Способ получения арахидоновой кислоты из морской красной водоросли рода gracilaria

Способ получения арахидоновой кислоты из морской красной водоросли рода gracilaria

Реферат

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения композиций с высоким содержанием арахидоновой кислоты (АК), обладающей выраженным биологическим действием.

На данный момент из научной и патентной литературы нам не известно о методах получения фармацевтических композиций с высоким содержанием АК, получение которых проходило бы при одновременно высоком выходе и высокой чистоте целевого продукта, при сохранении эффективности технологического процесса – кардинальном упрощении технологических стадий, сокращении времени проведения процесса, повышении его экологичности. Тем самым, достигается интенсификация процесса, что дает фармацевтическим предприятиям возможность получения новых препаратов (композиций) с высоким содержанием АК, оказывающих лечебно-профилактическое действие при нарушениях обмена липидов в организме.

Арахидоновая кислота – биохимически важная эссенциальная кислота, предшественник различных эйкозаноидов и других активных медиаторов.

Однако для большинства лабораторий остро стоит вопрос о приобретении АК для исследований, поскольку стоимость чистых препаратов АК чрезвычайно велика. Практически любое исследование, связанное с АК, начинается со значительных затрат. Такое положение сложилось, в основном, из-за того, что большинство экспериментаторов, даже имея в наличии необходимые приборы, не обладают опытом по получению АК.

Известно много лабораторных и промышленных методов получения АК, но их применение в том или ином процессе не является очевидным и должно быть обосновано использованием соответствующего сырья, возможностями самого метода и наличием определенного оборудования.

В 80-х годах прошлого столетия появились новые источники АК – микроводоросль Porphyridium cruentum и одноклеточные грибы штамма Mortierella. Оба источника культивируемые в бассейнах или больших аппаратах с регулируемыми параметрами питательной среды по азоту, СО₂, минеральным солям, рН, температуре, освещению и др.

Известен способ выделения АК из культивированной биомассы микроводоросли Porphyridium cruentum (US Patent 5338673, МПК C12M1/00, C12M1/02, C12M1/04, опубл. 1994-08-16), культивирование проводили в течение 6-ти суток при температуре 20-30°С и сильной интенсивности света, при этом биомасса нарастала по 10 г/м³/день, а концентрация АК среди жирных кислот липидов достигала 14,5-27,1%. Содержание липидов в сухой биомассе составляло 11,5%, от них 36% составляли суммарные ЖК. Причем из восьми экспериментов только в одном содержание АК превышало содержание эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5n-3).

Недостатки способа:

1) способ эффективен только при очень больших объемах культивирования водоросли (в бассейнах), а это, в целях экономии электроэнергии, можно осуществлять только в странах с жарким климатом, например, Израиле; для России и других северных стран этот метод никем даже не рассматривается;

2) пределы концентрирования АК в биомассе ограничены, в данном случае – до 27,1%, что недостаточно для биохимических исследований.

Известен способ концентрирования АК в ЖК липидах биомассы до 20,7-30,1% (Cohen Z. «The production potential of eicosapentaenoic and arachidonic acids by the red alga Porphyridium cruentum» // JAOCS. – 1990. - Vol. 67, № 12. – P. 916-920). Лучшие результаты достигнуты при азотном голодании; при избытке азота в пробах доминировала «нежелательная» ЭПК (эйкозапентаеновая кислота).

Недостатки способа: авторы не указывают выходы АК из биомассы, но известный факт, что при азотном голодании, продуктивность микроводорослей сильно снижается, а значит и само содержание липидов незначительно.

Известен способ выделения АК (Giménez A.G., González M.J.I., Medina A.R. et al. «Downstream processing and purification of eicosapentaenoic (20:5n-3) and arachidonic acids (20:4n-6) from the microalga Porphyridium cruentum» // Bioseparation. – 1998. - Vol. 7. – P. 89-99) путем культивирования микроводоросли Porphyridium cruentum - из биомассы микроводоросли выделяли свободные жирные кислоты (20,3% АК), обрабатывали их методом комплексообразования с мочевиной (34,1% АК), а концентрат дочищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), чистота АК 92,0%. Общий выход АК – 33,5%.

Недостатки способа:

1) комплексообразование с мочевиной простой, но не селективный метод концентрирования ПНЖК, в котором особенно значительны потери полиненасыщенных жирных кислот;

2) авторы не смогли решить задачу подбора элюирующих систем для ВЭЖХ, в результате чего, был получен концентрат АК с чистотой только 92,0%.

