Способ улучшенной трансформации с использованием агробактерии

Способ улучшенной трансформации с использованием агробактерии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 61/576,138, поданной 15 декабря 2011 года.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансформация растений в целом охватывает методики, требуемые и применяемые для введения экспрессируемого растением чужеродного гена в растительные клетки, в результате чего может быть получено фертильное потомство растения, которое стабильно сохраняет и экспрессирует чужеродный ген. Были трансформированы многочисленные представители однодольных и двудольных растений. Трансгенные сельскохозяйственные культуры, а также плодовые и овощные культуры, представляют коммерческий интерес. Такие культуры включают, без ограничения, кукурузу, рис, сою, канолу, подсолнечник, люцерну, сорго, пшеницу, хлопок, арахис, томат, картофель и т.п.

Известно несколько методик введения чужеродного генетического материала в растительные клетки и получения растений, которые стабильно сохраняют и экспрессируют введенный ген. Такие методики включают ускорение генетического материала, нанесенного на микрочастицы, непосредственно в клетки (например, патент США 4945050 и патент США 5141131). Другая технология трансформации включает технологию WHISKERS™ (см., например, патент США 5302523 и патент США 5464765). Для трансформации растений также использовали методику электропорации. См., например, WO 87/06614, патент США 5472869, патент США 5384253, WO 92/09696 и WO 93/21335. Кроме того, может применяться слияние протопластов растения с липосомами, содержащими доставляемую ДНК, прямая инъекция ДНК, а также другие возможные методы.

После интеграции введенной ДНК в геном растения, она обычно остается относительно стабильной в последующих генерациях. Трансформированные клетки в растениях нормально растут. Они могут формировать зародышевые клетки и передавать трансформированный признак(и) потомству растения. Такие растения можно выращивать обычным способом и скрещивать с растениями, у которых есть такие же трансформированные наследственные факторы или другие наследственные факторы. Получаемые гибридные особи обладают соответствующими фенотипическими свойствами, например, способностью контролировать питание насекомых-вредителей растений.

Ряд альтернативных методик также может использоваться для введения ДНК в растительную клетку-хозяина. Такие методики включают, без ограничения, трансформацию T-ДНК, доставляемой Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего агента. Растения могут быть трансформированы с использованием агробактериальной методики, как описано, например, в патенте США 5177010, патенте США 5104310, заявке на европейский патент 0131624B1, заявке на европейский патент 120516, заявке на европейский патент 159418B1, заявке на европейский патент 176112, патенте США 5149645, патенте США 5469976, патенте США 5464763, патенте США 4940838, патенте США 4693976, заявке на европейский патент 116718, заявке на европейский патент 290799, заявке на европейский патент 320500, заявке на европейский патент 604662, заявке на европейский патент 627752, заявке на европейский патент 0267159, заявке на европейский патент 0292435, патенте США 5231019, патенте США 5463174, патенте США 4762785, патенте США 5004863 и патенте США 5159135. Применение T-DNA-содержащих векторов для трансформации растительных клеток было тщательно исследовано и в достаточной мере описано в заявке на европейский патент 120516; An et al., (1985, EMBO J. 4:277-284); Fraley et al., (1986, Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46), а также в Lee and Gelvin (2008, Plant Physiol. 146:325-332), и хорошо известно в данной области.

