Иммуногенные композиции pcv2 и способы получения таких композиций

Иммуногенные композиции pcv2 и способы получения таких композиций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки номер 60/640510, поданной 30 декабря 2004 г., и заявки номер 11/034737, поданной 13 января 2005 г., раскрытие и содержание которых приведено здесь в качестве ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Заявка содержит список последовательностей в бумажном формате и в считываемом компьютером формате, объяснения и содержание которого приведено здесь в качестве ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделению белка, экспрессированного с открытой рамки считывания 2 (ORF2) цирковируса свиней типа 2 (PCV2). Более конкретно, белок представляет собой рекомбинантный белок, экспрессированный трансфицированным вирусом, содержащим рекомбинантные кодирующие последовательности для цирковируса свиней типа 2, открытой рамки считывания 2. Еще более конкретно, трансфицированному вирусу позволяют инфицировать клетки в культуральной среде, и белок, экспрессированный с открытой рамки считывания 2, выделяют из супернатанта, а не из внутреннего пространства клеток. Еще более конкретно, способ включает в себя стадии амплификации гена открытой рамки считывания 2 из цирковируса свиней типа 2, клонирования этой амплифицированной части в первый вектор, вырезания части с открытой рамкой считывания 2 из этого вектора и клонирования в вектор-переносчик, котрансфекции клеток в культуральной среде вектором-переносчиком с вирусным вектором, обеспечение возможности инфекции клеток вирусным вектором и таким образом, экспрессии открытой рамки считывания 2, и выделения экспрессированного рекомбинантного белка, кодированного открытой рамкой считывания 2, из супернатанта.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, эффективной для индукции иммунного ответа против PCV2, и способам получения данных иммуногенных композиций. Более конкретно, настоящее изобретение относится к иммунологической композиции, эффективной для обеспечения иммунного ответа, защищающего животное, которому ввели композицию, и снижающего или уменьшающего тяжесть клинических симптомов, связанных с инфекцией PCV2. Еще более конкретно, настоящее изобретение относится к иммунологической композиции на основе белка, обеспечивающей эффективную защиту против инфекции PCV2. Еще более конкретно, настоящее изобретение относится к иммунологической композиции, содержащей ORF2 из PCV2, где введение PCV2-ORF2 приводит к защите против инфекции PCV2. Наиболее конкретно, настоящее изобретение относится к иммунологической композиции, эффективной для обеспечения эффективного иммунитета у свиньи, которой вводят иммунологическую композицию, где композиция содержит белок, экспрессированный с ORF2 из PCV2.

Описание уровня техники

Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) представляет собой небольшой (17-22 нм в диаметре), икосаэдрический ДНК-вирус без внешней оболочки, содержащий одноцепочечный кольцевой геном. PCV2 разделяет приблизительно 80% идентичной последовательности с цирковирусом свиней типа 1 (PCV1). Однако, в отличие от PCV1, который обычно не является вирулентным, у свиней, инфицированных PCV2, обнаруживают синдром с общепринятым обозначением мультисистемный синдром истощения после отъема от свиноматки (PMWS). PMWS клинически характеризуют истощением, бледностью кожи, хилостью, респираторными нарушениями, диареей, желтухой и разлитием желчи. У некоторых пораженных свиней наблюдают сочетание всех симптомов, в то время как у других свиней наблюдают только один или два из этих симптомов. При вскрытии обнаруживают также повреждения во множестве тканей и органов, где преимущественными участками поражений являются лимфоидные органы. Обнаружили сильную корреляцию между количеством нуклеиновой кислоты или антигена PCV2 и тяжестью микроскопических лимфоидных повреждений. Процент смертности для свиней, инфицированных PCV2, может достигать 80%. Помимо PMWS, PCV2 связан с несколькими другими инфекциями, включая псевдобешенство, свиной респираторно-репродуктивный синдром (PRRS), болезнь Глассера, стрептококковый менингит, сальмонеллез, колибациллез после отъема от свиноматки, диетический гепатоз и гнойную бронхопневмонию.