Известен способ выделения АК из биомассы микроводоросли Porphyridium cruentum (Guil-Guerrero J.L., Belarbi E.-H., Rebolloso-Fuentes M.M. «Eicosapentaenoic and arachidonic acids purification from the red alga Porphyridium cruentum» // Bioseparation. – 2001. - Vol. 9. – P. 299-306), совмещающий в технологии 3-х-стадийную процедуру: экстракцию ЖК из биомассы (35,1% АК), комплексообразование ЖК с мочевиной (56,8% АК), колоночную хроматографию метиловых эфиров жирных кислот на силикагеле с AgNO₃ (97,0% АК). Общий выход АК - 39,5%.

Недостатки способа:

1) использование комплексообразования с мочевиной с самого начала снижает возможности концентрирования АК с большим выходом;

2) хроматография АК с использованием солей серебра сразу делает способ не технологичным из-за малой производительности и высокой себестоимости.

Известен способ получения АК из масла одноклеточных грибов (Zhang Y.-X., Tao J.-C., Wang L. «Purification of arachidonic acid from fungal single-cell oil via Al₂O₃-supported CuSO₄ column chromatography» /// JAOCS. 2006. Vol. 83, № 7. P. 659-662), осуществленный следующим образом: масло гидролизовали до получения 47,3%-ной АК, свободные ЖК подвергали комплексообразованию с мочевиной (74,9%-ная АК) и далее метиловые эфиры ЖК фракционировали на колонке с окисью алюминия (Al₂O₃), импрегнированной сульфатом меди (CuSO₄), получив АК с чистотой 90,8% и общим выходом 39,9%.

Недостатки способа:

1) применение малоэффективного для концентрирования полиненасыщенных ЖК метода комплексообразования с мочевиной;

2) ионы меди, наподобие ионов серебра, образуют комплексы с двойными связями ЖК, однако они менее стойкие, чем с ионами серебра, поэтому и эффективность выделения АК на колонке не высокая – чистота АК повышается с 74,9% только до 90,8%, при этом общий выход очень низкий – 39,9%.

Известен способ получения АК культивированием гриба Mortierella alpine (US Patent 5 658 767 «Arachidonic acid and methods for the production and use thereof» // Kyle D.J. – 1997). Гриб культивировали в питательной среде с содержанием глюкозы при температуре 25⁰С в течение 1-4-х суток. При этом концентрация липидов в биомассе возрастала с 0,15 до 7,18 г/л, а содержание АК менялось от 21,9% до 31,3%. Добавлением в среду для роста гриба комплекса минеральных солей, соевой муки, витаминов и увеличением продолжительности культивирования до 10 суток достигали накопления липидов в биомассе до 10,3 г/л (51,2% АК). Максимальное содержание АК достигали использованием антибиотиков - 64% при 4,4 г липидов/л биомассы; продуктивность при этом падала до 1,5 раз.

Недостатки способа:

1) очевидно, что данный способ может быть применен только при больших объемах культивирования и в течение длительного времени, что совершенно не приемлемо для исследовательских лабораторий, где АК нужной чистоты и необходимого количества должна быть получена непосредственно перед испытаниями;

2) использование различных пищевых добавок в смесь для культивирования гриба, а также антибиотиков, интересно с точки зрения науки, но не представляет ценности для обычных лабораторий, занимающихся исследованием АК как биохимического и медицинского препарата.

Известен способ получения АК культивированием гриба Mortierella alpine при 12⁰С (EP № 1035211 B1, МПК C12P7/64, опубл. 2012-04-11). При этом получили концентраты с содержанием 28,2-48,2% АК и содержанием АК в биомассе от 0,28-1,41 г/л (продолжительность процесса 10 суток).

Недостатки способа:

1) максимальное обогащение по АК не превышает 48,2% - низкий уровень для биохимических исследований;

2) осуществление способа может быть применимо на больших предприятиях, имеющих возможность и для культивирования и для протекания столь долговременных процессов.

Известен способ получения АК (US Patent 6,319,698 B1, МПК A01N63/00, A23B4/12, A23L1/30, опубл. 2001-11-20) культивированием штаммов Mortierella schmuckeri и Mortierella camargensis. Из биомассы выделенных липидов получены концентраты 30,0-48,6% АК.