Наиболее важный первый этап в трансформации растительных клеток посредством Agrobacterium spp. состоит в непосредственном контакте, прикреплении или адгезии бактериальных клеток к клеткам трансформируемого растения-хозяина. После связывания клеток, известна биология переноса T-ДНК из агробактерии в растительные клетки. См., например, Gelvin, 2003, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 67: 16-37; и Gelvin, 2009, Plant Physiol. 150: 1665-1676. Как минимум, по меньшей мере, правый T-ДНК бордерный повтор, но часто и правый бордерный повтор, и левый бордерный повтор Ti или Ri плазмиды присоединены в качестве фланкирующей области генов, которые требуется ввести в растительную клетку. Левые и правые T-ДНК бордерные повторы являются ключевыми цис-действующими последовательностями, требуемыми для переноса T-ДНК. Различные транс-действующие компоненты кодируются полным геномом агробактерии. Наиболее важными из них являются белки, кодируемые vir генами, которые обычно присутствуют в виде ряда оперонов на Ti или Ri плазмидах. Различные Ti и Ri плазмиды несколько отличаются дополнительным элементам vir генов, например, не всегда присутствует virF. Белки, кодируемые vir генами, выполняют множество различных функций, в том числе распознавание и сигнализацию взаимодействия растительной клетки/бактерий, индукцию транскрипции vir генов, формирование канала секреции IV типа, распознавание бордерных повторов T-ДНК, формирование T-цепей, перенос T-цепей в растительную клетку, импорт T-цепей в ядро растительной клетки и интеграцию T-цепей в ядерную хромосому растения, и многие другие. См., например, Tzfira and Citovsky, 2006, Curr. Opin. Biotechnol. 17:147-154.

Если для трансформации используются штаммы Agrobacterium, ДНК, которую предстоит ввести в растительную клетку, можно клонировать в специальные плазмиды, например, либо в промежуточный (шаттл) вектор или в бинарный вектор. Промежуточные векторы не способны к независимой репликации в клетках Agrobacterium, но могут подвергаться манипуляциям и реплицироваться в обычных штаммах Escherichia coli для молекулярного клонирования. Как правило, такие промежуточные векторы включают последовательности, фланкированные правой и левой областями T-ДНК бордерных повторов, которые могут включать ген селективного маркера, функциональный для отбора трансформированных растительных клеток, клонирующий линкер, клонирующий полилинкер или другую последовательность, которая может функционировать как сайт введения генов, предназначенных для трансформации растительной клетки. Клонирование и манипуляции с генами, которые требуется перенести в растения, могут быть, таким образом, легко выполнены с помощью стандартных методов в E. coli при использовании шаттл-вектора в качестве клонирующего вектора. Полностью подготовленный шаттл-вектор может быть затем введен в штаммы Agrobacterium для трансформации растения в целях дальнейшей работы. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium с помощью хелперной плазмиды (посредством бактериальной конъюгации), электропорации, химически опосредованной прямой ДНК трансформации или с использованием других известных методик. Шаттл-векторы могут быть интегрированы в Ti или Ri плазмиду или их производные при гомологичной рекомбинации благодаря последовательностям, которые являются гомологичными между Ti или Ri плазмидой, или их производными и промежуточной плазмидой. Такое событие гомологичной рекомбинации (то есть интеграции плазмиды) обеспечивает, таким образом, способ стабильного сохранения измененного шаттл-вектора в агробактерии, с точкой начала репликации и другими функциями сохранения плазмиды, которые обеспечиваются частью Ti или Ri плазмиды в коинтегрантной плазмиде. Ti или Ri плазмида также включает vir области, включающие vir гены, необходимые для переноса T-ДНК. Как правило, плазмида, несущая vir область, представляет собой мутантную Ti или Ri плазмиду (хелперную плазмиду), из которой была удалена область T-ДНК, включающая правый и левый T-ДНК бордерные повторы. Такие pTi-производные плазмиды, содержащие функциональные vir гены и лишенные всей или почти всей T-области и связанных элементов, описательно именуются в настоящей заявке как хелперные плазмиды.

