:10, 26, 42, 74, 90, 122 и 188. В другом осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID №:74.

[0009] В дальнейших осуществлениях антитело или фрагмент антитела включает пару последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 и 180/188. В одном осуществлении антитело или фрагмент антитела включает пару последовательностей HCVR и LCVR, выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 и 180/188. Еще в одном осуществлении антитело или фрагмент антитела включает пару последовательностей HCVR и LCVR, включающую SEQ ID №:66/74.

[0010] Во втором аспекте настоящего изобретения приводится антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотную последовательность определяющей комплементарной области 3 тяжелой цепи (HCDR3), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152 и 186, или ее существенно аналогичную последовательность с идентичностью последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и аминокислотную последовательность легкой цепи CDR3 (LCDR3), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160 и 194, или их существенно аналогичные последовательности с идентичностью последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, включающую SEQ ID №:8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160 или 186/194. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, включающую SEQ ID №:8/16, 24/32, 40/48, 72/80, 88/96, 120/128 или 186/194. Еще в одном осуществлении антитело или фрагмент антитела включает пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, включающую SEQ ID №:72/80.

[0011] В дальнейшем осуществлении антитело или его фрагмент содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи CDR1 (HCDR1), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148 и 182, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и аминокислотную последовательность тяжелой цепи CDR2 (HCDR2), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150 и 184, или его существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и может также содержать аминокислотную последовательность легкой цепи CDR1 (LCDR1), включающей SEQ ID №:12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156 и 190, или ее существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и/или аминокислотную последовательность легкой цепи CDR2 (LCDR2), выбираемую из группы, включающей SEQ ID №:14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158 и 192, или ее существенно аналогичную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.

[0012] В альтернативном варианте настоящее изобретение описывает антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, содержащие сочетание последовательностей тяжелой цепи HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбираемое из группы, включающей SEQ ID №:4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 116/118/120, 132/134/136, 148/150/152 и 182/184/186; и/или сочетание последовательностей легкой цепи LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбираемое из группы, включающей SEQ ID №:12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 124/126/128, 140/142/144, 156/158/160 и 190/192/194. В одном осуществлении аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей CDR составляют сочетание последовательностей CDR, выбираемое из группы, включающей SEQ ID №:4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 и 182/184/186/190/192/194. В одном осуществлении аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей CDR составляют сочетание последовательностей CDR, выбираемое из группы включающей SEQ ID №:4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 116/118/120/124/126/128 или 182/184/186/190/192/194. В еще одном осуществлении аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей CDR составляют сочетание последовательностей CDR, включающее SEQ ID №:68/70/72/76/78/80.

[0013] В связанном осуществлении настоящего изобретения приводится антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связывает hANGPTL3, где антитело или его фрагмент содержит домены тяжелой и легкой цепей CDR, содержащиеся в парах последовательностей HCVR/LCVR, выбираемых из группы, включающей SEQ ID №:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 and 180/188. Методы и способы идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR известны специалистам и могут применяться для идентификации CDR в указанных аминокислотных последовательностях HCVR или LCVR, раскрываемых в настоящем документе. Для определения границ CDR могут использоваться общепринятые определения, в том числе, определения по Кабату, определения по Чотиа и определения AbM. В общих чертах, определение по Кабату опирается на вариабельность последовательности, определение по Чотиа основано на локализации структурных петлевых областей, а определение АЬМ представляет собой нечто среднее между подходами Кабата и Чотиа. См., например, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et at., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); и Martin et al., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Для идентификации последовательностей CDR в антителе также доступны открытые базы данных. В одном осуществлении антитело или фрагмент антитела включает последовательности CDR, содержащиеся в паре HCVR и LCVR, включающей SEQ ID №:2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 и 180/188. Еще в одном осуществлении антитело или фрагмент антитела включает последовательности CDR, содержащиеся в паре HCVR и LCVR, включающей SEQ ID №:66/74.