Недостатки способа:

1) данный способ может быть только первой ступенью для концентрирования АК;

2) наивысшая концентрация АК (48,6%) может быть получена в условиях «азотного голодания», что снижает продуктивность гриба по биомассе, а в целом и биосинтез АК.

Известен способ получения АК из липидов гриба Mortierella alpine (Wang X¹., Wang X.², Wang T. «Enrichment of arachidonic acid for the enzymatic synthesis of arachidonoyl ethanolamide» // J. Am. Chem. Soc. – 2013. - Vol. 90. – P. 1031-1039). Содержание АК в составе ЖК липидов гриба составляло 40,2%. Способ осуществляли следующим образом: липиды гидролизовали, свободные ЖК подвергали комплексообразованию с мочевиной, при этом концентрация АК возросла до 78,4%, а после противоточного распределения ЖК полученного концентрата между водно-метанольным раствором AgNO₃ и гексаном, достигала 90,7% с общим выходом 50,0%.

Недостатки способа:

1) комплексообразование ЖК с мочевиной сильно снижает конечный выход АК;

2) перераспределение ЖК между двумя не смешивающимися жидкостями – достаточно редко используемый метод, к тому же ключевым элементом является добавление соли серебра, водно-метанольный раствор после этого не регенерируется, и ценное сырье теряется.

3) степень чистоты АК, 90,7%, не достаточна для многих исследовательских работ и требует дальнейшей доочистки;

4) выход АК, 50,0%, показывает неиспользованный потенциал способа и, возможно, его дальнейшее совершенствование.

Известен способ получения АК из липидов Mortierella sp. (Shimada Y., Sugihara A., Minamigawa Y. et al. «Enzymatic enrichment of arachidonic acid from Mortierella single-cell oil» // JAOCS. – 1998. - Vol. 75, № 9. – P. 1213-1217), осуществленный следующим образом: липиды с начальным содержанием 24,6%-ной АК были гидролизованы неспецифичной липазой Pseudomonas sp., затем свободные ЖК этерифицировали лауриловым спиртом (12:0) при инкубировании с липазой Candida rugosa (получали 52,5%-ную АК), насыщенные ЖК удаляли осаждением с мочевиной (63,0% АК) и повторно инкубировали смесь с той же самой липазой (74,9% АК). Общий выход 42,4%.

Недостатки способа:

1) способ состоит из 4-х достаточно трудоемких стадий, так как работа с ферментами требует соответствующей подготовки, как персонала, так и оборудования и реактивов;

2) особые сложности составляют процедуры разделения липидов в инкубационных смесях после гидролиза/синтеза;

3) метод комплексообразования ЖК с мочевиной не самый приемлемый метод концентрирования АК при осуществлении данного способа;

4) чистота АК, 63,0%, и выход, 42,4%, слишком малы, чтобы использовать данный способ, как основу для получения АК.

Известен способ получения АК из липидов Mortierella sp. (Vali S.R., Sheng H.Y., Ju Y.-H. «An efficient method for the purification of arachidonic acid from fungal single-cell oil (ARASCO)» // JAOCS. – 2003. - Vol. 80, № 7. – P. 725-730), осуществленный следующим образом: липиды концентрата АК (38,8% АК) гидролизовали до выделения свободных ЖК, которые фракционировали осаждением из ацетонитрила при -40⁰С (75,7%-ная АК), затем проводили селективную этерификацию с липазой Candida rugosa и лауриловым спиртом (89,3%-ная АК) и завершали процесс селективной экстракцией лаурилового эфира АК ацетонитрилом из раствора липидной смеси в гексане (получали 95,2%-ную АК). Общий выход 70,9%.

Недостатки способа:

1) специфические или селективные к полиненасыщенным ЖК липазы чрезвычайно дороги, в не иммобилизованном виде они используются однократно, а в данном случае это так, что серьезно удорожает процесс;

2) как упоминалось выше, существуют сложности в разделении липидов после ферментативной реакции;

3) авторы получили 95,2%-ную АК, но для получения чистой кислоты необходимо дополнительно применить другие методы.