Супербинарная система является специальным примером системы шаттл-вектора/гомологичной рекомбинации (см. обзор Komari et al., 2006, Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols, pp.15-41; и Komori et al., 2007, Plant Physiol. 145:1155-1160). Штамм LBA4404 (pSB1) несет две независимо реплицирующихся плазмиды, pAL4404 и pSB1. pAL4404 является хелперной плазмидой, полученной на основе Ti-плазмиды, и содержит интактный набор vir генов (из Ti плазмиды pTiACH5), но не имеет T-ДНК области (и, следовательно, не содержит левой и правой последовательностей T-ДНК бордерных повторов). Плазмида pSB1 предоставляет дополнительный частичный набор vir генов, полученных из pTiBo542; этот частичный набор vir генов включает оперон virB и оперон virC, а также гены virG и virD1. Одним из примеров шаттл-векторов, используемых в супербинарной системе является pSB11, который содержит клонирующий полилинкер, который служит сайтом введения генов, предназначенных для трансформации растительной клетки, и фланкирован правой и левой областями T-ДНК бордерных повторов. Шаттл-вектор pSB11 не способен к независимой репликации в агробактерии, но стабильно сохраняется как коинтегрантная плазмида при интеграции в pSB1 посредством гомологичной рекомбинации между обычными последовательностями, присутствующими в pSB1 и pSB11. Таким образом, на полностью модифицированную область T-ДНК, введенную в LBA4404 (pSB1) на модифицированном векторе pSB11, эффективно воздействуют и она переносится в растительные клетки Vir белками, полученными из двух различных агробактериальных Ti-плазмид (pTiACH5 и pTiBo542). Штаммом-хозяином Agrobacterium tumefaciens, используемым с супербинарной системой, является LBA4404 (pSB1). Супербинарная система оказалась особенно полезной при трансформации видов однодольных растений. См. Hiei et al., (1994) Plant J. 6:271-282; и Ishida et al., (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750.

В дополнение к vir генам, содержащимся в Ti плазмидах Agrobacterium, другие, хромосомные гены, регулирующие вирулентность (называемые chv генами), как известно, регулируют некоторые аспекты взаимодействия клеток Agrobacterium и растительных клеток, и таким образом влияют на общую частоту трансформации растения (Pan et al., 1995, Molec. Microbiol. 17:259-269). Несколько хромосомных генов, требуемых для вирулентности и прикрепления, сгруппированы в хромосомном локусе длиной 29 т.п.н. (Matthysse et al., 2000, Biochim. Biophys. Acta 1490:208-212).

В дополнение к многочисленным технологиям трансформации растений, тип ткани, которая контактирует с чужеродными генами, также может быть различным. Такая ткань может включать, без ограничения, эмбриогенную ткань, каллусную ткань I и II типов, гипокотиль и меристему. Почти все растительные ткани могут быть трансформированы во время дедифференцировки при использовании соответствующих методик, известных специалисту. Специалисту в области трансформации растений будет известно, что множество методик доступно для получения трансформированных растений, и что они могут быть изменены и специализированы в соответствии с биологическими различиями между различными видами растений-хозяев. Растительные экспланты (например, части листа, сегменты стебля, меристемы, корни, но также и протопласты или клетки, выращенные в суспензионной культуре) можно успешно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку.

Каллусные культуры. Культуры растительных тканей можно успешно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку, при этом их обычно получают из стерильных частей целого растения, которые могут состоять из частей органов, таких как листья или корни, или могут быть определенными типами клеток, такими как пыльца или эндосперм. Многие свойства экспланта, как известно, влияют на эффективность закладки культуры. Считается, что любая растительная ткань может использоваться в качестве экспланта, если подобраны правильные условия. Как правило, более молодая, более быстро растущая ткань (или ткань на ранней стадии развития) является наиболее эффективной. Экспланты, культивируемые на подходящей среде, могут давать начало неорганизованной, растущей и делящейся массе клеток (каллус). В культуре каллус можно поддерживать более или менее бессрочно, при условии, что его периодически переносят на свежую среду. Во время формирования каллуса присутствует некоторая степень дедифференцировки, как в морфологии (каллус обычно состоит из неспециализированных клеток паренхимы), так и в метаболизме.

Каллусные культуры чрезвычайно важны в биотехнологии растений. Манипуляция соотношениями растительных гормонов в питательной среде может приводить к развитию побегов, корней или соматических зародышей, из которых могут быть впоследствии получены целые растения (регенерация). Каллусные культуры могут также использоваться для инициирования суспензий клеток, которые используются различными способами в исследованиях трансформации растений.

