Рекомбинантные векторы hvt, экспрессирующие антигены патогенов птиц и их применение

Рекомбинантные векторы hvt, экспрессирующие антигены патогенов птиц и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет по предварительной заявке U.S. 61/564,877, поданной 30 ноября 2011 г., и предварительной заявке U.S. 61/694,957, поданной 30 августа 2012 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается рекомбинантных вирусных векторов для инсерции (вставки) и экспрессии чужеродных генов для применения в качестве безопасных носителей для иммунизации для защиты от различных патогенов. Оно также касается поливалентной композиции или вакцины, содержащей один или несколько рекомбинантных вирусных векторов для защиты от различных патогенов. Настоящее изобретение касается способов получения и применения рекомбинантных вирусных векторов.

Уровень техники

Вакцинация домашней птицы широко применяется для защиты поголовья птиц от разрушительных заболеваний, в том числе болезни Ньюкасла (ND), инфекционного бурсита (IBD), болезни Марека (MD), инфекционного бронхита (IB), инфекционного ларинготрахеита (ILT) и птичьего гриппа (AI). ND вызывается птичьим парамиксовирусом-1 (APMV-1), который также называют вирусом ND (NDV), принадлежащим к семейству Paramyxoviridae. MD вызывается герпесвирусом-2 куриных (семейство Herpesviridae), который также называют вирусом MD серотипа 1 (MDV1). IB вызывается вирусом IB (IBV), принадлежащим к семейству Coronaviridae, ILT вызывается герпесвирусом-1 куриных (семейство Herpesviridae), который также называют вирусом ILT (ILTV), a AI вызывается вирусом AI (AIV), принадлежащим к семейству Orthomyxoviridae.

Был предложен целый ряд рекомбинантных птичьих вирусных векторов с целью вакцинации птиц против этих птичьих патогенов. Используются такие вирусные векторы, как авипоксвирусы, особенно вируса птичьей оспы (EP-A-0,517,292), вируса болезни Марека, к примеру, серотипов 2 и 3 (HVT) (WO-A-87/04463), или же ITLV, NDV и птичьи аденовирусы. При использовании некоторых из этих рекомбинантных птичьих вирусных векторов для вакцинации они проявляли различные уровни защиты.

Было разработано и лицензировано несколько рекомбинантных векторов на основе герпесвируса индейки (HVT, который также называют герпесвирусом-1 индейковых или MDV серотипа 3), экспрессирующих антигены из различных патогенов (US Patent Nos. 5,980,906, 5,853,733, 6,183,753, 5,187,087), включая IBDV, NDV, ILTV и ATV. Особый интерес представляет вектор HVT, экспрессирующий ген VP2, защищающий от IBDV, который проявлял явное преимущество перед классическими вакцинами от IBD (Bublot et al., J. Comp. Path. 2007, 137, S81-S84; US 5,980,906). Другие представляющие интерес векторы HVT экспрессируют гены, защищающие либо от NDV (Morgan et al., 1992, Avian Dis. 36, 858-70; US 6,866,852; US 5,650,153), либо от ILTV (Johnson et al., 2010, Avian Dis. 54, 1251-1259; US 6,299,882; US 5,853,733). Одна из практических проблем при совместном применении нескольких рекомбинантных вакцин на основе HVT заключается в их интерференции. При смешивании двух рекомбинантных HVT, экспрессирующих различные антигены, снижается защита по меньшей мере от одного из заболеваний (Rudolf Heine 2011; Issues of the poultry recombinant viral vector vaccines which may cause an effect on the economic benefits of those vaccines; paper presented at the XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress in Cancún, Mexico, August 14-18, 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23-25, p 84).

Комбинация из HVT и SB-1, вакцинного штамма герпесвируса-3 куриных (MDV серотипа 2 или MDV-2), проявляла синергический эффект на защиту от MD (Witter and Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). Для решения проблемы интерференции представляет интерес оценка вируса HVT в качестве вакцинного вектора для экспрессии одного или нескольких защитных антигенов от различных птичьих патогенов.

