Лечение связанных с эритропоэтином (еро) заболеваний путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к еро

Лечение связанных с эритропоэтином (еро) заболеваний путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к еро

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ЗАЯВЛЕННЫЙ ПРИОРИТЕТ

В настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой Соединенных Штатов Америки с регистрационным номером № 61/119961, поданной 4 декабря 2008 г., под названием "RNA Molecules Targeting Erythropoietin and Related Molecules", в полном объеме включенной в настоящее описание в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воплощения настоящего изобретения включают в себя олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию EPO и ассоциированных с ним молекул.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ДНК-РНК- и РНК-РНК-гибридизация важны для многих аспектов функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию, транскрипцию и трансляцию ДНК. Гибридизация является также центральным процессом для множества технологий, в которых производится либо детектирование конкретной нуклеиновой кислоты, либо изменение ее экспрессии. Антисмысловые нуклеотиды, например, прерывают экспрессию гена путем гибридизации с РНК-мишенью, мешая таким образом сплайсингу, транскрипции, трансляции и репликации РНК. Антисмысловая ДНК имеет еще и то дополнительное свойство, что ДНК-РНК-гибриды служат в качестве субстрата для расщепления под действием рибонуклеазы H - активность, которая имеет место в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как это происходит в случае олигодезоксинуклеотидов (ODN), или же они могут быть экспрессированы на основе эндогенных генов, таких как молекулы РНК. В настоящее время комиссией FDA принято антисмысловое лекарственное средство, VITRAVENE^(TM) (для лечения цитомегаловирусного ретинита), что свидетельствует о терапевтической применимости антисмысловых средств.

Повышенная продукция эритроцитов, опосредованная гормоном эритропоэтином (EPO), является хорошо известным адаптивным ответом человека на гипоксию (Bunn et al. (1996), Physiological Rev. 76, 839-845). Обычно продуцируемый почками взрослого человека и эмбриональной печенью, EPO стимулирует развитие в костном мозге предшественников эритроцитов, экспрессирующих рецептор EPO (EpoR).

EPO является гликопротеиновым гормоном (46 кДа), продуцируемым внутри почек почечными интерстициальными клетками, которые регулируют продукцию эритроцитов в костном мозге. Указанные клетки чувствительны к низкой концентрации артериального кислорода и при низких уровнях кислорода (гипоксия) выделяют эритропоэтин. Эритропоэтин стимулирует костный мозг к продуцированию большего количества эритроцитов, повышая таким образом способность переноса кислорода кровью. EPO осуществляет свое действие путем связывания с EpoR на поверхности предшественников эритроцитов в костном мозге. Однако экспрессия EPO обнаружена и на других клетках из других нормальных тканей, помимо почечных интерстициальных клеток, включая энтероциты, трофобласты и нейроны.

Измерение уровня EPO в кровотоке может способствовать выявлению расстройств костного мозга или почечного заболевания. Нормальные уровни эритропоэтина составляют от 0 до 19 мЕд./мл (миллиединиц на миллилитр). Повышенные уровни могут наблюдаться при истинной стойкой красной полицитемии, состоянии, характеризующемся увеличением селезенки и повышенной продукцией эритроцитов костным мозгом. Значения ниже нормальных являются показателем хронической почечной недостаточности, ведущей к анемии. Хроническая почечная недостаточность приводит к анемии отчасти в силу прогрессирующего отсутствия адекватной продукции EPO, необходимой для поддержания эритропоэза.

Гипоксия является доминирующим признаком солидных опухолей, охватывающим приблизительно девяносто процентов всех злокачественных опухолей человека. Адаптивные ответы на гипоксию при солидных опухолях коррелировали с повышенной агрессивностью, с пониженной степенью гибели опухолевых клеток и пониженной реакцией опухоли как на действие радиации, так и на химиотерапевтическое воздействие. Экспрессия EPO наблюдалась при различных гематопоэтических и негематопоэтических злокачественных новообразованиях, и, как было показано, этим был опосредован автономный рост клеток эритроцитарной лейкемии, экспрессирующих EpoR.

