Способ обнаружения трансформанта сои рdab9582.814.19.1

Способ обнаружения трансформанта сои рdab9582.814.19.1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент № 61/511658, поданной 26 июля 2011 г., которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Уровень техники

Гены, кодирующие Cry1F и Cry1Ac synpro (Cry1Ac), способны сообщать трансгенным растениям устойчивость к насекомым, например, устойчивость к чешуекрылым насекомым, и ген, кодирующий РАТ (фосфинотрицинацетилтрансферазу), способен сообщать трансгенным растениям устойчивость к гербициду фосфинотрицину (глюфозинат). РАТ был успешно экспрессирован в сое в качестве селектируемого маркера при создании устойчивых к насекомым трансгенных сельскохозяйственных культур и белка, сообщающего трансгенным культурам устойчивость к гербициду глюфозинату в промышленном масштабе.

Известно, что на экспрессию чужеродных генов в растениях влияет их локализация в геноме растения, вероятно, вследствие структуры хроматина (например, гетерохроматина) или близости регулирующих транскрипцию элементов (например, энхансеров) к сайту интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421:477, 1988). В то же время наличие трансгена в других положениях в геноме по-разному влияет на общий фенотип растения. По указанной причине часто необходимо исследовать большое число трансформантов, чтобы обнаружить трансформант, характеризующийся оптимальной экспрессией введенного гена. Например, установлено, что растения и другие организмы могут характеризоваться широким диапазоном изменения уровней экспрессии введенного гена в разных трансформантах. Кроме того, могут иметь место различия в пространственных или временных паттернах экспрессии, например, различия в относительной экспрессии трансгена в разных тканях растения, которые не соответствуют паттернам, предполагаемым на основании регулирующих транскрипцию элементов, присутствующих в конструкции введенного гена. Поэтому обычно получают сотни и тысячи разных трансформантов, которые исследуют с целью обнаружения единственного трансформанта, характеризующегося требуемыми уровнями экспрессии трансгена и паттернами, пригодными для промышленных целей. Трансформант, обладающий требуемыми уровнями или паттернами экспрессии трансгена, пригоден для интрогрессии данного трансгена в другие генетические среды в результате ауткроссинга стандартными методами селекции. Потомство таких гибридов сохраняет характеристики экспрессии трансгена первичного трансформанта. Такая методика позволяет гарантировать надежную экспрессию гена в целом ряде сортов, хорошо адаптированных к местным условиям произрастания.

Необходим метод, позволяющий обнаружить наличие конкретного трансформанта и определить возможность сохранения в потомстве гибрида трансгена или группы представляющих интерес трансгенов. Кроме того, метод обнаружения конкретного трансформанта должен удовлетворять требованиям апробации до поступления на рынок и маркировки продуктов питания, получаемых из рекомбинантных сельскохозяйственных культур, например, в случае контроля за состоянием окружающей среды, контроля признаков сельскохозяйственных культур в полевых условиях или контроля продуктов, полученных из сельскохозяйственных культур, а также для гарантии соответствия положениям или условиям договора.

Трансгенный трансформант можно обнаружить любым методом обнаружения нуклеиновой кислоты, известным в данной области, который включает, не ограничиваясь ими, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или гибридизацию ДНК с использованием зондов к нуклеиновым кислотам. Указанные методы обнаружения обычно основаны на часто используемых генетических элементах, таких как промоторы, терминаторы, гены-маркеры и т.д., так как кодирующая область является взаимозаменяемой для многих конструкций ДНК. Вследствие этого такие методы не позволяют различать разные трансформанты, в частности, такие трансформанты, которые были получены при использовании одной конструкции ДНК или очень схожих конструкций, если не известна последовательность фланкирующей ДНК, расположенная рядом с вставленной гетерологичной ДНК. Например, трансформантспецифический анализ методом ПЦР описан в заявке на патент США № 2006/0070139 для трансформанта кукурузы DAS-59122-7. Необходим простой и чувствительный метод идентификации трансформанта сои pDAB9582.814.19.1.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения нового объекта трансформации трансгенной сои, устойчивого к насекомым и толерантного к гербицидам, который был определен как трансформант сои pDAB9582.814.19.1. В качестве части данного изобретения по меньшей мере 2500 семян линии сои, содержащей трансформант pDAB9582.814.19.1, было депонировано в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) по адресу: 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Указанный депозит был зарегистрирован в АТСС в качестве патентного депозита РТА-12006 21 июля 2011 г. Данный депозит был сделан и будет храниться в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования семян для целей патентной процедуры.