Геном SB-1 был клонирован и охарактеризован в бактериальной искусственной хромосоме (ВАС) (Petherbridge et al., J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al., Research in Veterinary Science 89, 140-145, 2010). Недавно была получена и проанализирована последовательность SB-1 MDV2 (Spatz and Schat, Virus Gene 42, 331-338, 2011). В работе Petherbridge et al. описана делеция гликопротеина E у вируса SB-1 (J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009). Однако не было сообщений об исследованиях с использованием SB-1 в качестве вирусного вектора, экспрессирующего чужеродные защитные гены.

Учитывая потенциальное воздействие таких патогенов животных, как NDV и IBDV, на ветеринарное здравоохранение и экономику, необходимы эффективные методы предотвращения инфекции и защиты животных. Существует потребность в решении проблемы эффективных комбинированных векторных вакцин и подходящего способа получения вакцин, которое могло бы ослабить интерференцию, наблюдаемую между вакцинами с двумя векторами на основе HVT.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение проявляло неожиданный результат, когда поливалентные композиции или вакцины, содержащие одинарные или двойные векторы HVT, оказались эффективными при защите животных от различных патогенов птиц без интерференции. Неожиданные результаты наблюдались и при различных комбинациях промоторов, оптимизированных по кодонам генов, хвостов поли-A и сайтов вставки, которые придавали различные уровни эффективности и стабильности при экспрессии одного или нескольких гетерологичных генов in vivo.

Настоящее изобретение касается рекомбинантных векторов HVT, содержащих один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих по меньшей мере один антиген птичьего патогена.

Настоящим изобретением предусмотрены композиции или вакцины, содержащие один или несколько рекомбинантных векторов HVT, содержащих один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих по меньшей мере один антиген птичьего патогена.

Настоящим изобретением предусмотрены поливалентные композиции или вакцины, содержащие один или несколько рекомбинантных векторов HVT, содержащих гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие по меньшей мере один антиген птичьего патогена, и один или несколько рекомбинантных векторов SB1, содержащих гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие по меньшей мере один антиген птичьего патогена.

Настоящее изобретение касается способа вакцинации животных или вырабатывания иммуногенного или защитного ответа у животных, который включает по меньшей мере одно введение композиции или вектора настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

Нижеследующее подробное описание, которое приводится в качестве примера и не предназначено для ограничения изобретения описанными конкретными воплощениями, станет понятным в сочетании с прилагаемыми фигурами, включенными сюда в виде ссылки.

На фиг. 1 представлена таблица, в которой приведены SEQ ID NOs присвоенные каждой из последовательностей ДНК и белков.

На фиг. 2 представлена структура генома HVT и его сайты инсерции.

На фиг. 3 представлена карта плазмиды pHM103.

На фиг. 4 представлены результаты анализа vHVT114 методом ПЦР.

На фиг. 5 представлены результаты анализа методом двойной иммунофлуоресценции.

На фиг. 6 представлены результаты Саузерн-блота vHVT114.

На фиг. 7 представлены результаты анализа vHVT114 методом иммунопреципитации и Вестерн-блота.

На фиг. 8 представлен анализ методом Вестерн-блота подвергнутого иммунопреципитации образца из инфицированных vHVT306 клеток.

На фиг. 9 представлен анализ методом Вестерн-блота подвергнутого иммунопреципитации образца из инфицированных vSB1-009 клеток.

На фиг. 10 представлены результаты исследования VHVT304 и vHVT114 против заражения NDV ZJ1 и СА02.

На фиг. 11 представлены результаты по выделению вируса после заражения NDV СА02 и ZJ1.

На фиг. 12 представлены результаты по выделению вируса после заражения NDV Chimalhuacan.

На фиг. 13 представлено выравнивание последовательностей и степень их идентичности.

На фиг. 14 представлены последовательности ДНК и белков.