Многие распространенные виды злокачественных опухолей человека в повышенных количествах экспрессируют индуцируемый гипоксией фактор транскрипции, HIF-1, который регулирует экспрессию EPO, а также и нескольких генов, необходимых для повышения выживаемости клеток злокачественной опухоли в условиях гипоксии, включая гены, кодирующие гликолитические ферменты, переносчики глюкозы и фактор роста сосудистого эндотелия (Semenza (1999) Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 15, 551-578). Опухолевая гипоксия признана основным фактором в резистентности опухолей к химиотерапии и радиационной терапии, хотя и лежащие в основе этого механизмы неизвестны. Гипоксия индуцирует адаптивные ответы в клетках в большей степени за счет активации экспрессии нескольких генов под регуляторным воздействием индуцируемого гипоксией фактора транскрипции-1 (HIF-1), гетеродимерного фактора транскрипции, состоящего из субъединиц HIF-1α и HIF-1β.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие представлено с целью резюмирования данного изобретения, с кратким указанием природы и предмета изобретения. Оно представлено с расчетом на понимание, что его не следует использовать для интерпретации или ограничения объема защиты изобретения или содержания формулы изобретения.

В одном из воплощений настоящего изобретения предложены способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта путем применения антисмыслового олигонуклеотида (олигонуклеотидов), нацеленного на любую область природного антисмыслового транскрипта, что приводит к повышенной регуляции соответствующего смыслового гена. Здесь также предполагается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто посредством siРНК, рибозимов и малых молекул, которые считаются входящими в объем защиты настоящего изобретения.

Одно из воплощений связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO или другого продукта гена в клетках или тканях пациентов in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности обратного комплемента полинуклеотида, содержащего от 5 до 30 следующих друг за другом нуклеотидов от 1 до 156 в последовательности SEQ ID NO:2 (фигура 3), таким образом модулируя функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов EPO, например, нуклеотидов, указанных в последовательности SEQ ID NO:2, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов, и на комплементарные им последовательности. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов приведены в последовательностях SEQ ID NO: 3-5 (фигура 4).

Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности обратного комплемента антисмыслового полинуклеотида EPO; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт с антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности антисмыслового полинуклеотида EPO; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В предпочтительном воплощении композиция содержит один или более антисмысловых полинуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами EPO.

В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных или замещенных нуклеотидов.

В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированных связей.

Еще в одном предпочтительном воплощении модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, содержащие фосфоротиоат, метилфосфонат, пептид-нуклеиновую кислоту, 2’-O-метил, фторо- или углерод, метилен или другие закрытые молекулы нуклеиновой кислоты (LNA). Предпочтительно, чтобы модифицированные нуклеотиды были закрытыми молекулами нуклеиновой кислоты, включая α-L-LNA.

В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.

В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды вводят в составе фармацевтической композиции. Схема лечения включает в себя введение пациенту антисмысловых соединений по меньшей мере однократно, однако такое лечение может быть модифицировано, с тем, чтобы со временем оно включало в себя введение многократных доз. Такое лечение можно комбинировать с одним или несколькими другими видами терапии.

В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды инкапсулированы в липосомы или прикреплены к молекуле-носителю (например, холестерину, пептиду TAT).

Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности антисмыслового олигонуклеотида по отношению к эритропоэтиновому (EPO) полинуклеотиду; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового олигонуклеотида эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В одном из воплощений экспрессия и/или функция эритропоэтина (EPO) in vivo или in vitro повышена по сравнению с контролем.

В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность олигонуклеотида эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.

В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую и/или некодирующую последовательности нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.

В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на перекрывающиеся и/или неперекрывающиеся последовательности эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.

В одном из воплощений по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид содержит одну или несколько модификаций, выбранных из следующего: по меньшей мере одного модифицированного сахарного фрагмента, по меньшей мере одной модифицированной межнуклеозидной связи, по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида, а также их сочетаний.

В связанном с этим воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере один модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из следующего: 2’-O-метоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2’- метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2’-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента и их сочетаний.

В другом относящемся к этому воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, выбранную из следующего: фосфоротиоата, 2’-O-метоксиэтила (МОЭ), 2’-фторо, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамидата, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.

В другом относящемся к этому воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из следующего: пептид-нуклеиновой кислоты (PNA), закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), арабино-нуклеиновой кислоты (FANA), их аналогов, производных и их сочетаний.

В другом воплощении по меньшей мере один олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну олигонуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательностей SEQ ID NO: 3-5.

Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) гена в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом короткой интерферирующей РНК (siРНК) длиной в 5-30 нуклеотидов, где последовательность указанного по меньшей мере одного олигонуклеотида siРНК по меньшей мере на 50% идентична комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти следующих друг за другом нуклеотидов антисмысловой и/или смысловой молекулы нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; и модуляцию экспрессии и/или функции гена эритропоэтина (EPO) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro.

В одном из воплощений последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% идентична последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежным нуклеиновым кислотам, которые комплементарны антисмысловой и/или смысловой молекуле нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.

Другое воплощение связано со способом модуляции экспрессии и/или функции эритропоэтинового (EPO) гена в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом длиной приблизительно в 5 - 30 нуклеотидов, специфичных в отношении некодирующей и/или кодирующей последовательностей смысловой и/или природной антисмысловой цепи полинуклеотида, кодирующего молекулу эритропоэтина (EPO), при этом последовательность по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида по меньшей мере на 50% идентична по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в виде последовательностей SEQ ID NO:1 и 2; и модуляцию экспрессии и/или функции гена эритропоэтина (EPO) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro.

Другое воплощение настоящего изобретения связано с синтетическим, модифицированным олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация выбрана из следующего: по меньшей мере одного модифицированного сахарного фрагмента; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида; и их сочетаний; при этом указанный олигонуклеотид является антисмысловым соединением, которое гибридизуется с геном эритропоэтина (EPO) и модулирует экспрессию и/или функцию гена эритропоэтина (EPO) in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем.

В одном из воплощений по меньшей мере одна модификация содержит по меньшей мере одну межнуклеотидную связь, выбранную из группы, состоящей из следующего: фосфоротиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамидата, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.

В другом воплощении указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну межнуклеотидную фосфоротиоатную связь.

В связанном с этим воплощении указанный олигонуклеотид содержит остов межнуклеотидных фосфоротиоатных связей.

В одном из воплощений указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из следующего: пептид-нуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), их аналога, производного, а также их сочетаний.

В другом воплощении указанный олигонуклеотид содержит модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из следующего: 2’-O-метоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2’- метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2’-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента и их сочетаний.

В другом воплощении указанный олигонуклеотид составляет в длину по меньшей мере приблизительно от 5 до 30 нуклеотидов и гибридизуется с антисмысловой и/или смысловой цепью эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида, и при этом указанное антисмысловое соединение имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 20% идентичную комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой последовательности нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.

В другом воплощении указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежным нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой кодирующей и/или некодирующей последовательностям эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.

В другом воплощении указанный олигонуклеотид гибридизуется с эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и модулирует экспрессию и/или функцию по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида in vivo или in vitro, по сравнению с нормальным контролем.

В связанном с этим воплощении указанный олигонуклеотид содержит одну из последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.

Одно из воплощений настоящего изобретения связано с композицией, содержащей один или несколько олигонуклеотидов, специфичных в отношении одного или более эритропоэтиновых (EPO) полинуклеотидов, причем указанные полинуклеотиды содержат антисмысловые последовательности, комплементарные последовательности, аллели, гомологи, изоформы, варианты, производные, мутанты, фрагменты или их сочетания.

В связанном с этим воплощении указанные олигонуклеотиды имеют последовательности, по меньшей мере приблизительно на 40% идентичные любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.

В определенном воплощении указанные олигонуклеотиды содержат любую из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.

В одном из воплощений указанные олигонуклеотиды, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5, содержат одну или несколько модификаций или нуклеотидных замен.

В другом воплощении одна или несколько модификаций или нуклеотидных замен выбраны из следующего: фосфоротиоата, метилфосфоната, пептид-нуклеиновой кислоты, молекул закрытой нуклеиновой кислоты (LNA) и их сочетаний.

Одно из воплощений настоящего изобретения связано со способом профилактики или лечения заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом, где указанный способ предусматривает следующее:

введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида, который связывается с природной антисмысловой последовательностью указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида и модулирует экспрессию указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; в результате чего осуществляется профилактика или лечение заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом.