Суспензионные культуры клеток. Каллусные культуры, вообще говоря, относятся к одной из двух категорий: плотные или рыхлые. В плотном каллусе клетки соединены плотно, тогда как в рыхлом каллусе клетки лишь слабо связаны друг с другом, при этом каллус становится мягким и легко разделяется. Рыхлый каллус дает инокулят для формирования суспензионных клеточных культур. Экспланты из некоторых видов растений или определенные типы клеток не склонны к формированию каллуса, что затрудняет закладку суспензии клеток. Рыхлость каллуса можно иногда повышать при манипуляции компонентами сред, путем повторного пересевания или его выращивания на полутвердой среде (среде с низкой концентрацией желирующего вещества). При помещении рыхлого каллуса в жидкую среду и последующем перемешивании, одиночные клетки и/или мелкие комки клеток переходят в среду. При правильных условиях такие высвобожденные клетки продолжают расти и делиться, с получением, в конечном счете, суспензионной клеточной культуры. Суспензии клеток можно поддерживать относительно просто в виде периодических культур в конических колбах и размножать при повторном пересеве в свежую среду. После пересева клетки делятся, и биомасса культуры растет характерным образом. Культуры суспензий клеток можно успешно выращивать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку.

Культура апикальных клеток и меристемы. Верхушки побегов (которые содержат апикальные меристемы) можно культивировать in vitro с получением скоплений побегов либо из пазушных, либо из придаточных почек, и можно успешно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку. Культуры апикальных меристем используются для регенерации зерновых культур (рассада может использоваться в качестве донорного материала).

Зародышальная культура Зародыши могут использоваться в качестве эксплантов для получения каллусных культур или соматических зародышей. В качестве эксплантов могут использоваться как незрелые, так и зрелые зародыши. Незрелый, полученный из зародышей, эмбриогенный каллус представляет собой ткань, используемую при регенерации однодольных растений, и может успешно культивироваться с Agrobacterium tumefaciens для переноса ДНК в растительную клетку. Незрелые зародыши представляют собой интактную ткань, которая способна к делению клеток, давая начало каллусным клеткам, которые могут дифференцироваться с развитием тканей и органов целого растения. Незрелые зародыши могут быть получены из опыленных початков зрелого растения кукурузы, например, из растений, опыленных с использованием методов, описанных в Neuffer et al. (1982, Growing maize for genetic purposes. In: Maize for Biological Research. W. F. Sheridan, Ed. UNIVERSITY PRESS, University of North Dakota, Grand Forks, ND). Примеры методов выделения незрелых зародышей из кукурузы описаны в Green and Phillips (Crop Sci. 15:417-421 (1976)). Незрелые зародыши предпочтительно выделяют из развивающегося початка при использовании асептических методов и выдерживают в стерильной среде до применения. Использование агробактерии в трансформации незрелых зародышей раскрыто в Sidorov & Duncan, (2009, Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize, vol.526 Chapter 4, M. Paul Scott (Ed.)) и в патенте США 5981840.

Культура микроспор. Гаплоидную ткань можно культивировать in vitro при использовании пыльцы или пыльников в качестве экспланта и можно успешно культивировать с Agrobacterium tumefaciens для переноса ДНК в растительную клетку. Каллус и зародыши могут быть получены из пыльцы. Для получения культуры in vitro из гаплоидной ткани могут быть применены два подхода. В первом, пыльники (соматическая ткань, которая окружает и содержит пыльцу) культивируют на твердой среде. Полученные из пыльцы зародыши затем получают при раскрытии зрелых пыльников. Раскрытие пыльника зависит от его выделения на правильной стадии и от правильных условий культивирования. У некоторых видов уверенность в естественном раскрытии можно обеспечить, надрезав стенку пыльника. Во втором методе пыльники культивируют в жидкой среде, и пыльца, высвобождаемая из пыльников, может использоваться для формирования зародышей. Незрелую пыльцу также можно извлекать из развивающихся пыльников и культивировать непосредственно.

Многие зерновые культуры (рис, пшеница, ячмень и кукуруза) требуют среды с добавкой регуляторов роста растения для культуры пыльников или пыльцы. Регенерация из эксплантов микроспор может быть достигнута прямым эмбриогенезом или через стадию каллуса и последующего эмбриогенеза.

Культуры гаплоидных тканей также могут быть инициированы из женского гаметофита (яйцеклетки). В некоторых случаях, это более эффективный метод, чем использование пыльцы или пыльников.