Раскрытие сущности изобретения

Следует отметить, что в настоящем описании и особенно в формуле изобретения такие термины, как "содержит", "состоящий", "содержащий" и т.п. могут иметь смысл, придаваемый им в патентном законодательстве США, т.е. они могут означать "включает", "включающий", "включая" и т.п.; а такие термины, как "состоящий в основном из" и "состоит в основном из" имеют значение, придаваемое им в патентном законодательстве США, т.е. они допускают элементы, не приведенные в явном виде, но исключают элементы, которые встречаются на предшествующем уровне техники либо затрагивают основные или новые характеристики изобретения.

Если не указано иначе, технические термины применяются в соответствии с обычной практикой. Определения распространенных в молекулярной биологии терминов приведены в Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Термины в единственном числе включают значения множественного числа, если из контекста не следует четко иное. Аналогичным образом слово "или" также охватывает "и", если из контекста не следует четко иное. Слово "или" подразумевает любых членов определенного списка, а также включает любые комбинации членов этого списка.

Термин "животное" в настоящем изобретении включает всех млекопитающих, птиц и рыб. При этом животное может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошадь), собачьих (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие большие кошки и другие кошачьи, в том числе гепарды и рыси), бычьих (например, крупный рогатый скот), свиней (например, свиньи), овечьих (например, овцы, козы, ламы, бизоны), птиц (например, куры, утки, гуси, индейки, перепела, фазаны, попугаи, зяблики, ястребы, вороны, страусы, эму и казуары), приматов (например, полуобезьяны, долгопяты, мартышки, гиббоны, человекообразные обезьяны), человека и рыб. Термин "животное" также включает индивидуальных животных на всех стадиях развития, включая стадию эмбриона и плода.

Термины "полипептид" и "белок" применяются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из последовательных аминокислотных остатков.

Термины "нуклеиновая кислота", "нуклеотид" и "полинуклеотид" применяются взаимозаменяемо и обозначают РНК, ДНК, кДНК или кРНК и их производные типа тех, что содержат модифицированные остовы. Следует иметь в виду, что изобретением предусмотрены полинуклеотиды, содержащие последовательности, комплементарные тем, что описаны здесь. "Полинуклеотид", предусмотренный в настоящем изобретении, включает как прямую нить (от 5' к 3'), так и обратную комплементарную нить (от 3' к 5'). Полинуклеотиды по изобретению могут быть получены различными способами (например, путем химического синтеза, клонирования гена и т.д.) и могут принимать различные формы (например, линейную или разветвленную, одноцепочечную или двухцепочечную либо их гибриды, праймеры, зонды и др.).

Термины "геномная ДНК" или "геном" используются взаимозаменяемо и относятся к наследуемой генетической информации организма-хозяина. Геномная ДНК включает ДНК из ядра (также называется хромосомной ДНК), а также ДНК из плазмид (например, хлоропластов) и других клеточных органелл (например, митохондрий). Геномная ДНК или геном в настоящем изобретении также относятся к РНК вирусов. РНК может представлять собой положительную нить или отрицательную нить РНК. Термин "геномная ДНК" в настоящем изобретении включает геномную ДНК, содержащую последовательности, комплементарные тем, что описаны здесь. Термин "геномная ДНК" также относится к матричной РНК (мРНК), комплементарной ДНК (кДНК) и комплементарной РНК (кРНК).

Термин "ген" применяется в широком смысле для обозначения любых сегментов полинуклеотидов, связанных с биологической функцией. Так, гены или полинуклеотиды включают нитроны и экзоны, как в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности, как в кДНК, типа открытой рамки считывания (ORF), начиная со стартового кодона (кодона метионина) и заканчивая сигналом терминации (стоп-кодоном). Гены и полинуклеотиды также могут включать участки, регулирующие их экспрессию, как-то инициацию транскрипции, трансляцию и терминацию транскрипции. Так, к ним также относятся промоторы и участки связывания рибосом (в общем, эти регуляторные элементы располагаются примерно на 60-250 нуклеотидов выше от стартового кодона кодирующей последовательности или гена; Doree SM et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), терминаторы транскрипции (в общем, терминатор располагается примерно на 50 нуклеотидов ниже от стоп-кодона кодирующей последовательности или гена; Ward C K et al.). Ген или полинуклеотид также относится к таким фрагментам нуклеиновой кислоты, которые экспрессируют мРНК или функциональную РНК, либо кодируют определенный белок, а также содержат регуляторные последовательности.