ДНК растений сои, содержащих данный трансформант, включает соединительные/фланкирующие последовательности, рассмотренные в настоящем описании изобретения, которые определяют локализацию ДНК, введенной в геном сои. Трансформант сои pDAB9582.814.19.1 можно диагностировать на основании SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. В частности, трансформант сои pDAB9582.814.19.1 можно диагностировать на основании последовательностей, окружающих места соединения в положении 1400/1401 п.о. и 1536/1537 п.о. SEQ ID NO:1 и 152/153 п.о. SEQ ID NO:2. В нижеследующем абзаце [0009] приведены примеры последовательностей, включающих указанные места соединения, характерные для ДНК сои, содержащей трансформант pDAB9582.814.19.1.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения трансформанта сои pDAB9582.814.19.1 в образце, содержащем ДНК сои, который включает:

(а) приведение указанного образца в контакт с первым праймером длиной по меньшей мере 10 п.о., который избирательно связывается с фланкирующей последовательностью в положении 1-1400 п.о. SEQ ID NO:1 или ее комплементом, и со вторым праймером длиной по меньшей мере 10 п.о., который избирательно связывается со вставочной последовательностью в положении 1401-1836 п.о. SEQ ID NO:1 или ее комплементом;

(b) исследование ампликона, образованного между указанными праймерами; или приведение указанного образца в контакт с первым праймером длиной по меньшей мере 10 п.о., который избирательно связывается с вставочной последовательностью в положении 1-152 п.о. SEQ ID NO:2 или ее комплементом, и со вторым праймером длиной по меньшей мере 10 п.о., который избирательно связывается с фланкирующей последовательностью в положении 153-1550 п.о. SEQ ID NO:2 или ее комплементом; и

(с) исследование ампликона, образованного между указанными праймерами.

Другой вариант осуществления изобретения относится к молекуле выделенной ДНК, позволяющей диагностировать трансформант сои pDAB9582.814.19.1. Такие молекулы включают, помимо SEQ ID NO:1 и 2, участок длиной по меньшей мере 25 п.о., содержащий 1400-1401 п.о. SEQ ID NO:1, и по меньшей мере 10 п.о. SEQ ID NO:1 в каждом направлении от места соединения в положении 1400/1401 п.о.; ампликоны длиной по меньшей мере 25 п.о., содержащие 152-153 п.о. SEQ ID NO:2, и по меньшей мере 10 п.о. SEQ ID NO:2 в каждом направлении от места соединения в положении 152-153 п.о. В качестве примеров можно привести 1385-1415 п.о. SEQ ID NO:1; 1350-1450 п.о. SEQ ID NO:1; 1300-1500 п.о. SEQ ID NO:1; 1200-1600 п.о. SEQ ID NO:1; 137-168 п.о. SEQ ID NO:2; 103-203 п.о. SEQ ID NO:2 и 3-303 п.о. SEQ ID NO:2 и их комплементы.

Настоящее изобретение также относится к анализам, позволяющим обнаружить данный трансформант в образце (например, в образце сои). Указанные анализы могут быть основаны на последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, введенной в геном сои, и на геномных последовательностях, фланкирующих инсерционный сайт. В объем настоящего изобретения также входят наборы и условия выполнения указанных анализов.

Настоящее изобретение частично относится к клонированию и анализу последовательностей ДНК краевых областей, образующихся в результате инсерции Т-ДНК из pDAB9582 в линиях трансгенной сои. Указанные последовательности являются уникальными. На основании вставочных и соединительных последовательностей могут быть созданы и были созданы трансформантспецифические праймеры. Анализ методом ПЦР показал, что указанные трансформанты могут быть идентифицированы в результате анализа ампликонов ПЦР, созданных при использовании наборов трансформантспецифических праймеров. Таким образом, для идентификации линий сои, содержащих трансформант по настоящему изобретению, могут быть использованы вышеуказанные и другие родственные методы.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1 является 5'-концевой фланкирующей краевой последовательностью ДНК трансформанта сои 9582.814.19.1. Нуклеотиды 1-1400 являются геномной последовательностью. Нуклеотиды 1401-1535 являются реаранжированной последовательностью из pDAB9582. Нуклеотиды 1536-1836 являются вставочной последовательностью.