Белок с открытой рамки считывания 2 (ORF2) PCV2, обладающий приблизительной молекулярной массой 30 кДа при прохождении геля для SDS-PAGE, в прошлом использовали в качестве антигенного компонента вакцин против PCV2. Обычные способы получения ORF2 для использования в таких вакцинах, как правило, состоят из амплификации ДНК PCV2, кодирующей ORF2, трансфекции вирусного вектора ДНК ORF2, инфекции клеток вирусным вектором, содержащим ДНК ORF2, обеспечения возможности для вируса экспрессировать белок ORF2 в клетке и выделения белка ORF2 из клеток посредством лизиса клеток. Эти способы, как правило, занимают до приблизительно четырех суток после инфекции клеток вирусным вектором. Однако эти способы обладают тем недостатком, что способы выделения являются как дорогостоящими, так и трудоемкими. Кроме того, количество ORF2, выделенного из клеток, не является очень большим; следовательно, необходимо инфицировать большое число клеток большим числом вирусных векторов, чтобы получить достаточные количества экспрессированного рекомбинантного белка для использования в вакцинах и т.п.

Современные способы иммунизации PCV2 включают в себя вакцины на основе ДНК, такие как описаны в патенте США № 6703023. Однако такие вакцины являлись неэффективными для обеспечения защитного иммунитета против инфекции PCV2 и связанных с ней клинических признаков.

Соответственно, в данной области существовала необходимость способа получения белка ORF2, не требующего выделения белка ORF2 из внутреннего пространства инфицированных клеток. Кроме того, существовала необходимость в способах получения рекомбинантного белка ORF2 в количествах, достаточных для эффективного получения композиции вакцины. Кроме того, существовала еще необходимость в способах получения белка ORF2, не требующих сложных и трудоемких методов, необходимых для существующих способов выделения белка ORF2. Наконец, в отношении композиций, в данной области существовала необходимость в иммуногенной композиции, обеспечивающей защитный иммунитет против инфекции PCV2 и снижающей тяжесть связанных с ней клинических признаков или предотвращающей их.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение преодолевает проблемы, присущие уровню техники и предоставляет определенное преимущество в данной области знаний. Конкретно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к улучшенным способам получения и/или выделения рекомбинантного белка ORF2 PCV2 i) посредством обеспечения возможности инфекции чувствительных клеток в культуре рекомбинантным вирусным вектором, содержащим кодирующие последовательности ДНК ORF2 PCV2, где белок ORF2 экспрессирован посредством рекомбинантного вирусного вектора, и ii) последующим выделением ORF2 из супернатанта. Неожиданно обнаружили, что ORF2 высвобождается в супернатант в больших количествах, если позволить инфекции и последующей инкубации инфицированных клеток протекать дольше, чем в обычном предшествующем способе получения ORF2 PCV2, в котором ORF2 PCV2 выделяют из внутреннего пространства клеток. Более того, что удивительно, обнаружили, что белок ORF2 PCV является устойчивым к прототипической деградации вне продуцирующих клеток. Оба открытия вместе позволяют выделение больших количеств белка ORF2 PCV2 из супернатанта культур клеток, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами, содержащими ДНК ORF2 PCV2 и экспрессирующими белок ORF2 PCV2. Большие количества белка ORF2 PCV2 означают более чем приблизительно 20 мкг/мл супернатанта, предпочтительно более чем приблизительно 25 мкг/мл, еще более предпочтительно, более чем приблизительно 30 мкг/мл, даже более предпочтительно, более чем приблизительно 40 мкг/мл, даже более предпочтительно, более чем приблизительно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно, более чем приблизительно 60 мкг/мл, еще более предпочтительно, более чем приблизительно 80 мкг/мл, еще более предпочтительно, более чем приблизительно 100 мкг/мл, даже более предпочтительно, более чем приблизительно 150 мкг/мл, наиболее предпочтительно, более чем приблизительно 190 мкг/мл. Таких уровней экспрессии можно также достигать, например, способами, как описаны в примерах 1-3.

Предпочтительные культуры клеток обладают числом клеток приблизительно между 0,3-2,0 × 10⁶ клеток/мл, более предпочтительно, от приблизительно 0,35-1,9 × 10⁶ клеток/мл, еще более предпочтительно, от приблизительно 0,4-1,8 × 10⁶ клеток/мл, даже более предпочтительно, от приблизительно 0,45-1,7 × 10⁶ клеток/мл, и наиболее предпочтительно, от приблизительно 0,5-1,5 × 10⁶ клеток/мл. Специалист в данной области может определить предпочтительные клетки. Предпочтительными клетками являются чувствительные к инфекции подходящим рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК ORF2 PCV2, и экспрессирующие белок ORF2 PCV2. Предпочтительно, клетки представляют собой клетки насекомых, и более предпочтительно, они включают в себя клетки насекомых, продаваемые под торговым наименованием клетки насекомых Sf+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT).