Наиболее близким к заявляемому нами способу является способ получения арахидоновой кислоты, описанный Yuan C., Wang X., Yu Z. («Separation and preparative purification of arachidonic acid from microbial lipids by urea inclusion reaction and HPLC» // Preparative Biochemistry and Biotechnology. 2007. Vol. 37, N 2. P. 149-159). Способ осуществляли следующим образом: микробиальные липиды с содержанием АК 38,3% гидролизовали раствором натриевой щелочи, подкисляли соляной кислотой до выделения свободных ЖК, которые подвергали комплексообразованию с мочевиной в соотношении ЖК : мочевина : метанол – 1:2:8, по массе при -10⁰С (АК – 77,3%, выход на стадии 68,0%), далее полученный концентрат АК переводили в этиловые эфиры и получали чистую АК (99,5%), используя ВЭЖХ на препаративной колонке С-18 (300 мм х 30 мм i.d., диаметр частиц сорбента 15 мкм), элюирующая система 95:5, метанол-вода, об./об.

Общий выход в процессе получения АК не указан.

Общее время осуществления способа 15 час.

Недостатки способа:

1) использование метода комплексообразования ЖК с мочевиной резко снижает конечный выход целевого продукта – АК;

2) применение в комплексообразовании ЖК с мочевиной метанола – чрезвычайно ядовитого соединения - не позволяет использовать данную методику в медицинской и пищевой промышленности;

3) известно, что производительность ВЭЖХ сильно зависит от размера частиц сорбента, поэтому использование для выделения АК частиц размером 15 мкм, возможно, приемлемо для снижения давления в системе, но одновременно накладывает малую производительность по целевому веществу (скорость подвижной фазы всего 5 мл/мин), такой способ реализуем, как показывает данный пример, но будет обеспечивать очень малые выходы по АК;

4) авторы используют в элюирующей системе метанол, хотя задача большинства исследователей, предлагающих свои способы получения активных веществ, максимально снизить применение токсичных растворителей; способ интересен, так как позволяет выделять АК, но не может быть тиражирован из-за требований, предъявляемых к чистым производствам.

Задача, решаемая изобретением - разработка простого и экономичного способа получения арахидоновой кислоты, с высоким качеством и выходом продукта при одновременном снижении затрат производства и времени технологического цикла.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе получения арахидоновой кислоты, включающим щелочной гидролиз сырья с последующим подкислением гидролизата, удаление насыщенных жирных кислот, перевод жирных кислот в эфиры и выделение целевого продукта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, согласно изобретению, в качестве сырья берут морскую красную водоросль рода Gracilaria; удаление насыщенных жирных кислот ведут в виде литиевых солей, после чего этерифицируют ненасыщенные жирные кислоты этиловым спиртом и выделяют арахидоновую кислоты в виде этилового эфира методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, на обращенной фазе (С-18) с использованием элюирующей системы этанол-вода, 8,0 : 1,0-2,5 об./об.

Для выделения АК до недавнего времени обычно использовали ткани животных – поджелудочную железу, печень, надпочечники и др. Содержание АК в липидах этих тканей, как правило, не превышает 10%. Достоинства этого источника в его постоянной доступности.

Заявителем в качестве сырья для получения АК предложено использовать красные водоросли рода Gracilaria, произрастающие в морях России, в частности, G. vermiculophylla, G. textorii, G. Incurvata.

При исследовании морских объектов высокое содержание АК обнаружено в липидах красных водорослей рода Gracilaria, особенно в Gracilaria vermiculophylla, широко распространенной в Японском море. Несмотря на то, что содержание липидов в водоросли варьируется в пределах до 5 мг/г сырой массы, содержание АК в липидах может достигать 56,7%, при содержании ЭПК 1,6% (Хотимченко С.В. «Липиды морских водорослей макрофитов и трав: структура, распределение, анализ». Владивосток: Дальнаука, 2003. – C. 42-47). Учитывая большие запасы водоросли, промыслового значения не имеющей, это хороший источник АК.

Использование красной водоросли рода Gracilaria для получения АК не только расширяет ассортимент дешевого сырья для её производства, но и позволяет значительно упростить способ получения АК. Применение для выделения АК нового сырья – морской красной водоросли Gracilaria vermiculophylla, имеет ряд преимуществ. Во-первых, это неиспользуемое и широко распространенное в Японском море сырье, во-вторых, АК изначально присутствует в липидах водоросли в значительных количествах, в-третьих, липиды водоросли не содержат докозагексаеновую кислоту (ДГК), а содержание ЭПК менее 1,5% (в 20 раз меньше, чем АК). Такой состав жирных кислот обеспечивает применение в технологии получения АК минимального количества приемов и получение высокообогащенной кислоты с высоким выходом.