В одном из воплощений заболевание или расстройство, ассоциированное по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом, выбрано из следующего: заболевания, расстройства или состояния гематологического нарушения, заболевания крови, характеризующегося низкой или дефективной продукцией эритроцитов, анемии, серповидноклеточной анемии, бета-талассемии, аномального эритропоэза, беременности или нарушения менструального цикла, ранней анемии недоношенных, почечной недостаточности, хронической почечной недостаточности, гипертонии, заболевания или расстройства, ассоциированного с хирургическим вмешательством, заболевания или расстройства у педиатрического пациента при диализе, заболевания или состояния, ассоциированного с низким гематокритным числом, СПИДа, расстройства, связанного с химиотерапевтическими воздействиями, кистозного фиброза, злокачественной опухоли или опухоли, инфекционного заболевания, венерического заболевания, иммунологически зависимого заболевания и/или аутоиммунного заболевания или расстройства, сердечно-сосудистого заболевания, например, инсульта, гипотонии, задержки сердечных сокращений, ишемии, в частности, ишемически-реперфузионного повреждения, инфаркта миокарда, такого как острый инфаркт миокарда, хронической сердечной недостаточности, стенокардии, гипертрофии сердца, заболевания сердца и легких, искусственного кровообращения, респираторного заболевания, почечного заболевания, заболевания мочевого пузыря/репродуктивной системы, эндокринных расстройств/расстройств метаболизма, желудочно-кишечного заболевания, болезни центральной нервной системы (ЦНС) или периферической нервной системы, при которой прежде всего имеют место неврологические или психиатрические симптомы, связанной с возрастом потери когнитивной функции, детского церебрального паралича, нейродегенертивного заболевания, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Ли, деменции, потери памяти, амиотрофического бокового склероза, алкоголизма, расстройства настроения, тревожного расстройства, болезни дефицита внимания, гиперактивности, аутизма, шизофрении, депрессии, травмы или ишемии головного или спинного мозга, болезни Крейтцфельда-Якоба, офтальмологических заболеваний, эпилепсии, множественного склероза, воспаления, радиационного поражения, дегенерации желтого пятна, диабетической нейропатии, диабетической ретинопатии, глаукомы, ишемии сетчатки и травмы сетчатки, повреждения спинного мозга, состояния в связи с космическим полетом, острой потери крови, старения и состояний при неопластических заболеваниях.

Одно из воплощений настоящего изобретения связано со способом идентификации и селекции по меньшей мере одного олигонуклеотида для введения in vivo, предусматривающим выбор полинуклеотида-мишени, ассоциированного с состоянием болезни; идентификацию олигонуклеотидов, содержащих по меньшей мере пять смежных нуклеотидов, которые комплементарны, в смысловой или в антисмысловой ориентации, выбранному полинуклеотиду-мишени; и измерение температурной точки плавления гибрида антисмыслового олигонуклеотида и полинуклеотида-мишени при жестких условиях гибридизации; и, на основе полученной информации, выбор по меньшей мере одного олигонуклеотида для введения in vivo.

Другие аспекты описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Фигура 1 представляет собой графические результаты ПЦР в режиме реального времени, показывающие кратность различий уровней мРНК EPO после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, вводимыми с помощью полифектамина-2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК EPO в клетках HepG2 значительно увеличиваются через 48 ч. после обработки двумя из siРНК, обозначаемыми как epoas (epoas_1, P=0,02, и epoas_2, P=0,04, Фиг. 1A). В тех же самых примерах уровни РНК epoas были значительно уменьшены после обработки siРНК к epoas (Фиг. 1B). Столбцы, обозначенные как epoas_1, epoas_2, epoas_3, соответствуют образцам, обработанным, соответственно, последовательностями SEQ ID NO. 3, 4 и 5.

На фигуре 2 приведена последовательность SEQ ID NO: 1: мРНК эритропоэтина (EPO), Homo sapiens (Номер доступа в NCBI No.: NM_000799.2), и последовательность SEQ ID NO: 1a означает геномную последовательность EPO (экзоны показаны заглавными буквами, а интроны маленькими).

На фигуре 3 приведена последовательность SEQ ID NO:2: природная антисмысловая последовательность EPO-AS (Номер доступа в NCBI No.: AW798641.1).

На фигуре 4 приведены антисмысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO: 3-5. «r» означает РНК.

На фигуре 5 приведены смысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO:6-8. «r» означает РНК. Это обратные комплементы последовательностей SEQ ID NO: 3-5.