Специалисты в данной области могут определить также подходящую культуральную среду, где предпочтительной культуральной средой является бессывороточная среда для клеток насекомых, такая как Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) и подобные. Предпочтительные вирусные векторы включают в себя бакуловирусы, такие как BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), особенно если продуцирующими клетками являются клетки насекомых. Хотя бакуловирусная экспрессирующая система является предпочтительной, специалистам в данной области понятно, что другие экспрессирующие системы подходят для целей по настоящему изобретению, а именно, экспрессии ORF2 PCV2 в супернатанте культуры клеток. Такие другие экспрессирующие системы могут требовать использования сигнальной последовательности, чтобы вызывать экспрессию ORF2 в среду. Неожиданно обнаружили, что когда ORF2 получают в бакуловирусной экспрессирующей системе, не требуется никакой сигнальной последовательности или дополнительной модификации, чтобы вызывать экспрессию ORF2 в среду. Считают, что данный белок может независимо формировать вирусоподобные частицы (Journal of General Virology Vol. 81, pp. 2281-2287 (2000)) и секретироваться в культуральный супернатант. Рекомбинантный вирусный вектор, содержащий последовательности ДНК ORF2 PCV2, обладает предпочтительной множественностью инфекции (MOI) приблизительно между 0,03-1,5, более предпочтительно, от приблизительно 0,05 до 1,3, еще более предпочтительно, от приблизительно 0,09 до 1,1, и наиболее предпочтительно, от приблизительно 0,1 до 1,0 при использовании для инфекции чувствительных клеток. Предпочтительно, вышеупомянутые MOI относятся к одному мл культуральной жидкости. Предпочтительно, описанный здесь способ включает в себя инфекцию 0,35-1,9×10⁶ клеток/мл, еще более предпочтительно, приблизительно 0,4-1,8×10⁶ клеток/мл, даже более предпочтительно, приблизительно 0,45-1,7×10⁶ клеток/мл, и наиболее предпочтительно, приблизительно 0,5-1,5×10⁶ клеток/мл рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК ORF2 PCV2 и экспрессирующим белок ORF PCV2, обладающим MOI (множественностью инфекции) приблизительно между 0,03-1,5, более предпочтительно, от приблизительно 0,05 до 1,3, еще более предпочтительно, от приблизительно 0,09 до 1,1, и наиболее предпочтительно, от приблизительно 0,1 до 1,0.

Затем инфицированные клетки инкубируют в течение периода вплоть до десяти суток, более предпочтительно, от приблизительно двух суток до приблизительно десяти суток, еще более предпочтительно, от приблизительно четырех суток до приблизительно девяти суток, и наиболее предпочтительно, от приблизительно пяти суток до приблизительно восьми суток. Предпочтительные условия инкубации включают в себя температуру приблизительно между 22-32°C, более предпочтительно, от приблизительно 24 до 30°C, еще более предпочтительно приблизительно, от 25 до 29°C, даже более предпочтительно, от приблизительно 26 до 28°C, и наиболее предпочтительно, приблизительно 27°C. Предпочтительно, в клетках Sf+ после инокуляции обследовали индуцированные бакуловирусом характерные изменения. Такие обследования могут включать в себя динамику клеточной плотности и снижение жизнеспособности в течение периода после инфекции. Обнаружили, что пик вирусного титра наблюдают 3-5 суток после инфекции, и пик высвобождения ORF2 из клеток в супернатант получают между 5 и 8 сутками, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до менее чем 10%.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения и/или выделения рекомбинантного белка ORF2 PCV2, предпочтительно, в описанных выше количествах, посредством i) обеспечения возможности инфекции ряда чувствительных клеток (смотри выше) в культуре рекомбинантным вирусным вектором с MOI, как определено выше, ii) экспрессии белка ORF2 PCV2 посредством рекомбинантного вирусного вектора и iii) последующим выделением ORF2 PCV2 из супернатанта клеток, полученного между сутками 5 и 8 после инфекции, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до менее чем 10%. Предпочтительно, рекомбинантный вирусный вектор представляет собой рекомбинантный бакуловирус, содержащий кодирующие последовательности ДНК ORF2 PCV2, и клетки представляют собой клетки Sf+. Кроме того, является предпочтительным периодически обследовать в культуре макроскопическое и микроскопическое проявление контаминации, или атипичные изменения морфологии клеток в течение периода после инфекции. Любую культуру с какими-либо признаками контаминации следует отбраковывать. Предпочтительно, экспрессированный рекомбинантный белок ORF2 секретируется клетками в окружающую культуральную среду, что поддерживает жизнеспособность клеток. Затем ORF2 выделяют из супернатанта, окружающего клетки, а не собственно из клеток.