Растения, полученные из гаплоидных культур, могут не быть гаплоидными. Это может быть следствием удвоения хромосом во время периода культивирования. Удвоение хромосом (которое может быть вызвано обработкой такими химическими веществами, как колхицин) может быть преимуществом, поскольку во многих случаях гаплоидные растения не являются желаемым результатом регенерации из гаплоидных тканей. Такие растения часто называются дигаплоидами, поскольку они содержат две копии одного и того же гаплоидного генома.

После трансформации любого из вышеуказанных растительных материалов при культивировании с Agrobacterium tumefaciens для переноса ДНК в растительную клетку, из зараженного растительного материала могут быть регенерированы целые растения после помещения в подходящие условиях роста и питательную среду, которая может содержать антибиотики или гербициды для селекции трансформированных растительных клеток. Растения, полученные таким образом, могут быть затем проверены на присутствие встроенной ДНК.

Трансформация клетки (в том числе трансформация растительной клетки) может включать конструирование вектора экспрессии, который будет функционировать в конкретной клетке. Такой вектор может содержать ДНК, которая включает ген, находящийся под контролем или функционально связанный с регуляторным элементом (например, промотором). Вектор экспрессии может содержать одну или более таких комбинаций функционально связанного гена/ регуляторного элемента. Вектор(ы) может быть в форме плазмиды и может использоваться один или в комбинации с другими плазмидами для получения трансформированных клеток с применением способов трансформации, описанных в настоящей заявке, в целях введения трансгена(ов) в генетический материал растительной клетки.

Векторы экспрессии для растительных клеток могут включать по меньшей мере один генетический маркер, функционально связанный с регуляторным элементом (например, промотором), который позволяет трансформированным клеткам, содержащим маркер, регенерироваться либо в условиях отрицательной селекции (то есть ингибирующей рост клеток, которые не содержат селективного маркерного гена), либо положительной селекции (то есть путем скрининга продукта, кодируемого генетическим маркером). В технологии трансформации известны множество селективных маркерных генов, подходящих для трансформации растений, которые включают, например, гены, кодирующие ферменты, которые метаболически детоксифицируют селективный химический агент, который может быть антибиотиком или гербицидом, или гены, которые кодируют измененную мишень, которая может быть нечувствительной к ингибитору. Несколько методов положительной селекции также известны в уровне техники. Индивидуально используемый селективный маркерный ген может соответственно обеспечить возможность отбора трансформированных клеток, тогда как рост клеток, которые не содержат встроенную ДНК, может быть подавлен селективным соединением. Предпочтение конкретному селективному маркерному гену отдается на усмотрение специалиста, но может использоваться любой из следующих селективных маркеров, а также любой другой ген, не перечисленный в настоящем описании, который мог бы функционировать как селективный маркер. Примеры селективных маркеров включают, без ограничения, устойчивость или резистентность к канамицину, G418, гигромицину, блеомицину, метотрексату, фосфинотрицину (Биалафосу), глифосату, имидазолинонам, сульфонилмочевинам и триазолопиримидиновым гербицидам, таким как хлорсульфурон, бромоксинил и далапон.

В дополнение к селективному маркеру может быть желательным использование репортерного гена. В некоторых случаях репортерный ген может использоваться без селективного маркера. Репортерные гены являются генами, которые обычно не обеспечивают преимуществ роста для реципиентного организма или ткани. Репортерный ген обычно кодирует белок, который предусматривает некоторое фенотипическое изменение или ферментативное свойство. Подходящие репортерные гены включают, без ограничения, гены, которые кодируют бету-глюкуронидазу (GUS), люциферазу светляка или флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или желтый флуоресцентный белок (YFP, по существу как раскрыто в патенте США 7951923).