[0014] В еще одном связанном осуществлении настоящего изобретения представлено антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые конкурируют за специфическое связывание с hANGPTL3 с антителом или фрагментом антитела, содержащим последовательности тяжелой и легкой цепей CDR, содержащиеся в паре последовательностей HCVR/LCVR, выбираемых из группы, включающей SEQ ID №:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 и 180/188. В еще одном осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела настоящего изобретения конкурирует за специфическое связывание с hANGPTL3 с антителом или его фрагментом, содержащим пару последовательностей HCVR/LCVR, выбираемых из группы, включающей SEQ ID №:66/74. В еще одном осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела настоящего изобретения конкурирует за специфическое связывание с hANGPTL3 с антителом или его фрагментом, содержащим сочетание последовательностей тяжелой и легкой цепей CDR, выбираемое из группы, включающей SEQ ID №:4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 and 182/184/186/190/192/194. В одном осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела настоящего изобретения конкурирует за специфическое связывание с hANGPTL3 с антителом или его фрагментом, содержащим сочетание последовательностей тяжелой и легкой цепей CDR, выбираемое из группы, включающей SEQ ID №:68/70/72/76/78/80.

[0015] В еще одном связанном осуществлении настоящего изобретения представлено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с тем же эпитопом на hANGPTL3, который идентифицируется антителом или его фрагментом, содержащим последовательности тяжелой и легкой цепей CDR из пары последовательностей HCVR/LCVR, выбираемых из группы, включающей SEQ ID №:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 или 180/188. В одном осуществлении антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела настоящего изобретения связывается с тем же эпитопом на hANGPTL3, который идентифицируется антителом или его фрагментом, содержащим пару последовательностей HCVR/LCVR, выбираемых из группы, включающей SEQ ID №:66/74. В одном осуществлении антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения связывается с тем же эпитопом на hANGPTL3, который идентифицируется антителом или его фрагментом, содержащим сочетание последовательностей тяжелой и легкой цепей CDR, выбираемое из группы, включающей 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112,116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 и 182/184/186/190/192/194. В одном осуществлении такой эпитоп идентифицируется антителом или его фрагментом, содержащим сочетание последовательностей тяжелой и легкой цепей CDR, выбираемое из группы, включающей SEQ ID №:68/70/72/76/78/80.

[0016] В третьем аспекте настоящего изобретения представлено изолированное антитело анти- hANGPTL-3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом, расположенным в N-терминальной суперспиральной области в остатках 17-209 последовательности SEQ ID №:161, и нейтрализует, ингибирует, аннулирует, сокращает как минимум одну из функций hANGPTL3 или препятствует ей. В еще одном осуществлении настоящего изобретения представлено изолированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с эпитопом, расположенным в N-терминальной суперспиральной области hANGPTL3 (SEQ ID №:161), и нейтрализует, ингибирует, аннулирует, сокращает как минимум одну из функций hANGPTL3 или препятствует ей, при условии, что антитело или его фрагмент не связывается с пептидом ANGPTL3 из SEQ ID №:170 (соответствует остаткам с Glu32 по Leu57 hANGPTL3 из SEQ ID №:161). В одном осуществлении антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения специфически связывается с эпитопом в остатках 17 -200, 17-100, 17-70, 17-65, 17-60, 17-57 или 17-50 hANGPTL3 (SEQ ID №:161), может быть, при условии, что антитело или его фрагмент не связывается с пептидом ANGPTL3 из SEQ ID №:170. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент специфически связывается с эпитопом в остатках 40-200, 40-100, 40-70, 50-200, 50-100, 50-70, 58-200,58-100, 58-70, 58-68 или 61-66 hANGPTL3 (SEQ ID №:161), может быть, при условии, что антитело или его фрагмент не связывается с пептидом ANGPTL3 из SEQ ID №:170. В некоторых осуществлениях антитело или его фрагмент связывается с эпитопом, возможно, при участии более чем одного пронумерованного эпитопа или остатка в N-терминальной суперспиральной области hANGPTL3, может быть, при условии, что антитело или его фрагмент не связывается с пептидом ANGPTL3 из SEQ ID №:170.