Процесс выделения предпочтительно начинается с отделения клеточного дебриса от экспрессированного в среду ORF2 посредством стадии разделения. Предпочтительные стадии разделения включают в себя фильтрацию, центрифугирование при скорости до приблизительно 20000 × g, центрифугирование в непрерывном режиме, хроматографическое разделение с использованием ионного обмена или гель-фильтрации и общепринятые иммуноаффинные способы. Эти способы известны специалистам в данной области, например, по (Harris and Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL press Oxford 1995). Наиболее предпочтительные способы разделения включают в себя центрифугирование при скорости до приблизительно 20000 × g и фильтрацию. Предпочтительные способы фильтрации включают в себя тупиковую микрофильтрацию и фильтрацию в тангенциальном потоке (или в поперечном потоке), включая тупиковую микрофильтрацию на полых волокнах. Из этого предпочтительной является тупиковая микрофильтрация. Предпочтительный размер пор для тупиковой микрофильтрации представляет собой приблизительно между 0,30-1,35 мкм, более предпочтительно, приблизительно между 0,35-1,25 мкм, еще более предпочтительно, приблизительно между 0,40-1,10 мкм, и наиболее предпочтительно, приблизительно между 0,45-1,0 мкм. Считают, что любая общепринятая фильтрационная мембрана пригодна для целей по настоящему изобретению и полиэфирсульфоновые мембраны являются предпочтительными. В течение стадии фильтрации удаляют все молекулы нуклеиновой кислоты с малой массой.

Таким образом, в одном из дополнительных аспектов настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения и/или выделения рекомбинантного белка ORF2 PCV2, предпочтительно, в количествах, описанных выше, посредством i) обеспечения возможности инфекции ряда чувствительных клеток (смотри выше) в культуре рекомбинантным вирусным вектором с MOI, как определено выше, ii) экспрессии белка ORF2 PCV2 посредством рекомбинантного вирусного вектора, iii) выделения ORF2 PCV2 из супернатанта клеток, полученных между сутками 5 и 8 после инфекции, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до менее чем 10%, и iv) отделения клеточного дебриса от экспрессированного ORF2 PCV2 посредством стадии разделения. Предпочтительно, рекомбинантный вирусный вектор представляет собой бакуловирус, содержащий кодирующие последовательности ДНК ORF2, и клетки представляют собой клетки SF+. Предпочтительными стадиями центрифугирования являются описанные выше. Наиболее предпочтительной является тупиковая микрофильтрация с использованием мембраны с размером пор приблизительно между 0,30-1,35 мкм, более предпочтительно, приблизительно между 0,35-1,25 мкм, еще более предпочтительно, приблизительно между 0,40-1,10 мкм, и наиболее предпочтительно, приблизительно между 0,45-1,0 мкм.

Для выделения ORF2 PCV2, который будет использован в иммуногенной или иммунологической композиции, такой как вакцина, является предпочтительным включение стадии инактивации для инактивации вирусного вектора. «Иммуногенная или иммунологическая композиция» относится к композиции, содержащей по меньшей мере один антиген, вызывающий у хозяина иммунологический ответ из клеточного и/или опосредованного антителом иммунного ответа на рассматриваемую композицию или вакцину. Как правило, «иммунологический ответ» включает в себя в качестве неограничивающих примеров один или несколько из следующих эффектов: продукция или активация антител, B-клеток, хелперных T-клеток, супрессорных T-клеток, и/или цитотоксических T-клеток и/или γδ T-клеток, направленных специфически против антигена или антигенов, включенных в рассматриваемую композицию или вакцину. Предпочтительно, у хозяина обнаруживают терапевтический или защитный иммунологический ответ, так что устойчивость к новой инфекции будет увеличена и/или клиническая тяжесть заболевания уменьшена. Такую защиту можно продемонстрировать или по уменьшению, или по отсутствию симптомов, в норме обнаруживаемых для инфицированного хозяина, быстрому времени восстановления и/или низкому вирусному титру у инфицированного хозяина. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения и/или выделения рекомбинантного белка ORF2 PCV2, предпочтительно в описанных выше количествах, посредством i) обеспечения возможности инфекции ряда чувствительных клеток (смотри выше) в культуре рекомбинантным вирусным вектором с MOI, как определено выше, ii) экспрессии белка ORF2 PCV2 посредством рекомбинантного вирусного вектора, iii) выделения ORF2 PCV2 из супернатанта клеток, полученного между сутками 5 и 8 после инфекции, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до менее чем 10%, iv) отделения клеточного дебриса от экспрессированного ORF2 PCV2 посредством стадии разделения и v) инактивации рекомбинантного вирусного вектора.