Независимо от используемой методики трансформации чужеродный ген может быть включен в вектор переноса гена, предназначенный для экспрессии чужеродного гена в растительной клетке при включении в вектор растительного промотора. В дополнение к растительным промоторам, в растительных клетках для экспрессии чужеродных генов могут эффективно использоваться промоторы из множества источников. Например, могут использоваться промоторы бактериального происхождения, такие как промотор октопинсинтазы, промотор нопалинсинтазы, промотор маннопинсинтазы; промоторы вирусного происхождения, такие как 35S и 19S промоторы вируса мозаики цветной капусты (CaMV), промотор из палочковидного вируса сахарного тростника и т.п. Полученные из растений промоторы включают, без ограничения, промотор малой субъединицы (ssu) рибулоза-1,6-бисфосфат (RUBP) карбоксилазы, промотор бета-конглицинина, промотор фазеолина, промотор ADH (алкогольдегидрогеназы), промоторы теплового шока, промотор ADF (фактора деполимеризации актина) и тканеспецифические промоторы. Промоторы могут также содержать некоторые энхансерные элементы последовательности, которые могут повышать эффективность транскрипции. Типичные энхансеры включают, без ограничения, интрон 1 алкогольдегидрогеназы 1 (ADH1) и ADH1-интрон 6. Могут использоваться конститутивные промоторы. Конститутивные промоторы направляют постоянную экспрессию гена практически во всех типах клеток и почти во всех случаях (например, актин, убиквитин, 35S CaMV). Тканеспецифические промоторы отвечают за экспрессию гена в определенных типах клеток или тканей, таких как листья или семена. Примеры других промоторов, которые могут использоваться, включает промоторы, активные во время определенной стадии развития растения, а также промоторы, активные в определенных растительных тканях и органах. Примеры таких промоторов включают, без ограничения, промоторы, которые являются корнеспецифическими, специфическими для пыльцы, эмбриоспецифическими, специфическими для кукурузных рыльцев, специфическими для хлопкового волокна, специфическими для эндосперма семян и флоэма-специфическими.

При некоторых обстоятельствах может быть желательным использование индуцируемого промотора. Индуцируемый промотор отвечает за экспрессию генов в ответ на специфический сигнал, такой как: физический стимул (например, гены теплового шока); свет (например, рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза); гормон (например, глюкокортикоид); антибиотик (например, тетрациклин); метаболиты; и стресс (например, засуха). Также могут использоваться другие желательные элементы транскрипции и трансляции, которые функционируют в растениях, такие как, например, 5’-нетранслируемые лидерные последовательности, а также последовательности 3’ терминации транскрипции РНК и сигнальные последовательности присоединения полиаденилата. Может использоваться любой подходящий растительный вектор переноса гена, известный в уровне техники.