SEQ ID NO:2 является 3'-концевой фланкирующей краевой последовательностью ДНК трансформанта сои 9582.814.19.1. Нуклеотиды 1-152 являются вставочной последовательностью. Нуклеотиды 153-1550 являются геномной последовательностью.

SEQ ID NO:3 является последовательностью ДНК из pDAB9582, которая приведена ниже в таблице 1.

SEQ ID NO:4 является олигонуклеотидным праймером 81419_FW3, используемым для подтверждения 5'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:5 является олигонуклеотидным праймером 81419_RV1, используемым для подтверждения 3'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:6 являектся олигонуклеотидным праймером 81419_RV2, используемым для подтверждения 3'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:7 яляется олигонуклеотидным праймером 81419_RV3, используемым для подтверждения 3'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:8 является олигонуклеотидным праймером 5'IREnd-01, используемым для подтверждения 5'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:9 является олигонуклеотидным праймером 5'IREnd-02, используемым для подтверждения 5'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:10 является олигонуклеотидным праймером AtUbi10RV1, используемым для подтверждения 5'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:11 является олигонуклеотидным праймером AtUbi10RV2, используемым для подтверждения 5'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:12 является олигонуклеотидным праймером 3'PATEnd05, используемым для подтверждения 3'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:13 является олигонуклеотидным праймером 3'PATEnd06, используемым для подтверждения 3'-концевой краевой геномной ДНК.

SEQ ID NO:14 является подтвержденной последовательностью трансформанта сои 9582.814.19.1, которая включает 5'-концевую геномную фланкирующую последовательность, вставку Т-цепи pDAB9582 и 3'-концевую геномную фланкирующую последовательность.

SEQ ID NO:15 является олигонуклеотидным праймером 81419_3'F, используемым для выполнения анализа TAQMAN с целью обнаружения 3'-концевого края трансформанта сои 9582.814.19.1.

SEQ ID NO:16 является олигонуклеотидным праймером 81419_3'R, используемым для выполнения анализа TAQMAN с целью обнаружения 3'-концевого края трансформанта сои 9582.814.19.1.

SEQ ID NO:17 является олигонуклеотидным зондом 81419_3'P, используемым для выполнения анализа TAQMAN с целью обнаружения 3'-концевого края трансформанта сои 9582.814.19.1. Указанный зонд имеет флуоресцентную часть FAM, добавленную к 5'-концу, и гаситель MGB, добавленный 3'-концу.

SEQ ID NO:18 является олигонуклеотидным праймером GMS116F, используемым для выполнения анализа TAQMAN с целью обнаружения эндогенного эталонного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: A286292.1).

SEQ ID NO:19 является олигонуклеотидным праймером GMS116R, используемым для выполнения анализа TAQMAN с целью обнаружения эндогенного эталонного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1).

SEQ ID NO:20 является олигонуклеотидным зондом GMS116, используемым для выполнения анализа TAQMAN с целью обнаружения эндогенного эталонного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1). Указанный зонд имеет флуоресцентную часть НЕХ, добавленную к 5'-концу, и гаситель BHQ, добавленный к 3'-концу.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена плазмидная карта pDAB9582, содержащего полигенный экспрессирующий кластер cry1F, cry1Ac и pat.

На фиг. 2 показана локализация праймеров, используемых для подтверждения 5'- и 3'-концевой краевой последовательности трансформанта сои pDAB9582.814.19.1.

На фиг. 3 показано расположение геномной последовательности в трансформанте сои pDAB9582.814.19.1.

На фиг. 4 показана локализация праймеров и зондов, используемых для выполнения анализа TAQMAN трансформанта сои pDAB9582.814.19.1.

Подробное описание изобретения

Оба конца инсерции трансформанта сои 9582.814.19.1 были секвенированы и исследованы. Были разработаны трансформантспецифические анализы. Указанный трансформант был также картирован на хромосоме 02 генома сои. Данный трансформант может быть введен в другие элитные линии.