Предпочтительно, данную инактивацию выполняют непосредственно до или сразу после стадии фильтрации, где предпочтительным временем для инактивации является время после стадии фильтрации. Для целей по настоящему изобретению можно использовать любой общепринятый способ инактивации. Так, инактивацию можно проводить посредством химических и/или физических воздействий. В предпочтительных формах определяют объем собранной жидкости и доводят температуру приблизительно до 32-42°C, более предпочтительно, приблизительно до 34-40°C, и наиболее предпочтительно, приблизительно до 35-39°C. Предпочтительные способы инактивации включают в себя добавление циклизованного бинарного этиленимина (BEI), предпочтительно в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 10 мМ, еще более предпочтительно, от приблизительно 2 до приблизительно 8 мМ, еще более предпочтительно, от приблизительно 3 до приблизительно 7 мМ, наиболее предпочтительно, приблизительно 5 мМ. Например, инактивация включает в себя добавление раствора гидробромида 2-бромэтиленамина, предпочтительно приблизительно 0,4 M, циклизованного до 0,2 M бинарного этиленимина (BEI) в 0,3 н NaOH, к жидкостям до конечной концентрации приблизительно 5 мМ BEI. Предпочтительно, затем жидкости постоянно перемешивают в течение 72-96 часов, и инактивированные собранные жидкости можно хранить замороженными при -40°C или ниже, или приблизительно между 1-7°C. После завершения инактивации добавляют раствор тиосульфата натрия, предпочтительно 1,0 М, для нейтрализации всего остаточного BEI. Предпочтительно, тиосульфат натрия добавляют в эквивалентном количестве по сравнению с BEI, предварительно добавленном для инактивации. Например, в случае, если BEI добавляют до конечной концентрации 5 мМ, добавляют 1,0 М раствор тиосульфата натрия до минимальной конечной концентрации 5 мМ для нейтрализации всего остаточного BEI.

Таким образом, в одном из дополнительных аспектов настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка ORF2 PCV2, предпочтительно в описанных выше количествах, посредством i) обеспечения возможности инфекции ряда чувствительных клеток (смотри выше) в культуре рекомбинантным вирусным вектором с MOI, как определено выше, ii) экспрессии белка ORF2 PCV2 посредством рекомбинантного вирусного вектора, iii) выделением ORF2 PCV2 из супернатанта клеток, полученных между 5 и 8 сутками после инфекции, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до менее, чем 10%, iv) отделения клеточного дебриса от экспрессированного ORF2 PCV2 посредством стадии разделения и v) инактивации рекомбинантного вирусного вектора. Предпочтительно, рекомбинантный вирусный вектор представляет собой бакуловирус, содержащий кодирующие последовательности ДНК ORF2 и клетки представляют собой клетки SF+. Предпочтительными способами разделения являются описанные выше, и наиболее предпочтительной является стадия фильтрации. Предпочтительными стадиями инактивации являются описанные выше. Предпочтительно, инактивацию проводят приблизительно между 35-39°C и в присутствии 2-8 мМ BEI, еще более предпочтительно, в присутствии приблизительно 5 мМ BEI. Неожиданно обнаружили, что более высокие концентрации BEI отрицательно влияют на белок ORF2 PCV2.

По одному из дополнительных аспектов по настоящему изобретению, описанный выше способ включает в себя также стадию нейтрализации после стадии v). Данная стадия vi) включает в себя добавление эквивалентного количества вещества, нейтрализующего инактивирующее вещество в растворе. Предпочтительно, если инактивирующим веществом является BEI, предпочтительным является добавление тиосульфата натрия до эквивалентного количества. Таким образом, в дополнительном аспекте, стадия vi) включает в себя добавление раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ, предпочтительно, от приблизительно 2 до приблизительно 10 мМ, еще более предпочтительно, от приблизительно 2 до приблизительно 8 мМ, еще более предпочтительно, от приблизительно 3 до приблизительно 7 мМ, наиболее предпочтительно, приблизительно 5 мМ, где инактивирующим веществом является BEI.