Трансгенные зерновые культуры, содержащие признаки устойчивости к насекомым (IR), широко распространены в растениях кукурузы и хлопка на территории Северной Америки, при этом использование таких признаков возрастает в мировом масштабе. Коммерческие трансгенные зерновые культуры, которые сочетают в себе признаки IR и устойчивости к гербицидам (HT), были разработаны многими компаниями-производителями семян. Они включают комбинации IR признаков, придаваемых инсектицидными белками Bacillus thuringiensis (B.t.), и HT признаков, таких как устойчивость к ингибиторам ацетолактатсинтазы (ALS), таким как сульфонилмочевины, имидазолиноны, триазолопиримидин, сульфонанилиды и т.п., ингибиторам глутаминсинтетазы (GS), таким как биалафос, глуфосинат и т.п., ингибиторам 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD), таким как мезотрион, изоксафлютол и т.п., ингибиторам 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS), таким как глифосат и т.п., и ингибиторам ацетил-кофермент A карбоксилазы (ACCase), таким как галоксифоп, квизалофоп, диклофоп и т.п. Известны другие примеры, в которых трансгенно продуцируемые белки обеспечивают устойчивость растения к классам химических гербицидов, таким как гербициды - производные феноксикислот и пиридилоксиацетатные ауксиновые гербициды (см. WO 2007/053482 A2) или гербициды - производные феноксикислот и арилоксифеноксипропионатные гербициды (см. WO 2005/107437A1). Возможность контролировать несколько проблемных вредителей посредством IR признаков является ценной концепцией коммерческого продукта, причем удобство такой концепции продукта повышается, если признаки контроля насекомых и признаки контроля сорняков сочетаются в одном растении. Более того, более высокая ценность может быть достигнута посредством комбинации в одном растении IR признаков, придаваемых инсектицидным белком B.t., с одним или более дополнительными HT признаками, такими как указанные выше, плюс один или более дополнительных вводных признаков (например, устойчивость к другому насекомому, придаваемая B.t.-производными или другими инсектицидный белками, устойчивость против насекомого, придаваемая такими механизмами, как РНКи и т.п., устойчивость к болезням, устойчивость к стрессу, улучшенная утилизация азота и т.п.) или выходных признаков (например, высокое содержание масел, полезный состав масел, повышенная пищевая ценность и т.п.). Такие комбинации могут быть получены либо с помощью обычного скрещивания (например, селекционный блок) или совместно в качестве нового события трансформации, включающего одновременное введение нескольких генов (например, молекулярный блок). Благоприятные эффекты включают способность контролировать насекомых-вредителей и улучшенный контроль сорняков при выращивании сельскохозяйственного растения, что обеспечивает дополнительные выгоды для производителя и/или потребителя. Таким образом, способы в настоящем описании могут применяться для получения трансформированных растений с комбинациями признаков, которые включают полный агрономический набор для улучшения качества сельскохозяйственной культуры со способностью к гибкому и рентабельному решению любого количества сельскохозяйственных проблем.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описаны способы трансформации растительной клетки. Указанные способы включают контакт растительных клеток с клетками агробактерии в жидкой среде, содержащей поверхностно-активное вещество. Клетки агробактерии могут быть соскоблены с твердой среды или выращены в жидкой питательной среде перед суспендированием в жидкой среде, содержащей поверхностно-активное вещество. Концентрация поверхностно-активного вещества может находиться в пределах от 0,001 процента по весу до 0,08 процента по весу. Поверхностно-активное вещество может быть неионным трисилоксановым поверхностно-активным веществом, при этом может использоваться больше одного поверхностно-активного вещества. Растительные клетки могут быть клетками кукурузы. Растительные клетки могут быть помещены в условия постоянного освещения после контакта с клетками агробактерии.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 - гистограмма, на которой показано улучшение трансформации незрелых зародышей кукурузы при добавлении поверхностно-активного вещества BREAK-THRU^® S 233 в среду инфицирования, используемую для приготовления суспензии клеток агробактерии (несущих плазмиду pEPS1083) перед совместным культивированием.

Фиг. 2 - гистограмма, на которой показано улучшение трансформации незрелых зародышей кукурузы при добавлении поверхностно-активного вещества BREAK-THRU^® S 233 в среду инфицирования, используемую для приготовления суспензии клеток агробактерии перед совместным культивированием. Плазмиды, используемые для каждого эксперимента, показанного на Фигуре 2, включают: Эксперимент 1 = pEPS1053; GOI = IPT, селективный маркер = aad1. Эксперимент 2 = pEPS1038; GOI = GF14, селективный маркер = aad1. Эксперимент 3 и Эксперимент 4 = pEPS1027; без GOI, селективный маркер = aad1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Описаны способы повышения частоты трансформации в растениях при использовании агробактерии. Способы включают контакт растительных клеток с клетками агробактерии в жидкой среде, содержащей поверхностно-активное вещество. Некоторые способы включают пребывание растительных клеток в условиях постоянного освещения после контакта с клетками агробактерии. Примеры растений, которые могут применяться с такими способами, включают растения кукурузы и незрелые зародыши кукурузы.

Штаммы агробактерии отличаются друг от друга по своей способности трансформировать клетки различных видов растений. Независимо от конкретной рассматриваемой комбинации штамма Agrobacterium/растения-хозяина, агробактерия действует посредством прикрепления к клетке-хозяину во время трансформации. См. McCullen and Binns, 2006, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 22: 101-127; и Citovsky et al., 2007, Cell. Microbiol. 9:9-20. Поэтому способы, которые усиливают связывание клеток Agrobacterium с растительными клетками, такие как способы, раскрытые в настоящем описании, в которых применяются поверхностно-активные вещества, могут обеспечить повышение эффективности трансформации. Усиление связывания клеток агробактерии с растительными клетками отличается для различных видов и типов ткани, поскольку различные виды растений, а также различные ткани растения одного вида, могут иметь различный химический и биохимический состав клеточных стенок. Кроме того, такие различия могут также изменяться во время различных стадий развития одной растительной ткани.