[0017] В четвертом аспекте настоящего изобретения приводятся молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела анти-ANGPTLS или их фрагменты, в частности любые из описанных выше. Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, и клетки-хозяева, например бактериальные клетки, такие как E. coli, или клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, в которые включаются такие векторы, а также методы приготовления антител путем культивирования клеток-хозяев в условиях, допускающих производство антител и получение произведенных таким образом антител.

[0018] В одном осуществлении настоящего изобретения приводится антитело или его фрагмент, содержащие HCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145 и 179, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит HCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:1, 17, 33, 65, 81, 113 или 179. Веще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит HCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №:65.

[0019] В одном осуществлении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит LCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153 и 187, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит LCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:9, 25, 41, 73, 89, 121 или 187. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит LCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №:73.

[0020] В дальнейших осуществлениях антитело или фрагмент антитела включает пару последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), кодируемую парой последовательностей нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/121, 129/137, 145/153 и 179/187. В одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит пару последовательностей HCVR/LCVR, кодируемую парой последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID №:1/9, 17/25, 33/41, 65/73, 81/89, 113/121 или 179/187. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит пару последовательностей HCVR/LCVR, кодируемую парой последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID №:65/73.

[0021] В одном осуществлении настоящего изобретения приводится антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие домен HCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151 и 185, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен LCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159 и 193, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит пару последовательностей HCDR3 и LCDR3, кодируемую парой последовательностей нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/111, 119/127, 135/143, 151/159 и 185/193. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит пару последовательностей HCDR3 и LCDR3, кодируемую парой последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID №:7/15, 23/31, 39/47, 71/79, 87/95, 119/127 или 185/193. В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент содержит пару последовательностей HCDR3 и LCDR3, кодируемую парой последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID №:71/79.

[0022] В еще одном осуществлении антитело или его фрагмент далее содержит домен HCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147 и 181, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен HCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149 и 183, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и может также содержать домен LCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155 и 189, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и/или домен LCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбираемой из группы, включающей SEQ ID №:13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157 и 191, или существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.

[0023] В альтернативном варианте настоящее изобретение содержит антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, содержащие сочетание последовательностей тяжелой цепи HCDR1/HCDR2/HCDR3, кодируемое сочетанием нуклеотидной последовательности, выбираемым из группы, включающей SEQ ID №:3/5/7, 19/21/23, 35/37/39, 51/53/55, 67/69/71, 83/85/87, 99/101/103, 115/117/119, 131/133/135, 147/149/151 и 181/183/185; и/или сочетание последовательностей легкой цепи LCDR1/LCDR2/LCDR3, кодируемое сочетанием нуклеотидной последовательности, выбираемым из группы, включающей SEQ ID №:11/13/15, 27/29/31, 43/45/47, 59/61/63, 75/77/79, 91/93/95, 107/109/111, 123/125/127, 139/141/143, 155/157/159 и 189/191/193. Водном осуществлении антитело или его фрагмент содержит последовательности CDR тяжелой и легкой цепей, кодируемые сочетанием нуклеотидной последовательности SEQ ID №:67/69/71/75/77/79.

[0024] В пятом аспекте настоящего изобретения приводится антитело анти-АМОРТ1-3 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), кодируемую сегментами нуклеотидной последовательности, полученными из последовательностей зародышевых линий V_H, D_H и J_H, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), кодируемую сегментами нуклеотидной последовательности, полученными из последовательностей зародышевых линий V_K и J_K, где HCVR и LCVR кодируются сегментами нуклеотидной последовательности, полученными из сочетания зародышевых линий, выбираемого из группы, включающей: (i) V_H3-43, D_H3-3, J_H3, V_K1-5 и J_K2; (ii) V_H3-11, D_H1-1, J_H4, V_K1-39 и J_K4; (iii) V_H3-30, D_H1-7, J_H6, V_K1-5 и J_K1; (iv) V_H3-30, D_H1-26, J_H6, V_K1-12 и J_K3; (v) V_H3-30, D_H3-10, J_H6, V_K1-12 и J_K3; и (vi) V_H3-23, D_H3-10, J_H4, V_K1-5 и J_K1.