Осаждение в виде литиевых солей позволяет удалить насыщенные жирные кислоты из гидролизата, что, в конечном результате, способствует получению целевого продукта с высокой степенью чистоты. Перевод жирных кислот в Li-соли осуществляют известным методом, в частности, из ацетона по Хилдичу (Hildich T.P. «The Chemical constitution of natural fats». London: Chapman&Hall Ltd., 1949. – P.471).

Окончательную очистку АК в виде этилового эфира методом ВЭЖХ проводят на обращенной фазе (С-18) с использованием водно-этанольного элюента, этанол/вода, 8,0:1,0-2,5 об./об.

Использование водно-этанольного элюента позволяет отказаться от применения в процессе вредных веществ в отличие от прототипа, загрязняющих как целевой продукт, но и делает процесс получения АК безвредным и экологически безопасным. Предложенная новая элюирующая система позволяет выделять чистую АК в виде этилового эфира, при этом система не токсична (этанол-вода, 8,0 : 1,0-2,5 об./об.), хорошо регенерируется и обеспечивает получение качественного целевого препарата. Элюирующая система для ВЭЖХ обеспечивает чистоту продукта более 99%.

Заявленные параметры системы (этанол-вода, 8,0 : 1,0-2,5, об./об.) позволяют в широком диапазоне применять полярный компонент (Н₂О) для увеличения общей полярности системы, причем в применяемом при ВЭЖХ изократическом режиме выделения АК не требуется изменений (градиента) в содержании элюирующей системы – от начала до конца процесса параметры сохраняются неизменными. Как указано выше, оптимальное содержание воды в системе с этанолом составляет - этанол-вода, 8,0 : 1,0-2,5 об./об. Отклонение содержания воды в системе в большую или в меньшую сторону приводит к получению АК меньшей чистоты, менее 99%, из-за включения в целевой продукт других жирных кислот.

Кроме того, данная элюирующая система обладает большими преимуществами перед использованием систем на основе метанола, так как позволяет без каких–либо ограничений применять данный метод на фармацевтических и, главное, на пищевых производствах, что открывает большие перспективы получения продукта (АК) без ядовитого метилового спирта, экологичным методом.

Доступность такой элюирующей системы не вызывает сомнений, а себестоимость ее меньше, чем традиционной с метиловым спиртом.

Более того, особенностью предлагаемого нового вида сырья, является то, что состав жирных кислот липидов водоросли рода Gracilaria представлен с четким разделением на 2-е основные группы – насыщенные жирные кислоты (47-50% и более) и полиненасыщенные жирные кислоты, включая АК (37-39% и более). Такой состав создает очень хорошие предпосылки для дальнейшего фракционирования высоконенасыщенных кислот. Фактически, применяя избирательный метод в виде кристаллизации жирных кислот в Li-солях, мы полностью освобождаем смесь от насыщенных жирных кислот. При этом содержание ненасыщенных кислот и АК, в частности, повышается в 2-а раза, а, учитывая ее начальное значение – 30-36% и более – это очень значительная величина (>60%). Такая концентрация позволяет сразу применить для окончательной очистки АК метод ВЭЖХ. Не требуется никаких дополнительных методов концентрирования – низко-температурной кристаллизации ЖК из растворителей, комплексообразования с мочевиной или йод-лактонизации жирных кислот. В результате чего, реализация способа осуществляется всего 3-мя ключевыми процедурами, достаточно простыми в исполнении: экстракцией липидов, высвобождением ненасыщенной фракции путем кристаллизации смеси в виде Li-солей и концентрированием АК методом ВЭЖХ.

Способ осуществляют следующим образом.

Экстракция щелочная

Водоросль измельчали на гомогенизаторе, гидролизовали липиды 2%-ным раствором щелочи в 95%-ном этаноле при температуре 50⁰С и перемешивании в течение 2-х часов. Соотношение гомогенат водоросли – растворитель 1 : 5, кг/л. Далее экстракт фильтровали через плотную ткань, осадок промывали подогретым до 50⁰С 95%-ным этанолом. Оба фильтрата объединяли, добавляли воды и подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН=3. Жирные кислоты экстрагировали петролейным эфиром, объединенный экстракт промывали 1%-ным водным раствором NaCl, обезвоживали, пропуская экстракт через сульфат натрия, упаривали.

Осаждение ЖК в виде Li-солей

Насыщенные жирные кислоты удаляли процедурой осаждения в виде литиевых солей из ацетона (Hildich T.P. «The Chemical constitution of natural fats». London: Chapman&Hall Ltd., 1949. – Р.471).