Термин "гетерологичная ДНК" в настоящем изобретении означает ДНК, происходящую из другого организма, как-то из другого типа клеток или другого вида, чем реципиент. Этот термин также относится к ДНК или ее фрагментам в геноме одного и того же организма, но при этом гетерологичная ДНК встроена в участок генома, который отличается от исходного положения.

В настоящем изобретении термин "антиген" или "иммуноген" означает вещество, которое вызывает специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; кусок или фрагмент ДНК, способный вызывать иммунный ответ при презентировании животному-хозяину; полипептид, эпитоп, гаптен или любые их комбинации. С другой стороны, иммуноген или антиген может включать токсин или антитоксин.

Термин "иммуногенный белок или пептид" в настоящем изобретении включает полипептиды, которые являются иммунологически активными в том смысле, что при введении в организм они способны вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против белка. Предпочтительно фрагмент белка должен обладать практически такой же иммунологической активностью, что и целый белок. Таким образом, фрагмент белка по изобретению содержит или состоит в основном или состоит из по меньшей мере одного эпитопа или антигенной детерминанты. "Иммуногенный" белок или полипептид в настоящем изобретении включает полную последовательность белка, его аналоги или иммуногенные фрагменты. Под "иммуногенным фрагментом" понимается такой фрагмент белка, который включает один или несколько эпитопов и тем самым вызывает иммунный ответ, как описано выше. Такие фрагменты могут быть идентифицированы любыми методами картирования эпитопов, хорошо известными в данной области. Например, линейные эпитопы можно определить, например, путем одновременного синтеза большого числа пептидов на твердой подложке, причем пептиды соответствуют частям молекулы белка, и пептидам, проведения реакции пептидов с антителами в то время, когда пептиды все еще прикреплены к подложке. Точно так же легко идентифицируются конформационные эпитопы путем определения пространственной конформации аминокислот, например, при помощи рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса.

Термин "иммуногенный белок или пептид" также охватывает делеции, вставки и замены в последовательности при условии, что полипептид будет функционировать при выработке иммунного ответа, как определено здесь. Термин "консервативная замена" означает такую замену аминокислотного остатка другим биологически сходным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, при которой кодируемый аминокислотный остаток не изменяется или представлен другим биологически сходным остатком. В этом отношении особенно предпочтительные замены являются консервативными по природе, т.е. это такие замены, которые происходят в пределах одного семейства аминокислот. Например, аминокислоты обычно подразделяют на 4 семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда причисляют к ароматическим аминокислотам. Примеры консервативных замен включают замену одного гидрофобного остатка типа изолейцина, валина, лейцин или метионина на другой гидрофобный остаток либо замену одного полярного остатка на другой полярный остаток типа замены аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и т.п. либо аналогичную консервативную замену одной аминокислоты на близкую по структуре аминокислоту, которая не будет оказывать большого эффекта на биологическую активность. Таким образом, белки, имеющие практически такую же аминокислотную последовательность, что и контрольная молекула, но с небольшими аминокислотными заменами, практически не влияющими на иммуногенность белка, попадают под определение контрольного полипептида. Сюда же входят все полипептиды, полученные при таких модификациях. Термин "консервативная замена" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты при условии, что антитела к замещенному полипептиду тоже дают иммунную реакцию с незамещенным полипептидом.

Термином "эпитоп" обозначается тот сайт на антигене или гаптене, на который реагируют специфичные B-клетки и/или T-клетки. Термин также применяется взаимозависимо с "антигенной детерминантой" или "участком антигенной детерминанты". Антитела, распознающие один и тот же эпитоп, можно идентифицировать методом простого иммуноанализа по способности одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном мишени.