Как было указано выше в разделе ”Уровень техники”, введение и интеграция трансгена в геном растения предполагает образование некоторых произвольных трансформантов (отсюда и название ”трансформант” для данной экспрессированной инсерции). То есть при использовании многих методов трансформации, таких как трансформация Agrobacterium, биолистическая трансформация (то есть генное ружье) и трансформация, опосредуемая карбидом кремния, (то есть WHISKERS), невозможно прогнозировать, в какое место генома будет введен трансген. Поэтому идентификация фланкирующей геномной ДНК растения с обеих сторон вставки может иметь важное значение для идентификации растения, содержащего данный инсерционный трансформант. Например, могут быть созданы праймеры для ПЦР, образующие ампликон ПЦР в области соединения вставки с геномом хозяина. Такой ампликон ПЦР может быть использован для идентификации уникального или отличающегося типа инсерционного трансформанта.

В настоящем описании изобретения приведены определения терминов и примеры, способствующие пониманию настоящего изобретения и помогающие специалистам в данной области осуществить настоящее изобретение на практике. За исключением особо оговоренных случаев термины имеют значения, известные специалистам в данной области. Номенклатура оснований ДНК соответствует приведенной в разделе 37 Свода федеральных правил, §1.822.

В использованном здесь значении термин ”потомство” означает потомство любого поколения родительского растения, содержащего трансформант сои pDAB9582.814.19.1.

Трансгенный ”трансформант” получают путем трансформации растительных клеток гетерологичной ДНК, то есть конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей представляющие интерес трансгены, регенерации популяции растений, полученной в результате инсерции указанного трансгена в геном растения, и отбора конкретного растения, характеризующегося наличием инсерции в определенном положении в геноме. Термин ”трансформант” относится к первичному трансформанту и потомству указанного трансформанта, включающему гетерологичную ДНК. Термин ”трансформант” также относится к потомству, полученному в результате ауткроссинга трансформанта с другим сортом, включающим геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного обратного скрещивания с родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь, введенная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) из трансформированной родительской формы присутствует в потомстве гибрида в том же положении в хромосоме. Термин ”трансформант” также относится к ДНК первичного трансформанта и его потомства, включающего введенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность рядом с введенной ДНК, которые должны быть переданы потомству, включая представляющий интерес трансген, в результате скрещивания одной родительской формы, включающей введенную ДНК (например, первичный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), с родительской формой, не содержащей введенную ДНК.

“Соединительная последовательность” или ”краевая последовательность” заполняет участок, на котором ДНК, введенная в геном, связывается с ДНК нативного генома сои, фланкирующей инсерционный участок, при этом для диагностики трансформанта достаточно идентифицировать или обнаружить одну или несколько соединительных последовательностей в генетическом материале растения. К таким последовательностям относятся последовательности ДНК, заполняющие места вставки трансформантов сои по настоящему изобретению, и фланкирующие ДНК одинаковой длины. В настоящем описании изобретения приведены конкретные примеры таких диагностических последовательностей; однако, другие последовательности, которые перекрывают места соединения инсерций или места соединения инсерций и геномной последовательности, также являются диагностическими и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение частично относится к идентификации таких фланкирующих, соединительных и вставочных последовательностей. В объем настоящего изобретения входят соответствующие праймеры и ампликоны ПЦР. В соответствии с настоящим изобретением для обнаружения или идентификации промышленных сортов трансгенной сои или линий, выделенных из линий трансгенной сои, являющихся частной собственностью, могут быть использованы методы ПЦР с применением ампликонов, расположенных рядом с введенной ДНК и ее краевыми последовательностями.

Фланкирующие/соединительные последовательности позволяют диагностировать трансформант сои pDAB9582.814.19.1. На основании указанных последовательностей были созданы трансформантеспецифические праймеры. Анализ методом ПЦР показал, что указанные линии сои можно идентифицировать в разных генотипах сои в результате анализа ампликонов ПЦР, образованных при использовании указанных наборов трансформантспецифических праймеров. Таким образом, вышеуказанные и другие родственные методы могут быть использованы для уникальной идентификации линий сои. Последовательности, идентифицированные в настоящем описании изобретения, являются уникальными.