Гидролизованные липиды растворяли в 4-х кратном объеме чистого ацетона. Добавляли 2 мл 2%-ного раствора фенолфталеина в ацетоне и при нагреве (40⁰С) оттитровывали свободные жирные кислоты насыщенным водным раствором LiOH (≈ 4N) до появления характерной малиновой окраски. Фиксировали объем использованной литиевой щелочи. Далее, к смеси добавляли ацетон до содержания в ней воды 5% по объему. Смесь охлаждали до комнатной температуры, выдерживали 1 час, осадок отфильтровывали на бумажном фильтре, ацетоновый фильтрат подкисляли соляной кислотой до рН=3, упаривали.

Получение этиловых эфиров ЖК

Жирные кислоты вносили в 1%-ный раствор серной кислоты в абсолютированном этаноле при соотношении ЖК - этанол, 1 : 10, об./об. Смесь нагревали (50⁰С) при перемешивании в течение 1,5 часов, далее разбавляли 3-мя объемами воды и экстрагировали этиловые эфиры ЖК петролейным эфиром.

Упаренный экстракт очищали на колонке с силикагелем, элюент - петролейный эфир.

Выделение АК в виде этилового эфира методом ВЭЖХ

Разделение смеси этиловых эфиров ЖК осуществляли на колонке «Supelco Discovery HS С-18», 250 мм x 50 мм i.d. (размер частиц 10 мкм) на жидкостном хроматографе «Shimadzu-LC8A» с UV-детектором SPD-20A. Элюирование осуществляли предварительно дегазированной и отфильтрованной системой растворителей этанол-вода, 8,0 : 1,0-2,5, об./об., при скорости 50 мл/мин.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Реактивы и общие аналитические процедуры для всех примеров

Все используемые реактивы и растворители были марки «хч»; силикагель производства «Chemapol» (Чехия), гидроксид лития, этанол и петролейный эфир, 40⁰-60⁰С («Реагент», Москва).

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) липидов для контроля за процессами осуществляли на пластинках с закрепленным слоем силикагеля («Sorbfil», Россия) при использовании элюирующей системы 80:20:1, гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота, об./об./об., для определения состава нейтральных липидов.

Метиловые эфиры жирных кислот липидов для ГЖХ-анализа получали согласно методике (Carreau J.P., Dubacq J.P. «Adaptation of a macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts» // J. Chromatogr. – 1978. – Vol. 151, № 3. - 384–390). Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили газовой хроматографией на хроматографе Shimadzu GC-17A («Shimadzu», Kyoto, Japan) с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой 30 m × 0.25 mm i.d. «Supelcowax 10» (Bellefonte, USA), условия анализа: температура колонки 190⁰С, инжектора и детектора 240⁰C, газ-носитель гелий. Идентификацию пиков метиловых эфиров жирных кислот проводили по временам удерживания индивидуальных эфиров жирных кислот и с использованием стандартных смесей ПНЖК («Supelco», Bellefonte, USA) и с использованием значений эквивалентной длины цепи (Christie W.W. «Lipid Analysis: Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids». - The oily Press, Bridgwater (UK), 2003. – 416 р.).

Пример 1.

Красная водоросль Gracilaria vermiculophylla была собрана в Заливе Петра Великого (Японское море, вблизи г. Владивостока) в августе 2015 г. До использования весь материал хранили при температуре минус 20⁰С.

Водоросль (1,7 кг) измельчали на гомогенизаторе, гидролизовали липиды 2%-ным раствором КОН в 95%-ном этаноле (6,5 л) при температуре 50⁰С и перемешивании в течение 2-х часов. Далее экстракт фильтровали через плотную ткань, осадок промывали подогретым до 50⁰С 95%-ным этанолом (0,3 л). Оба фильтрата объединяли, добавляли воды (1- л) и подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН=3. Жирные кислоты экстрагировали петролейным эфиром (3 х 2 л), объединенный экстракт промывали 1%-ным водным раствором NaCl (0,3 л), обезвоживали, пропуская экстракт через сульфат натрия, упаривали. Получено 8,0 г гидролизованных липидов. (гидролизованные липиды – это смесь свободных жирных кислот, включающая как насыщенные жирные кислоты, так и ненасыщенные жирные кислоты, а также неомыляемые вещества – стерины, углеводороды, пигменты и др.).