"Иммунологический ответ" на композицию или вакцину означает возникновение у хозяина клеточного и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на данную композицию или вакцину. Обычно "иммунологический ответ" включает, без ограничения, один или несколько из следующих эффектов: выработку антител, B-клеток, хелперных T-клеток и/или цитотоксических T-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, входящие в состав данной композиции или вакцины. Предпочтительно у хозяина будет проявляться такой терапевтический либо защитный иммунологический ответ, что у него усилится устойчивость к новой инфекции и/или уменьшится клиническая тяжесть заболевания. Такая защита будет проявляться ослаблением или отсутствием симптомов, которые в норме отмечаются у инфицированного организма, ускорением выздоровления и/или снижением титра вируса у инфицированного организма.

Термины "рекомбинантный" и "генетически модифицированный" применяются взаимозаменяемо и относятся к любым модификациям, изменениям или перестройкам полинуклеотидов или белков в их естественной форме или структуре или же к любым модификациям, изменениям или перестройкам полинуклеотидов или белков в их естественном окружении. Модификации, изменения или перестройки полинуклеотидов или белков могут включать, без ограничения, делецию одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот, делецию целого гена, оптимизацию гена по кодонам, консервативную замену аминокислот, вставку одного или нескольких гетерологичных полинуклеотидов.

Термины "двойная конструкция HVT" или "двойной вектор HVT" относятся к вирусным векторам HVT, содержащим два гетерологичных полинуклеотида.

Термины "поливалентная вакцина или композиция", "комбинированная вакцина или композиция" и "мультивалентная вакцина или композиция" применяются взаимозаменяемо для обозначения композиций или вакцин, содержащих более одной композиции или вакцины. Поливалентная вакцина или композиция может содержать две, три, четыре или больше композиций или вакцин. Поливалентная вакцина или композиция может содержать рекомбинантные вирусные векторы, активные или ослабленные или убитые вирусы дикого типа либо смеси из рекомбинантных вирусных векторов и вирусов дикого типа в активном, ослабленном или убитом виде.

В одном воплощении изобретения предусмотрен рекомбинантный вирусный вектор HVT, содержащий один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих по меньшей мере один антиген или полипептид патогена птиц. Штаммы HVT, используемые для рекомбинантного вирусного вектора, могут быть любые штаммы HVT, включая, без ограничения, штамм FC126 HVT (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989).

В другом воплощении изобретения предусмотрен рекомбинантный вирусный вектор SB-1, содержащий один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих по меньшей мере один антиген или полипептид патогена птиц. Штаммы SB-1 могут быть любые штаммы SB-1, включая, без ограничения, штамм SB-1 из коммерческой вакцины против болезни Марека (вакцины SB-1) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, USA), последовательность генома которого находится в GenBank под номером доступа HQ840738.1.

Гены, кодирующие антиген или полипептид, могут представлять собой гены, кодирующие белок слияния (F) вируса болезни Ньюкасл (NDV-F), нейраминидазу гемагглютинина вируса болезни Ньюкасл (NDV-HN), гликопротеин С вируса болезни Марека (gC), гликопротеин В вируса болезни Марека (gB), гликопротеин Е вируса болезни Марека (gE), гликопротеин I вируса болезни Марека I (gI), гликопротеин Н вируса болезни Марека (gH) или гликопротеин L вируса болезни Марека (gL), VP2 вируса инфекционного бурсита (IBDV), VPX IBDV, VP3 IBDV, VP4 IBDV, гликопротеин В ILTV, гликопротеин I ILTV, UL32 ILTV, гликопротеин D ILTV, гликопротеин Е ILTV, гликопротеин С ILTV, гемагглютинин вируса гриппа (НА), нейраминидазу вируса гриппа (NA), защитные гены из Mycoplasma gallisepticum (MG) или Mycoplasma synoviae (MS) либо их комбинации. Антиген или полипептид может быть представлен любым антигеном из патогена птиц, выбранного из группы, состоящей из вируса птичьего энцефаломиелита, птичьего реовируса, птичьего парамиксовируса, птичьего метапневмовируса, вируса птичьего гриппа, птичьего аденовируса, птичьего поксвируса, птичьего коронавируса, птичьего ротавируса, вируса анемии кур, птичьего астровируса, птичьего парвовируса, возбудителей кокцидиоза (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Pasteurella sp., Avibacterium sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium sp. и E.coli.