[0025] В шестом аспекте настоящего изобретения приводится антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с hANGPTL3 при равновесной константой диссоциации (K_D), составляющей приблизительно 7 нМ или менее, приблизительно 6 нМ или менее, приблизительно 5 нМ или менее, приблизительно 4 нМ или менее, приблизительно 3 нМ или менее, приблизительно 2 нМ или менее или приблизительно 1 нМ или менее, как показывают результаты измерения методом поверхностного плазменного резонанса (например BIACORE™). В некоторых осуществлениях антитело настоящего изобретения демонстрирует Ко, составляющее приблизительно 800 пМ или менее, приблизительно 700 пМ или менее, приблизительно 600 пМ или менее, приблизительно 500 пМ или менее, приблизительно 400 пМ или менее, приблизительно 300 пМ или менее, приблизительно 200 пМ или менее, приблизительно 100 пМ или менее или приблизительно 50 пМ или менее.

[0026] В седьмом аспекте настоящего изобретения приводится антитело анти-hANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают белок hANGPTL3 последовательности SEQ ID №:161, но не вступает в перекрестную реакцию с родственным белком, таким как ангиопоэтин-подобный белок 4 (hANGPTL4; SEQ ID №:164) человека, согласно определению, например, с помощью ELISA, методом поверхностного плазменного резонанса или технологии LUMINEX®XMAP®, как описано в настоящем документе. ANGPTL4 представляет собой еще один секретируемый белок, способный снижать активность LPL и имеющий N-терминальную суперспирально область и С-терминальный фибриногеноподобный домен (Ge et al., 2004, J Biol Chem 279:2038-2045; Yau et al., 2009, J Biol Chem 284:11942-11952). В связанных осуществлениях настоящего изобретения приводится антитело анти-hANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают белок hANGPTL-3 и вступает в перекрестную реакцию с белком hANGPTL4, В некоторых осуществлениях аффинность связывания антитела hANGPTL3 или фрагмента антитела белка hANGPTL4 составляет 75% или менее или 50% или менее афинности связывания антитела или фрагмента с белком hANGPTL3.

[0027] В еще одном связанном осуществлении настоящего изобретения представлено антитело анти-hANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые не вступает в перекрестную реакцию с ANGPTL3 мыши (mANGPTL3; SEQ ID №:163) или ANGPTL3 крысы (rANGPTL3; SEQ ID №:175), но вступает в перекрестную реакцию с ANGPTL3 яванского макака (Масаса fascicularis) (MfANGPTL3), например с N-терминальными остатками 17-170 SEQ ID №:177 (частичная аминокислотная последовательность MfANGPTL3). В еще одном связанном осуществлении настоящего изобретения представлено антитело анти-hANGPTL3 или его фрагмент, которые вступают в перекрестную реакцию с MfANGPTL3, mANGPTL3 и rANGTPL3.

[0028] Настоящее изобретение включает антитела анти-hANGPTL3 с модифицированной структурой гликозилирования. В некоторых приложениях может оказаться полезным удалить нежелательные сайты гликозилирования, например удалить фукозу для усиления функции антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других приложениях удаление сайта N-гликозилирования может сократить нежелательные иммунные реакции на терапевтические антитела или увеличить аффинность антител. В других приложениях может осуществляться модификация галактозилирования, с тем чтобы изменить комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

[0029] В восьмом аспекте настоящего изобретения приводится фармацевтический состав, включающий рекомбинантное антитело человека или его фрагмент, которые специфически связывают hANGPTL3, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном осуществлении настоящего изобретения представлен фармацевтический состав, содержащий одно или несколько антител анти-ANGPTL3 или фрагментов антител изобретения, которые не вступают в перекрестную конкуренцию друг с другом, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном осуществлении фармацевтический состав настоящего изобретения может содержать два или более неблокирующих антител, которые не вступают в конкуренцию друг с другом за специфическое связывание с hANGPTL3 и проявляют эффективность в удалении hANGPTL3 из обращения. Приемлемые сочетания неблокирующих антител включают, среди прочего, сочетание антител, содержащее пары последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR): (i) SEQ ID №:82/90 и 180/188, соответственно; (ii) SEQ ID №:114/122 и 180/188, соответственно; (iii) SEQ ID №:82/90 и 18/26, соответственно; или (iv) SEQ ID №:114/122 и 18/26, соответственно.