На фигуре 6 показан прямой праймер (SEQ ID NO: 9), обратный праймер (SEQ ID NO: 10) и репортерная последовательность (SEQ ID NO: 11) для специальных анализов, разработанных компанией Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay (Hs00171267_ml).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже описано несколько аспектов настоящего изобретения, со ссылкой на примеры его приложений, приведенные для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные специфические подробности, взаимосвязи и методы приведены для более полного понимания изобретения. Однако рядовому специалисту в данной области будет очевидно, что настоящее изобретение может быть реализовано без какой-либо одной или нескольких из специфических подробностей, или же другими способами. Настоящее изобретение не ограничено порядком действий или процессов, поскольку некоторые действия могут быть выполнены в различном порядке и/или одновременно с другими действиями или процессами. Более того, не все проиллюстрированные действия или процессы являются необходимыми для осуществления методологии согласно настоящему изобретению.

Подразумевается, что все описанные здесь гены, названия генов и продукты генов соответствуют гомологам из любого биологического вида, к которому применимы описанные здесь композиции и способы. Таким образом, указанные термины включают в себя, но не ограничены генами и генными продуктами, полученными из организмов человека и мыши. Подразумевается, что если описан ген или генный продукт из конкретного вида, такое описание предусмотрено только в качестве примера и ни в коем случае не должно быть расценено как ограничение изобретения, если в контексте специально не оговорено иначе. Таким образом, например, в случае описанных здесь генов, которые в некоторых воплощениях связаны с последовательностями нуклеиновых кислот и аминокислотными последовательностями млекопитающих, подразумевается, что они охватывают гомологичные и/или ортологичные генные продукты и продукты генов из других животных, включая рыб, амфибий, рептилий и птиц, и не ограничиваясь остальными млекопитающими. В предпочтительных воплощениях указанные гены или последовательности нуклеиновых кислот относятся к человеку.

Определения

Используемая здесь терминология предназначена лишь для описания конкретных воплощений, а не для ограничения настоящего изобретения. Подразумевается, что использование формы единственного числа включает в себя также и форму множественного числа, если в контексте специально не оговорено иначе. Кроме того, в случае, если термины "включающий" "включает", "имеющий", "имеет" или их варианты используются в подробном описании и/или в формуле изобретения, подразумевается, что такие термины используются в значении "содержащий".

Термин "примерно" или "приблизительно" означает в рамках приемлемого разброса ошибки для конкретной величины, что определяется специалистом в данной области и что отчасти будет зависеть от того, как указанная конкретная величина измеряется или определяется, то есть имеются в виду ограничения измерительной системы. Например, "примерно" может означать в пределах 1 или более чем 1 стандартное отклонение, в соответствии с практикой, принятой в данной области. Альтернативно, "примерно" может означать область вплоть до 20%, предпочтительно, вплоть до 10%, более предпочтительно, вплоть до 5%, и наиболее предпочтительно, вплоть до 1% от данной величины. Альтернативно, в частности, в отношении биологических систем или процессов, указанный термин может означать в пределах порядка величин, предпочтительно, в пределах 5-кратной, и более предпочтительно, в пределах 2-кратной величины. При употреблении конкретных величин в настоящей заявке и в формуле изобретения, если специально не указано иное, должно подразумеваться, что термин "примерно" означает в пределах приемлемого разброса ошибки для конкретной величины.

Используемый здесь термин "мРНК" означает известный в настоящее время мРНК-транскрипт(транскрипты) гена-мишени, а также любые дополнительные транскрипты, которые могут быть выявлены.

Под "антисмысловыми олигонуклеотидами" или "антисмысловым соединением" подразумевается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-мишень, ДНК-мишень). Например, если это олигонуклеотид РНК, он связывается с другой РНК-мишенью путем РНК-РНК-взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени (Eguchi et al, (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Антисмысловой олигонуклеотид может усиливать или ослаблять экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Данное определение означает включение любой чужеродной молекулы РНК или ДНК, которая используется с терапевтической, диагностической или других точек зрения. Такие молекулы включают в себя, например, антисмысловые молекулы РНК или ДНК, РНК-интерференцию (РНКi), микро-РНК, молекулы РНК-ловушек, siРНК, энзиматическую РНК, терапевтическую корректирующую РНК и агонистическую РНК и антагонистическую РНК, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS, external guide sequence), альтернативные сплайсеры, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени. Как таковые, указанные соединения могут быть введены в виде одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.