Дополнительно, бактерии различных родов и видов, и фактически различные штаммы бактерий разных видов, часто отличаются по химическому и биохимическому составу своих клеточных стенок, причем эти различия могут изменяться во время цикла роста бактерий. Увеличение эффективности трансформации растений способами, раскрытыми в настоящем описании, таким образом, может являться результатом способности поверхностно-активных веществ уменьшать отталкивающие гидрофобные взаимодействия между клеточными стенками агробактерии и стенками растительной клетки, и допускать, таким образом, плотные межклеточные взаимодействия.

Поэтому химические различия между различными поверхностно-активными веществами можно использовать, чтобы способствовать клеточным взаимодействиям между клетками различных штаммов Agrobacterium (и различными фазами роста таких клеток) и клетками и тканями различных растений-хозяев во время различных фаз культивирования растительных тканей, в результате чего можно наблюдать повышение эффективности трансформации.

Поверхностно-активные вещества относятся к нескольким классам химических соединений, при этом специалисту в области трансформации растений будет известно, что для повышения эффективности трансформации растений с различными растениями-хозяевами могут использоваться различные химические классы поверхностно-активных веществ. Примеры поверхностно-активных веществ из этих химических классов, которые могут применяться в способах, раскрытых в настоящем описании, включают вспомогательные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, анионные поверхностно-активные вещества, поверхностно-активные вещества на масляной основе, амфотерные поверхностно-активные вещества и полимерные поверхностно-активные вещества. Примером предпочтительного поверхностно-активного вещества, которое может применяться в способах, описанных в настоящей заявке, является неионное поверхностно-активное вещество, производное трисилоксана, такое как BREAK-THRU® S233 производства Evonik Industries (Essen, Germany). Примеры других предпочтительных поверхностно-активных веществ, которые могут применяться в способах, описанных в настоящей заявке, включают трисилоксан алкоксилаты, этоксилированные соевые масла, этоксилаты спиртов C-13, C₁₂-C₁₄-алкилдиметилбетаины, а также блок-сополимеры ди-втор-бутилфенол этиленоксида - пропиленоксида. В Таблице 1 представлен неограничивающий список поверхностно-активных веществ различных химических типов, которые могут применяться для практического осуществления способов, описанных в настоящей заявке.

Таблица 1
Группы поверхностно-активных веществ, коммерческие наименования и химическое действие/класс
Группа	Торговое наименование	Класс соединения	Производитель
Вспомогательное вещество	BREAK-THRU®S240	Полиэфир-модифицированный полисилоксан	EVONIKINDUSTRIES AG(Essen, Germany)
BREAK-THRU®S243	Органо-модифицированный полисилоксан	EVONIKINDUSTRIES AG
SILWET®HS 429	Гидролитически стабильный силоксан	GE SILICONES(Friendly, WV)
SILWET® 618	Трисилоксан алкоксилат	GE SILICONES.
SILWET® 625	Трисилоксан алкоксилат	GE SILICONES.
SILWET®HS 312	Гидролитически стабильный силоксан	GE SILICONES

	SILWET® L-77	Трисилоксан алкоксилат	GE SILICONES
HI-WETT©	Смесь органосилоксанов и других органических жидкостей	ELLIOTT CHEMICALS LTD.(Aukland, NZ)
Неионное поверхностно-активное вещество	SYLGARD® 309	Неионное силоксановое поверхностно-активное вещество	DOW CORNING(Midland, MI)
AGRIMUL®PG 2069	Алкилполигликозид	HENKEL CORPORATION(Berkeley, CA)
TRYCOL® 5941	Этоксилат спирта C-13 (9 моль EO*)	MONSONCOMPANIES, INC(Leominster, MA)
MAKON® TD-6	Этоксилат спирта C-13 (6 моль EO)	S