Кроме того, в объем настоящего изобретения входят гомологи вышеприведенных антигенов или полинуклеотидов. В настоящем изобретении термин "гомологи" включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин "аналоги" относится к таким двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют одинаковые или близкие функции, но эволюционировали по отдельности у неродственных организмов. Термин "ортологи" относится к таким двум полинуклеотидам или полипептидам из разных видов, которые произошли из общего предкового гена в процессе видообразования. В норме ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или близкие функции. Термин "паралоги" относится к таким двум полинуклеотидам или полипептидам, которые образовались путем дупликации в пределах одного генома. Паралоги обычно имеют разные функции, но эти функции могут быть близкими. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида дикого типа могут отличаться от полипептида дикого типа посттрансляционными модификациями, отличиями по аминокислотной последовательности или теми и другими. В частности, гомологи по изобретению обычно проявляют идентичность последовательности по меньшей мере на 80-85%, 85-90%, 90-95% или на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% по всей или по части последовательности полинуклеотидов или полипептидов описанных выше антигенов и должны проявлять близкие функции.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен рекомбинантный вирусный вектор HVT или SB-1, содержащий один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих антиген или полипептид NDV-F. В одном аспекте этого воплощения антиген или полипептид NDV-F по последовательности по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен полипептиду, имеющему последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35 или 37, либо консервативному варианту, аллельному варианту, гомологу или иммуногенному фрагменту, содержащему по меньшей мере 8 или по меньшей мере 10 последовательных аминокислот одного из этих полипептидов, либо комбинации этих полипептидов. В другом аспекте этого воплощения гетерологичный полинуклеотид кодирует антиген или полипептид NDV-F, который по последовательности по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен полипептиду, имеющему последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35 или 37. В еще одном аспекте этого воплощения гетерологичный полинуклеотид по последовательности по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен полинуклеотиду, имеющему последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 32, 34 или 36.

Варианты включают в себя аллельные варианты. Термин "аллельный вариант" относится к полинуклеотидам или полипептидам, содержащим полиморфизмы, которые приводят к изменению аминокислотной последовательности белка и которые существуют в естественной популяции (например, у вида или разновидности вируса). Такие природные аллельные варианты обычно составляют 1-5% изменчивости полинуклеотида или полипептида. Аллельные варианты можно идентифицировать путем секвенирования данной последовательности нуклеиновой кислоты у целого ряда различных видов, что легко осуществляется с помощью гибридизационных зондов для идентификации генетического локуса одного и того же гена у этих видов. Всевозможные такие вариации нуклеиновой кислоты и возникающие при этом аминокислотные полиморфизмы и варианты, которые являются результатом естественной аллельной изменчивости и не изменяют функциональную активность данного гена, входят в объем настоящего изобретения.

Термин "идентичность" в отношении последовательностей может означать, к примеру, число положений с одинаковыми нуклеотидами или аминокислотами, деленное на общее число нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, при этом выравнивание двух последовательностей может быть определено по алгоритму Уилбура и Липмана (Wilbur and Lipman). Идентичность или сходство по последовательности у двух аминокислотных последовательностей либо идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с помощью пакета программ Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Когда последовательности РНК считаются сходными или имеют некоторую степень идентичности или гомологичности по последовательности с последовательностями ДНК, то тимидин (T) в последовательности ДНК принимается равным урацилу (U) в последовательности РНК. Таким образом, в объем настоящего изобретения также входят последовательности РНК, которые могут быть определены, основываясь на последовательности молекулы ДНК, где тимидин (T) в последовательности ДНК принимается равным урацилу (U) в последовательности РНК.