Насыщенные жирные кислоты удаляли из смеси процедурой осаждения в виде литиевых солей из ацетона. Гидролизованные липиды (8,0 г) растворяли в 35 мл чистого ацетона. Добавляли 1 мл 2%-ного раствора фенолфталеина в ацетоне и при нагреве (40⁰С) оттитровывали свободные жирные кислоты насыщенным водным раствором LiOH (≈ 4N) до появления характерной малиновой окраски (6,3 мл). Далее, к смеси добавляли 90 мл ацетона. Смесь охлаждали до комнатной температуры, выдерживали 1 час, осадок отфильтровывали на бумажном фильтре, ацетоновый фильтрат подкисляли соляной кислотой до рН=3, упаривали. Получено 4,2 г концентрата АК (чистота 60,46%).

Затем концентрат жирных кислот (4,2 г), содержащий арахидоновую кислоту, переводили в этиловые эфиры следующим образом: вносили его в 1%-ный раствор серной кислоты в абсолютированном этаноле (45 мл) нагревали (50⁰С) при перемешивании в течение 1,5 часов, далее разбавляли 125 мл воды и экстрагировали этиловые эфиры ЖК петролейным эфиром (3 х 50 мл), упаривали.

Упаренный экстракт очищали на колонке с силикагелем, элюент - петролейный эфир (100 мл), полученный элюат упаривали. Получено 12,0 г концентрата АК в виде этиловых эфиров.

Выделение АК в виде этилового эфира проводили методом ВЭЖХ. Разделение смеси ЭЭ-ЖК осуществляли на колонке «Supelco Discovery HS С-18», 250 мм x 50 мм i.d. (размер частиц 10 мкм). Элюирование осуществляли предварительно дегазированной и отфильтрованной системой растворителей этанол-вода, 8,0 : 1,0 об./об., при скорости 50 мл/мин.

После разделения, фракции с чистой АК упаривали.

Получена АК в виде этилового эфира, 1,72 г, с чистотой 99,60%.

Общий выход, в расчете на содержание АК в исходном сырье, - 68,7%.

Общее время осуществления способа 6 часов.

Пример 2.

Источник АК - красная водоросль Gracilaria vermiculophylla, как в Примере1.

Щелочную экстракцию липидов из водоросли (1,7 кг) для выделения свободных ЖК проводили раствором NaOH в условиях примера №1. Осаждение насыщенных ЖК в виде Li-солей, получение этиловых эфиров ЖК были проведены, как описано в Примере 1.

Были получены последовательно: 8,1 г гидролизованных липидов, 4,1 г концентрата АК после применения метода Li-солей, 4,0 г концентрата АК в виде этиловых эфиров.

Выделение АК в виде этилового эфира проводили методом ВЭЖХ.

Разделение смеси ЖК концентрата АК в виде этиловых эфиров (4,0 г) осуществляли на колонке «Supelco Discovery HS С-18», 250 мм x 50 мм i.d. (размер частиц 10 мкм). Элюирование осуществляли предварительно дегазированной и отфильтрованной системой растворителей этанол-вода, 8 : 2, об./об., при скорости 50 мл/мин.

После разделения, фракции с чистой АК упаривали.

Получена АК в виде этилового эфира, 1,73 г, с чистотой 99,58%.

Общий выход, в расчете на содержание АК в исходном сырье, - 68,9%.

Общее время осуществления способа 5,2 часов.

Пример 3.

Источник АК - красная водоросль Gracilaria vermiculophylla, как в Примере1.

Щелочная экстракция для выделения свободных ЖК, осаждение насыщенных ЖК в виде Li-солей, получение этиловых эфиров ЖК были проведены, как описано в Примере 1.

Были получены последовательно: 7,9 г гидролизованных липидов, 4,0 г концентрата АК после применения метода Li-солей, 3,9 г концентрата АК в виде этиловых эфиров.

Выделение АК в виде этилового эфира проводили методом ВЭЖХ.

Разделение смеси ЖК концентрата АК в виде этиловых эфиров (4,0 г) осуществляли на колонке «Supelco Discovery HS С-18», 250 мм x 50 мм i.d. (размер частиц 10 мкм). Элюирование осуществляли предварительно дегазированной и отфильтрованной системой растворителей этанол-вода, 8 : 2,5, об./об., при скорости 50 мл/мин.

После разделения, фракции с чистой АК упаривали.

Получена АК в виде этилового эфира, 1,71 г, с чистотой 99,65%.

Общий выход, в расчете на содержание АК в исходном сырье, - 68,5%.