В предпочтительных формах, и особенно в формах с применением рекомбинантного белка ORF2 PCV2 в иммуногенной композиции, такой как вакцина, каждую партию собранного ORF2 будут тестировать по инактивации посредством пассирования в зависимых от прикрепления, чувствительных к бакуловирусу клетках Sf+. В предпочтительной форме данного тестирования, 150 см² монослоя соответствующей культуры клеток инокулируют 1,0 мл инактивированных жидкостей с PCV2 и поддерживают при 25-29°C в течение 14 суток по меньшей мере с двумя пассажами. В конце периода поддержания в монослоях клеток проверяют цитопатогенетический эффект (CPE), типичный для бакуловируса с ORF2 PCV2. Предпочтительно, используют также вирусы для положительного контроля. Такие контроли могут состоять из культуры клеток Sf+, инокулированных не подвергавшимся инактивации контрольным бакуловирусом с ORF2 PCV2, и одного флакона клеток Sf+, оставленных без инокуляции. После инкубации и пассажа, отсутствие инфицированных вирусом клеток для обработанных BEI жидкостей с вирусом будет представлять собой удовлетворительный тест инактивации. Контрольные клетки, инокулированные контрольным вирусом, должны обладать CPE, типичными для бакуловируса с ORF2 PCV2, а во флаконе без инокуляции не должны наблюдать никаких признаков CPE бакуловируса с ORF2 PCV2. Альтернативно, в конце периода поддержания можно собрать образцы супернатанта и инокулировать в Sf+ в 96-луночный планшет, который наполняют клетками Sf+ и затем поддерживают при 25-29°C в течение 5-6 суток. Затем планшет фиксируют и окрашивают антителом против ORF2 PCV2, конъюгированным с FITC. Отсутствие CPE и экспрессии ORF2, как детектируют IFA микроскопией, для обработанных BEI жидкостей с вирусом представляет собой удовлетворительный тест инактивации. Для контрольных клеток, инокулированных контрольным вирусом, должны наблюдать CPE и активность в IFA, а флакон без инокуляции не должен обладать никакими признаками CPE бакуловируса с ORF2 PCV2 и не должен обладать активностью в IFA.

Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к тесту инактивации для определения эффективности инактивации рекомбинантного вирусного вектора, включающего в себя стадии: i) контактирования по меньшей мере части культуральной жидкости, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, с инактивирующим веществом, предпочтительно, как описано выше, ii) добавление нейтрализующего вещества для нейтрализации инактивирующего вещества, предпочтительно как описано выше, и iii) определение остаточной инфекционности в анализах, как описано выше.

После инактивации относительное количество рекомбинантного белка ORF2 PCV2 в образце можно определить рядом способов. Предпочтительные способы количественного определения включают в себя денситометрию после SDS-PAGE, ELISA и исследования вакцинации животных, устанавливающие корреляцию известных количеств вакцины с клиническими исходами (серологией, и т.д.). При использовании для количественной оценки SDS-PAGE образец материала, содержащий неизвестное количество рекомбинантного белка ORF2 PCV2, разделяют в геле вместе с образцами, содержащими различные известные количества рекомбинантного белка ORF2 PCV2. Затем можно получить калибровочную кривую на основе известных образцов, и количество рекомбинантного ORF2 PCV2 в неизвестном образце можно определить посредством сравнения с этой калибровочной кривой. Поскольку анализы ELISA, как правило, являются общепринятыми в качестве промышленного стандарта для определения количества антигена, они являются предпочтительными для количественной оценки.

Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к ELISA для количественной оценки рекомбинантного белка ORF2 PCV2. Предпочтительный ELISA, как представлено здесь, как правило, начинают с разведения антитела для захвата 1:6000 или до подходящего рабочего разведения в покрывающем буфере. Предпочтительным антителом для захвата является свиное анти-PCV2 PAb, очищенное белком G, а предпочтительным покрывающим буфером является 0,05 М карбонатный буфер, который можно получить объединением 2,93 г NaHCO₃ (Sigma Cat № S-6014, или эквивалентный) и 1,59 г NaCO₃ (Sigma Cat. №. S-6139, или эквивалентный). Смесь объединяют с дистиллированной водой или эквивалентом для получения одного литра при pH 9,6±0,1. Затем антитело для захвата разводят 1:6000 или до любого другого рабочего разведения в покрывающем буфере. Например, для четырех планшетов необходимо 42 мл покрывающего буфера и семь мкл антитела для захвата. С использованием способа обратного пипетирования по 100 мкл разведенного антитела для захвата добавляли ко всем лункам. Чтобы получить ровное покрытие, следует осторожно постучать по сторонам каждого планшета. Затем планшеты заклеивали пленками для герметизации перед штабелированием и накрывали стопку пустым 96-луночным планшетом. Планшеты инкубировали в течение ночи (14-24 часов) при 35-39°C. Затем каждый планшет промывали три раза буфером для промывки с использованием системы для промывки титрационных микропланшетов ультра плюс при 250 мкл/промывку с тремя промывками и без времени отмачивания. После последней промывки планшетами следует постучать по бумажному полотенцу. Опять с использованием способа обратного пипетирования во все лунки следует добавить 250 мкл блокирующего раствора. Тестовые планшеты следует заклеить и инкубировать в течение приблизительно одного часа (± пять минут) при 35-37°C. Предпочтительно, после этой стадии планшеты не штабелируют. В течение стадии блокирования все опытные образцы следует достать и оттаять при комнатной температуре. Затем следует подготовить четыре отдельных планшета для разведения посредством добавления 200 мкл разбавляющего раствора ко всем оставшимся лунками, за исключением ряда A и ряда H, колонки 1-3. Затем шесть пробирок следует пометить следующим образом, низкий титр, средний титр, высокий титр, инактивированный/фильтрованный (1:240), инактивированный/фильтрованный (1:480) и внутренний контроль. В обозначенных пробирках следует приготовить соответствующее разведение для следующих тестируемых образцов. Оттаявшие опытные образцы перед использованием следует перемешать со встряхиванием. Для четырех планшетов следует выполнить следующие разведения: A) низкий титр не следует разводить: 3,0 мл с низким титром; B) отрицательный контроль с разведением 1:30 (клетки SF+): 3,77 мл разбавителя + 130 мкл отрицательного контроля; C) средний титр с разведением 1:30 (8 мкг/мл): 3,77 мл разбавителя + 130 мкл со средним титром; D) высокий титр с разведением 1:90 (16 мкг/мл): 2,967 мл разбавителя + 33 мкл с высоким титром; E) инактивированный/фильтрованный с разведением 1:240: 2,39 мл разбавителя + 10 мкл инактивированного/фильтрованного образца; F) инактивированный/фильтрованный с разведением 1:480: 1,0 мл разбавителя + 1,0 мл инактивированного/фильтрованного подготовленного образца (1:240) из E выше; G) внутренний контроль с разведением 1:30: 3,77 мл разбавителя + 130 мкл внутреннего контроля. Затем добавляют 300 мкл подготовленных образцов к соответствующим пустым лункам в планшетах для разведения для планшетов 1-4. Затем устанавливают многоканальную пипетку на 100 мкл, содержимое ряда A перемешивают пипетированием вверх и вниз по меньшей мере 5 раз и затем 100 мкл переносят в ряд B с использованием способа обратного пипетирования. Наконечники следует сменить и ту же самую процедуру повторить по планшету до ряда G. Образцы в этих планшетах для разведения теперь готовы для переноса в тестовые планшеты, как только тестовые планшеты промоют 3 раза буфером для промывки с использованием системы для промывки титрационных микропланшетов ультра плюс (установка на 250 мкл/промывку, 3 промывки, без времени отмачивания). После последней промывки планшетами следует постучать по бумажному полотенцу. Затем содержимое планшетов для разведения переносят в тестовый планшет с использованием простого способа переноса. Более конкретно, начиная с ряда H, 100 мкл/лунку переносят из планшета(планшетов) для разведения в соответствующие лунки тестового планшета(планшетов) с использованием способа обратного пипетирования. После каждого переноса наконечники пипеток следует менять. От ряда G в планшете(планшетах) для разведения переносят 100 мкл/лунку в соответствующие лунки тестового планшета(планшетов) с использованием способа обратного пипетирования. Тот же самый набор наконечников для пипетки можно использовать для остального переноса. Чтобы обеспечить гомогенность раствора для переноса, раствор следует пипетировать вверх и вниз по меньшей мере 3 раза перед переносом. Затем тестовый планшет(ы) заклеивают и инкубируют в течение 1,0 часа ± 5 минут при 37°C±2,0°C. Снова является предпочтительным не штабелировать планшеты. Затем планшеты промывают 3 раза буфером для промывки с использованием системы для промывки титрационных микропланшетов ультра плюс (установка на 250 мкл/промывку, 3 промывки и без времени отмачивания). После последней промывки планшетами постукивают по бумажному полотенцу. С использованием способа обратного пипетирования 100 мкл антитела для детекции, разведенного 1:300, или в соответствующем рабочем разведении в растворе для разведения добавляют во все лунки тестового планшета(планшетов). Например, для четырех планшетов необходимо 42 мл раствора для разведения с 140 мкл антитела для захвата. Затем тестовый планшет(ы) заклеивают и инкубируют в течение 1,0 часа±5 минут при 37°C±2,0°C. Затем планшеты снова промывают 3 раза буфером для промывки с использованием системы для промывки титрационных микропланшетов ультра плюс (установка на 250 мкл/промывку, 3 промывки, и без времени отмачивания). После последней отмывки планшетами постукивают по бумажному полотенцу. Затем получают разбавитель для конъюгата добавлением 1% нормальной сыворотки кролика к разбавителю. Например, для четырех планшетов 420 мкл нормальной сыворотки кролика добавляют к 42 мл разбавителя. Конъюгированное антитело разводят 1:10000, или в любом другом подходящем рабочем разведении в свежеприготовленном растворе для разведения конъюгата для всех лунок тестового планшета(планшетов). С использованием способа обратного пипетирования, 100 мкл данного разбавленного конъюгата антитела добавляют во все лунки. Затем тестовый планшет(ы) заклеивают и инкубируют в течение 45±5 минут при 37°C±2,0°C. Предпочтительно, планшеты не штабелируют. Затем планшеты промывают 3 раза буфером для промывки с использованием системы для промывки титрационных микропланшетов (установка на 250 мкл/промывку, 3 промывки, и без времени отмачивания). После последней промывки планшетами постукивают по бумажному полотенцу. Затем непосредственно перед использованием перемешивают равные объемы субстрата для пероксидазы TMB (реагент A) с раствором пероксидазы B (реагент B). Смешиваемое количество будет меняться в зависимости от количества планшетов, но для каждого планшета будет необходимо 10 мл/планшет + 2 мл. Таким образом, для 4 планшетов это будет составлять 21 мл реагента A + 21 мл реагента B. С использованием способа обратного пипетирования 100 мкл субстрата добавляют ко всем лункам тестового планшета(планшетов). Затем планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут ± 15 секунд. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1 н раствора HCl во все лунки с использованием способа обратного пипетирования. Затем включают спектрофотометр для прочтения планшетов после ELISA и позволяют проходить его обычным фазам диагностики и тестирования общепринятым образом.