Полинуклеотиды по изобретению включают последовательности, которые являются вырожденными вследствие вырожденности генетического кода, например, оптимизированные по употребительности кодонов для определенного организма. При этом "оптимизированные" это такие полинуклеотиды, которые подвергались генетической инженерии для усиления экспрессии у данного вида. Для получения оптимизированных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды NDV-F, можно модифицировать последовательность ДНК у гена белка NDV-F так, чтобы она 1) содержала кодоны, которые предпочтительны у генов с очень высоким уровнем экспрессии у данного вида; 2) имела практически такое же содержание A+T или G+C в нуклеотидном составе, которое встречается у данного вида; 3) имела последовательность инициации данного вида; или 4) были устранены последовательности, вызывающие дестабилизацию, неправильное полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК, либо образующие шпильки во вторичной структуре или сайты сплайсинга РНК. Усиление экспрессии белка NDV-F у данного вида достигается при помощи оптимизации последовательности с учетом частоты использования кодонов у эукариот и прокариот или у данного вида. Термин "частота использования предпочтительных кодонов" относится к той предпочтительности, которую проявляют клетки определенного организма при употреблении нуклеотидных кодонов для кодирования определенной аминокислоты. Существует 20 природных аминокислот, большинство которых кодируется более чем одним кодоном. Поэтому в изобретение включены все вырожденные нуклеотидные последовательности, если только аминокислотная последовательность белка NDV-F, кодируемого данной нуклеотидной последовательностью, не будет иметь функциональных изменений.

Успешная экспрессия гетерологичных полинуклеотидов рекомбинантным/модифицированным инфекционным вирусом требует двух условий. Во-первых, гетерологичные полинуклеотиды должны быть вставлены или встроены в некий участок генома вируса таким образом, чтобы модифицированный вирус оставался жизнеспособным. Второе условие для экспрессии встроенных гетерологичных полинуклеотидов заключается в наличии регуляторных последовательностей, обеспечивающих экспрессию гена в вирусном генетическом окружении (к примеру: промотор, энхансер, донорный и акцепторный сайты сплайсинга и интрон, консенсусная последовательность инициации трансляции Козака, сигналы полиаденилирования, нетранслируемые элементы последовательности).

Местом инсерции может быть любой несущественный участок генома HVT, включая, без ограничения, участок между ATG из ORF UL55 и соединение UL с соседним участком повтора (US 5,980,906), локус IG1, локус IG2, локус IG3, локус UL43, локус US10, локус SORF3/US2 (см. фиг. 2).

В общем, целесообразно использовать сильный промотор, функционирующий в эукариотических клетках. Промоторы включают, без ограничения, немедленно ранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор CMV морской свинки, промотор SV40, промоторы вируса псевдобешенства типа промотора гликопротеина X, промоторы вируса Herpes simplex-1 типа промотора альфа-4, промоторы вирусов болезни Марека (включая MDV-1, MDV-2 и HVT) типа управляющих экспрессией гликопротеинов gC, gB, gE или gI, промоторы вируса инфекционного ларинготрахеита типа промоторов генов гликопротеинов gB, gE, gI, gD или промоторы других герпесвирусов.

В одном воплощении изобретения предусмотрен рекомбинантный вектор HVT, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий и экспрессирующий антиген или полипептид NDV-F. В одном аспекте этого воплощения полинуклеотид, кодирующий полипептид NDV-F, функционально связан с промотором SV40, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 9, поэтому экспрессия антигена или полипептида NDV-F регулируется промотором SV40. В другом аспекте этого воплощения экспрессия антигена или полипептида NDV-F регулируется сигналом поли-A SV40, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 11. В еще одном аспекте этого воплощения полинуклеотид, кодирующий полипептид NDV-F, функционально связан с промотором gB MDV, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 38, поэтому экспрессия антигена или полипептида NDV-F регулируется промотором gB MDV.