В контексте настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин "олигонуклеотид" включает в себя также линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или сочленений, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA), закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), фосфоротиоат, метилфосфонат и т.п. Олигонуклеотиды способны к специфическому связыванию с полинуклеотидом-мишенью по регулярной схеме взаимодействий мономера с мономером, такой, какая имеет место при спаривании оснований Уотсона-Крика, спаривании хугстеновских и обратных хугстеновских пар оснований или прочего.

Олигонуклеотид может быть "химерным", то есть состоящим из разных областей. В контексте настоящего изобретения "химерные" соединения являются олигонуклеотидами, которые содержат две или более химических областей, например, область(области) ДНК, область(области) РНК, область(области) PNA и т.д. Каждая химическая область составлена по меньшей мере одной мономерной единицей, то есть нуклеотидом в случае олигонуклеотидного соединения. Такие олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область, в которой указанный олигонуклеотид модифицирован, с тем, чтобы он проявлял одно или более желательных свойств. Желательные свойства олигонуклеотида включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, например, повышенную резистентность к деградации под действием нуклеаз, повышенное поглощение клетками и/или повышенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Разные области олигонуклеотида могут, следовательно, обладать различными свойствами. Химерные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению, как описано выше, могут быть организованы в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или олигонуклеотидных аналогов.

Олигонуклеотид может состоять из областей, которые могут быть связаны в "регистр", то есть когда указанные мономеры связаны последовательно, как в нативной ДНК, или связаны посредством спейсеров. Подразумевается, что спейсеры образуют ковалентный "мостик" между указанными областями и в предпочтительных случаях имеет длину, не превышающую приблизительно 100 атомов углерода. Такие спейсеры могут быть наделены различными функциями, например, они могут нести положительный или отрицательный заряд, могут обладать специфическими свойствами связывания нуклеиновой кислоты (интеркаляторы, вещества, связывающиеся с канавкой, токсины, флюорофоры и т.д.), будучи липофильными, индуцировать образование специальных вторичных структур, например, наподобие аланин-содержащих пептидов, которые индуцируют образование альфа-спиралей.

Здесь термины "EPO" и "эритропоэтин" включают в себя все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.

Здесь, в настоящей заявке, слова эритропоэтин, эпоэтин, EPO и hEPO (человеческий эритропоэтин) используются в качестве взаимозаменяемых понятий.

Здесь термин "олигонуклеотид, специфичный в отношении..." или "олигонуклеотид, который нацелен...", относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную к образованию стабильного комплекса с частью гена-мишени, или (ii) способную к образованию стабильного дуплекса с частью мРНК-транскрипта гена-мишени. Стабильность комплексов и дуплексов может быть определена путем теоретических расчетов и/или в результате анализов in vitro. Примеры анализов для определения стабильности гибридизации комплексов и дуплексов описаны ниже в Примерах.

Здесь термин "нуклеиновая кислота-мишень" включает в себя ДНК, РНК (включая пре-мРНК и мРНК), транскрибируемые с такой ДНК, а также кДНК, полученную с такой РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальному функционированию нуклеиновой кислоты. Такая модуляция функции нуклеиновой кислоты-мишени соединениями, которые специфически с ней гибридизуются, обычно называется "антисмысловой". Такие функции ДНК, которым можно препятствовать, включают в себя, например, репликацию и транскрипцию. Функции РНК, которым можно препятствовать, включают в себя все жизненные функции, такие, например, как транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляцию белка с РНК, сплайсинг РНК, с получением одного или более видов мРНК, а также каталитическую активность, которая может быть блокирована или облегчена посредством РНК. Совокупным эффектом такой интерференции функции нуклеиновой кислоты-мишени является модуляция экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.

Интерференция РНК, "РНКi", опосредована двухцепочечными молекулами РНК (дцРНК), которые имеют специфическую гомологию последовательностей с последовательностями своих нуклеиновых кислот-"мишеней" (Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747). В определенных воплощениях настоящего изобретения такими медиаторами являются "малые интерферирующие" РНК-дуплексы из 5-25 нуклеотидов (siРНК). siРНК получены в результате процессинга siРНК под действием фермента РНКазы, известного как «Dicer» (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409: 363-366). siРНК-дуплексные продукты собираются в мультибелковый комплекс siРНК, называемый RISC (RNA Induced Silencing Complex). Ч