[0030] В связанных осуществлениях настоящего изобретения приводится состав, представляющий собой сочетание антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела настоящего изобретения и второго терапевтического агента. В качестве второго терапевтического агента может выступать один или несколько агентов, таких как (1) ингибиторы редуктазы 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзима A (HMG-CoA), например церивастатин, аторвастатин, симвастатин, питавастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин и им подобные; (2) ингибиторы захвата холестерина и/или реабсорбции желчных кислот; (3) ниацин, который повышает катаболизм липопротеинов; (4) фибраты или амфипатические карбоновые кислоты, которые снижают уровень липопротеина низкой плотности (ЛНП), улучшают уровни липопротеина высокой плотности (ЛВП) и TG, а также сокращают число инфарктов без смертельного исхода; и (5) активаторы фактора транскрипции LXR, который играет роль в удалении холестерина, например 22-гидроксихолестерина, или фиксированные комбинации, например эзетимиб плюс симвастатин; статин с секвестрантом желчных кислот (например, холестирамин, колестипол, колесевелам), фиксированная комбинация ниацин плюс статин (например, ниацин с ловастатином); или с другими агентами, снижающими концентрацию липидов, такими как этиловые эфиры омега-3 жирной кислоты (например, омакор). Кроме того, в качестве второго терапевтического агента может выступать один или несколько других ингибиторов ANGPTL3, а также ингибиторы других молекул, такие K3KANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 и пропротеинконвертаза субтилизина/кексина типа 9 (PCSK9), которые участвуют в липидном метаболизме, в частности в гомеостазе холестерина и/или триглицерида. К ингибиторам этих молекул относятся малые молекулы и антитела, которые специфически связывают эти молекулы и блокируют их активность.

[0031] В связанных осуществлениях вторым лекарственным препаратом может быть один или несколько противораковых препаратов, например препараты для химиотерапии, антиангиогенные препараты, препараты ингибиторы роста, цитотоксические препараты, агенты апоптоза и другие препараты, хорошо известные специалистам в области и применяемые для лечения рака или иных пролиферативных заболеваний или нарушений, а также другие лекарственные препараты, например анальгетики, противовоспалительные препараты, в том числе нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП), например ингибиторы Сох-2 и им подобные, с тем чтобы смягчить или устранить симптомы, сопровождающие первопричинный рак/опухоль.

[0032] В девятом аспекте изобретения приводятся способы, позволяющие нейтрализовать, ингибировать, блокировать, аннулировать, снизить активность hANGPTL3 или препятствовать ей с использованием одного или нескольких антител анти-hANGPTL3 или их антигенсвязывающих фрагментов настоящего изобретения. В одном осуществлении изобретения приводится способ лечения, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества фармацевтического состава, содержащего одно или несколько антител анти-hANGPTL3 настоящего изобретения или их антигенсвязывающих фрагментов и, возможно, одно или несколько дополнительных лекарственных средств, описанных выше. Антитела анти-ANGPTL3 настоящего изобретения или их фрагменты могут выступать в качестве нейтрализующих антител или неблокирующих антител против ANGPTL3 или же их сочетаний.

[0033] В связанных осуществлениях изобретения приводится способ увеличения клиренса hANGPTL3 из кровообращения пациента, нуждающегося в таком лечении, каковой способ включает введение пациенту не менее двух антител анти-hANGPTL3 настоящего изобретения или их фрагментов, которые не конкурируют друг с другом за связывание с hANGPTL3 и, предпочтительно, не блокируют по крайней мере один из аспектов активности hANGPTL3 (то есть неблокирующие антитела). К упомянутому по крайней мере одному аспекту активности hANGPTL3 относится, среди прочего, ингибирование активности LPL, в том числе ангиогенеза, и пр. В одном из осуществлений сочетание не менее чем двух неблокирующих антител анти-hANGPTL3 или их фрагментов повышает клиренс hANGPTL3 из кровообращения не менее примерно на 20%, примерно на 30%, примерно на 40%, примерно на 50%, примерно на 60%, примерно на 70% или примерно на 80% по сравнению с клиренсом без введения антител или фрагментов. Уровни hANGPTL3 в кровообращении могут измеряться по результатам анализов in vitro, хорошо известным специалистам в области, а также описанным в настоящем документе. В другом осуществлении сочетание не менее двух неблокирующих антител анти-hANGPTL3 включает пары последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR) из последовательностей (i) SEQ ID №:82/90 и 180/188, соответственно; (ii) SEQ ID №:114/122 и 180/188, соответственно; (iii) SEQ ID №:82/90 и 18/26, соответственно; или (iv) SEQ ID №:114/122 и 18/26, соответственно.