Методы обнаружения по настоящему изобретению особенно полезны в сочетании с селекцией растений для определения потомства растений, включающего данный трансформант, который был получен после скрещивания родительского растения, включающего представляющий интерес трансформант, с другой линией растений с целью сообщения указанному потомству одного или нескольких дополнительных признаков. Указанные методы ПЦР позволяют эффективно разрабатывать программы селекции сои и контролировать качество, в частности, промышленных семян трансгенной сои. В настоящее время также могут быть созданы и использованы наборы для обнаружения методом ПЦР указанных линий трансгенной сои. Указанные методы также позволяют регистрировать и хранить продукты.

Кроме того, фланкирующие/геномные последовательности сои могут быть использованы для специфической идентификации положения каждой вставки в геноме. Такая информация может быть использована для создания систем молекулярных маркеров, специфичных к каждому трансформанту. Указанные последовательности могут быть использованы для ускоренной селекции и получения данных о сцеплении генов.

Информация о фланкирующих последовательностях может быть далее использованы для изучения и исследования процессов интеграции трансгенов, определения сайтов для интеграции трансгенов в геноме, сортировки трансформантов, определения устойчивости трансгенов и их фланкирующих последовательностей и экспрессии генов (особенно в отношении сайленсинга генов, паттернов метилирования трансгенов, влияния положения и возможных элементов, определяющих экспрессию, таких как MAR [области присоединения матрицы] и тому подобных).

В свете настоящего описания изобретения должно быть ясно, что в объем настоящего изобретения входят семена, депонированные в АТСС под номером, указанным в абзаце [0005]. Настоящее изобретение также относится к растению сои, устойчивому к гербицидам, выращенному из семени, депонированного в АТСС под номером, указанным в абзаце [0005]. Настоящее изобретение далее относится к частям указанного растения, таким как листья, образцы тканей, семена, произведенные указанным растением, пыльца и тому подобные (которые включают cry1F, cry1Ac, par и SEQ ID NO:1 и 2).

В использованном здесь значении термин ”соя” означает вид Glycine max и включает все сорта данного вида, которые могут быть получены путем селекции растения сои.

Молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров при осуществлении метода селекции с использованием маркеров (МАВ). Молекулы ДНК по настоящему изобретению (такие как маркеры AFLP, маркеры RFLP, маркеры RAPD, SNP и SSR) могут быть использованы в методах, позволяющих идентифицировать генетически связанные агрономически полезные признаки, известные в данной области. Признаки устойчивости к насекомым и гербицидам могут быть прослежены в потомстве гибрида растения сои по настоящему изобретению (или в его потомстве и в любом другом культиваре или сорте сои) с помощью методов МАВ. Молекулы ДНК являются маркерами данного признака, и методы МАВ, хорошо известные в данной области, могут быть использованы для отслеживания признака устойчивости к гербицидам в растениях сои, если по меньшей мере одна линия сои по настоящему изобретению или ее потомство было родителем или предком. Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации любого сорта сои, имеющего трансформант по настоящему изобретению.

В использованном здесь значении термин ”линия” означает группу растений, характеризующихся незначительной или отсутствием наследственной изменчивости среди особей в отношении по меньшей мере одного признака. Такие линии могут быть созданы несколькими поколениями самоопыления и селекции или вегетативного размножения из одной родительной формы при помощи методов с использованием культур тканей или клеток.

В использованном здесь значении термины ”культивар” и “сорт” являются синонимами и означают линию, используемую для промышленного производства.

Термин ”устойчивость” или “устойчивый” применительно к определенному компоненту означает сохранение данного компонента из поколения в поколение, предпочтительно на протяжении по меньшей мере трех поколений.

Термин ”коммерческая полезность” означает хорошую мощность растения и высокую фертильность, благодаря которым фермеры могут выращивать данную сельскохозяйственную культуру с использованием обычных сельскохозяйственных машин и могут экстрагировать из семени масло с описанными компонентами при помощи обычного измельчающего и экстрагирующего оборудования.

Термин ”агрономически элитная” означает линию, которая обладает требуемыми агрономическими характеристиками, такими как урожайность, созревание, устойчивость к болезням и тому подобные, помимо устойчивости к насекомых и гербицидам, благодаря наличию одного или нескольких трансформантов по настоящему изобретению. Любые и все указанные агрономические характеристики и данные могут быть использованы для идентификации таких растений на основании одного признака, части диапазона или всего диапазона характеристик, используемых для определения таких растений.