В другом воплощении изобретения предусмотрен рекомбинантный двойной вектор HVT, содержащий первый гетерологичный полинуклеотид, кодирующий и экспрессирующий антиген или полипептид NDV-F, и второй полинуклеотид, кодирующий и экспрессирующий антиген или полипептид VP2 IBDV. В одном аспекте этого воплощения последовательность антигена или полипептида NDV-F по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида, приведенной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35 или 37. В другом аспекте этого воплощения последовательность антигена или полипептида VP2 IBDV по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида, которая приведена в SEQ ID NO: 8 или 42. В другом аспекте полинуклеотид, кодирующий полипептид NDV-F, функционально связан с промотором SV40, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 9, и экспрессия антигена или полипептида NDV-F регулируется промотором SV40. В еще одном аспекте экспрессия антигена или полипептида NDV-F регулируется сигналом поли-А SV40, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 11, либо синтетическим сигналом поли-A, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 12. В другом аспекте экспрессия антигена или полипептида VP2 IBDV регулируется промотором CMV-IE, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 10, и сигналом поли-А SV40, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 11.

В следующем воплощении изобретения предусмотрен рекомбинантный двойной вектор HVT, содержащий два полинуклеотида, кодирующие и экспрессирующие антигены или полипептиды VP2 IBDV. В одном аспекте этого воплощения последовательность антигена или полипептида VP2 IBDV по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида, приведенной в SEQ ID NO: 8 или 42. В одном аспекте полинуклеотид, кодирующий первый антиген или полипептид VP2 IBDV, функционально связан с промотором CMV-IE, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 10, а полинуклеотид. кодирующий второй антиген или полипептид VP2 IBDV, функционально связан с промотором CMV морской свинки, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 43. В другом аспекте экспрессия первого антигена или полипептида VP2 IBDV регулируется промотором CMV-IE, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 10, и сигналом поли-A SV40, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 11, а экспрессия второго антигена или полипептида VP2 IBDV регулируется промотором CMV морской свинки, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 43, и синтетическим сигналом поли-A, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 12. В следующем аспекте этого воплощения полинуклеотиды, кодирующие антиген или полипептид VP2 IBDV, могут быть вставлены в один или несколько участков локуса, выбранного из группы, состоящей из IG1, IG2, US10, SORF3-US2 и gD в геноме HVT. В одном воплощении настоящее изобретение касается фармацевтической композиции или вакцины, содержащей один или несколько рекомбинантных вирусных векторов HVT или SB-1 настоящего изобретения и фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель, растворитель или адьювант.

В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрена композиция или вакцина, включающая вирусный вектор HVT, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген NDV-F, промотор SV40 и необязательно фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель, растворитель или адьювант. В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция или вакцина, включающая первый вектор HVT, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген NDV-F, второй вектор HVT, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген VP2 IBDV, и необязательно фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель, растворитель или адьювант. В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция или вакцина, включающая вектор HVT, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген NDV-F, вектор SB-1, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген NDV-F, и необязательно фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель, растворитель или адъювант. Фармацевтическая композиция или вакцина настоящего изобретения может содержать первый вектор HVT, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген NDV-F, второй вектор HVT, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген VP2 IBDV, вектор SB-1, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген NDV-F, и необязательно фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель, растворитель или адъювант.

В следующем воплощении настоящего изобретения предусмотрена композиция или вакцина, включающая двойной вирусный вектор HVT, содержащий: i) первый гетерологичный полинуклеотид, кодирующий и экспрессирующий антиген или полипептид NDV-F; ii) второй полинуклеотид, кодирующий и экспрессирующий антиген или полипептид VP2 IBDV; и iii) необязательно фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель, растворитель или адъювант. В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрена композиция или вакцина, включающая двойной вирусный вектор HVT, содержащий два полинуклеотида, кодирующих и экспрессирующих антигены или полипептиды VP2 IBDV, и необязательно фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель, растворитель или адъювант. В следующем воплощении композиция, содержащая двойной вирусный вектор HVT, дополнительно содержит вектор HVT, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген VP2 IBDV, или вектор SB-1,