Общее время осуществления способа 6 часов.

Пример 4.

Красная водоросль Gracilaria textorii была собрана на юге о. Сахалин (полуостров Крильон), в сентябре 2015 г. До использования весь материал хранили при температуре минус 20⁰С.

Водоросль (300 г) измельчали на гомогенизаторе, гидролизовали липиды 2%-ным раствором КОН в 95%-ном этаноле (1200 мл) при температуре 50⁰С и перемешивании в течение 2-х часов. Далее экстракт фильтровали через плотную ткань, осадок промывали подогретым до 50⁰С 95%-ным этанолом (150 мл). Оба фильтрата объединяли, добавляли воды (1000 мл) и подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН=3. Жирные кислоты экстрагировали петролейным эфиром (3 х 150 мл), объединенный экстракт промывали 1%-ным водным раствором NaCl (200 мл), обезвоживали, пропуская экстракт через сульфат натрия, упаривали. Получено 1,65 г гидролизованных липидов.

Насыщенные жирные кислоты удаляли из смеси процедурой осаждения в виде литиевых солей из ацетона. Гидролизованные липиды (1,65 г) растворяли в 10 мл чистого ацетона. Добавляли 0,1 мл 2%-ного раствора фенолфталеина в ацетоне и при нагреве (40⁰С) оттитровывали свободные жирные кислоты насыщенным водным раствором LiOH (≈ 4N) до появления характерной малиновой окраски (1,3 мл). Далее, к смеси добавляли 16 мл ацетона. Смесь охлаждали до комнатной температуры, выдерживали 1 час, осадок отфильтровывали на бумажном фильтре, ацетоновый фильтрат подкисляли соляной кислотой до рН=3, упаривали. Получено 0,81 г концентрата АК (чистота 68,54%).

Затем концентрат жирных кислот (0,81 г), содержащий арахидоновую кислоту, переводили в этиловые эфиры следующим образом: вносили его в 1%-ный раствор серной кислоты в абсолютированном этаноле (15 мл) нагревали (50⁰С) при перемешивании в течение 1,5 часов, далее разбавляли 20 мл воды и экстрагировали этиловые эфиры ЖК петролейным эфиром (3 х 10 мл), упаривали.

Упаренный экстракт очищали на колонке с силикагелем, элюент - петролейный эфир (30 мл), полученный элюат упаривали. Получено 0,8 г концентрата АК в виде этиловых эфиров.

Выделение АК в виде этилового эфира проводили методом ВЭЖХ. Разделение смеси ЭЭ-ЖК осуществляли на колонке «Supelco Discovery HS С-18», 250 мм x 50 мм i.d. (размер частиц 10 мкм). Элюирование осуществляли предварительно дегазированной и отфильтрованной системой растворителей этанол-вода, 8,0 : 2,0 об./об., при скорости 50 мл/мин.

После разделения, фракции с чистой АК упаривали.

Получена АК в виде этилового эфира, 0,41 г, с чистотой 99,67%.

Общий выход, в расчете на содержание АК в исходном сырье, - 71,2%.

Общее время осуществления способа 5 часов.

В таблице приведены результаты концентрирования АК из Примеров 1-4.

Как видно из представленных результатов, способ обеспечивает получение АК в виде этилового эфира – с чистотой 99,58-99,65% и общим выходом в расчете на содержание АК в исходном сырье – 68,5-71,2%. На данный момент существует очень мало способов концентрирования АК с чистотой продукта – свыше 99%. Суммарный выход по АК в способе – более 68%, это самый высокий выход для продукта такого качества из всех известных.

Таким образом, заявителем предложен несложный и воспроизводимый способ выделения чистой АК из тканей морского растительного происхождения, доступный для реализации в лабораториях и промышленных производствах, использующих АК в биохимических, медицинских и диетологических исследованиях.

Способ получения арахидоновой кислоты, включающий щелочной гидролиз сырья с последующим подкислением гидролизата, удаление насыщенных жирных кислот, перевод жирных кислот в эфиры и выделение целевого продукта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что в качестве сырья используют морскую красную морскую водоросль рода Gracilaria; удаление насыщенных жирных кислот ведут в виде литиевых солей, после чего этерифицируют ненасыщенные жирные кислоты этиловым спиртом и выделяют арахидоновую кислоту в виде этилового эфира методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, на обращенной фазе С-18 с использованием элюирующей системы этанол-вода, при соотношении 8,0 : (1,0-2,5) об./об.