В дополнительном аспекте изобретение относится к способу конструирования рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК ORF2 PCV2 и экспрессирующего белок ORF2 PCV2 в больших количествах при инфекции чувствительных клеток. Неожиданно обнаружили, что рекомбинантный вирусный вектор, представленный здесь, экспрессирует большие количества, как определено выше, ORF2 PCV2 после инфекции чувствительных клеток. Таким образом, настоящее изобретение также относится к улучшенному способу получения и/или выделения белка ORF2 PCV2, предпочтительно включающему в себя стадию: конструирования рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК ORF2 PCV2 и экспрессирующего белок ORF2 PCV2. Предпочтительно, вирусный вектор представляет собой рекомбинантный бакуловирус. Подробности способа для конструирования рекомбинантных вирусных векторов, содержащих ДНК ORF2 PCV2 и экспрессирующих белок ORF2 PCV2, как представлено здесь, описаны в следующем: в предпочтительных формах рекомбинантный вирусный вектор, содержащий ДНК ORF2 PCV2 и экспрессирующий белок ORF2 PCV2, применяемый для инфекции клеток, получают трансфекцией вектора-переносчика, обладающего клонированным в нем геном ORF2, в вирусный вектор. Предпочтительно, в вирусный вектор трансфицируют только часть вектора-переносчика, содержащую ДНК ORF2. Термин «трансфицировать в вирусный вектор» означает и использован как синоним для «вставлять» или «клонировать» гетерологичную ДНК в вирусный вектор, например, такой как бакуловирусный вектор. Вирусный вектор предпочтительно, но не обязательно, является бакуловирусом.

Таким образом, согласно дополнительному аспекту по настоящему изобретению, рекомбинантный вирусный вектор получают рекомбинацией между вектором-переносчиком, содержащим гетерологичную ДНК ORF2 PCV2, и вирусным вектором, предпочтительно бакуловирусом, даже более предпочтительно, линеаризованным дефек