[0034] К заболеваниям или нарушениям, которые поддаются лечению с помощью способов настоящего изобретения, относятся любые заболевания или состояния, при которых отмечается улучшение, смягчение, подавление или предупреждение, или снижение частоты по сравнению с состоянием без лечения антителами анти-hANGPTL3 (например, ANGPTL3-опосредованные заболевания или нарушения) за счет аннулирования, ингибирования, снижения активности ANGPTL3 или иного воздействия на нее. К примерам заболеваний или нарушений, которые поддаются лечению способами настоящего изобретения, среди прочих, относятся заболевания или нарушения, связанные с метаболизмом липидов, например гиперлипидемия, гиперлипопротеинемия и дислипидемия, в том числе атерогенная дислипидемия, диабетическая дислипидемия, гипертриглицеридемия, в том числе острая гипертриглицеридемия с TG>1000 мг/дл, гиперхолестеринемия, хиломикроенмия, смешанная дислипидемия (ожирение, метаболический синдром, диабет и пр.), липодистрофия, липоартрофия и им подобные, которые вызываются, например, пониженной активностью LPL и/или нарушениями LPL, пониженной активностью рецептора ЛНП (LDLR) и/или нарушениями рецептора ЛНП (например гомозиготная наследственная гиперхолестеринемия с LDLR^-/-), изменениями АроС2, недостатком АроЕ, повышением АроВ, повышенной продукцией и/или пониженным выведением липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), лечением определенными препаратами (например дислипидемия, вызванная лечением глюкокортикоидами), любой генетической предрасположенностью, диетой, образом жизни и пр. Способы настоящего изобретения могут также обеспечивать профилактику или лечение заболеваний или нарушений, связанных или вызванных гиперлипидемией, гиперлипопротеинемией и/или дислипидемией, включая, среди прочих, сердечнососудистые заболевания или нарушения, например атеросклероз, аневризма, гипертензия, стенокардия, инсульт, нарушения мозгового кровообращения, застойная сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, заболевания периферических сосудов и им подобные; острый панкреатит, неалкогольный стеатогепатит (NASH); нарушения содержания сахара в крови, например диабет, ожирение и им подобные.

[0035] К другим примерам заболеваний или нарушений, которые поддаются лечению способами настоящего изобретения, относятся рак/опухоли, а также неопухолевые связанные с ангиогенезом заболевания или нарушения, в том числе офтальмологические ангиогенные заболевания, такие как возрастная макулодистрофия, окклюзия центральной вены сетчатки или окклюзия ветки вены сетчатки, диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных и им подобные, воспалительные заболевания, например артрит, ревматоидный артрит (RA), псориаз и им подобные.

[0036] Другие осуществления станут очевидными при ознакомлении с приведенным ниже подробным описанием.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[0037] На фиг.1 представлено выравнивание последовательностей пептидов 1-3, используемых в эксперименте связывания антитела анти-hANGPTL3 (пример 5) относительно соответствующих участков последовательности hANGPTL3 (то есть по остаткам с 30 до 70 SEQ ID №:161 или GenBank #NP_055310). Пептид 1 (контроль: пептид ANGPTL4; SEQ ID №:168); пептид 2 (пептид ANGPTL3; SEQ ID №:169); и пептид 3 (пептид ANGPTL3; SEQ ID №:170).

[0038] На фиг.2 приведены результаты связывания антитела анти-hANGPTL3 с N-терминальными суперспиральными пептидами hANGPTL3 (пептиды