Как должно быть понятно специалисту в данной области в свете настоящего описания изобретения, предпочтительные варианты наборов для обнаружения признаков по настоящему изобретению могут включать, например, зонды и/или праймеры, предназначенные для создания и/или включающие ”соединительные последовательности” или “переходные последовательности” (где геномная фланкирующая последовательность сои стыкуется с вставочной последовательностью). Например, данный набор включает полинуклеотидные зонды, праймеры и/или ампликоны, созданные для идентификации одной или обеих соединительных последовательностей (где вставка стыкуется с фланкирующей последовательностью), представленные в приведенной выше таблице. Одной общей особенностью такого набора является наличие одного праймера, гибридизирующего в фланкирующей области, и одного праймера, гибридизирующего в вставке. Такие праймеры часто имеют длину, равную по меньшей мере примерно ~15 остаткам. Указанные праймеры могут быть использованы для создания/амплификации обнаруживаемого ампликона, указывающего на наличие трансформанта по настоящему изобретению. Праймеры могут быть использованы для создания ампликона, заполняющего (и включающего) вышеуказанную соединительную последовательность.

Праймер, ”обеспечивающий соединение” в фланкирующей последовательности, обычно не гибридизирует на расстоянии более примерно 1200 оснований или за пределами соединения. Таким образом, типичные фланкирующие праймеры включают по меньшей мере 15 остатков цепи в пределах 1200 оснований фланкирующих последовательностей от начала вставки. То есть в объем настоящего изобретения входят праймеры, включающие последовательность соответствующей длины, состоящую из (или гибридизирующую с) пар оснований 800-1400 SEQ ID NO:14 и/или пар оснований 13897-14497 SEQ ID NO:14. Праймеры для вставки могут быть созданы аналогичным образом в любом месте вставки, но для создания таких праймеров могут быть также использованы пары оснований 1400-2000 SEQ ID NO:14 и/или пары оснований 13297-13896 SEQ ID NO:14.

Специалисту в данной области должно быть также известно, что праймеры и зонды могут быть созданы с возможностью гибридизации в стандартных условиях гибридизации и/или ПЦР, когда праймер или зонд не являются полностью комплементарными приведенной последовательности. То есть допустима некоторая степень ошибочного спаривания. Например, в праймере, состоящем примерно из 20 нуклеотидов, обычно один, два или около того нуклеотидов могут не связываться с противоположной цепью, если ошибочно спаренное основание находится внутри или у конца праймера, противоположного ампликону. Ниже приведены разные приемлемые условия гибридизации. В зондах также могут быть использованы синтетические аналоги нуклеотидов, такие как инозин. Также могут быть использованы пептидные зонды нуклеиновых кислот (PNA), а также ДНК- и РНК-зонды. Важно, чтобы такие зонды и праймеры позволяли диагностировать (однозначно идентифицировать и выявлять) наличие трансформанта по настоящему изобретению.

Следует отметить, что при амплификации методом ПЦР могут возникать ошибки, вызывающие, например, незначительные ошибки секвенирования. То есть, за исключением особо оговоренных случаев, последовательности, приведенные в настоящем описании изобретения, были определены в результате создания длинных ампликонов из геномных ДНК сои, после чего ампликоны клонировали и секвенировали. В последовательностях, созданных и определенных таким образом, вполне вероятно, могут быть обнаружены небольшие отличия и незначительные расхождения, связанные с многочисленными циклами амплификации, необходимыми для создания ампликона достаточной длины для секвенирования из геномных ДНК. Специалисту в данной области должно быть понятно, что в объем настоящего изобретения входят любые корректировки, необходимые в связи с возникновением обычных ошибок секвенирования или расхождений указанных типов.

Следует также отметить, что возможно удаление некоторой геномной последовательности, например, при введении последовательности в процессе создания трансформанта. Таким образом, фланкирующие последовательности по настоящему изобретению могут несколько отличаться от геномных последовательностей, представленных, например, в базе данных GENBANK.

Компоненты “вставки” последовательности ДНК показаны на фигурах и более подробно рассмотрены ниже в разделе ”Примеры”. Полинуклеотидные последовательности ДНК указанных компонентов или их фрагменты могут быть использованы в качестве ДНК-праймеров или зондов при осуществлении способов по настоящему изобретению.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способам обнаружения трансгена/инсерционной области генома в растениях, семенах и подобных частях растения сои, и композициям для осуществления указанных способов. Созданы последовательности ДНК, включающие 5'-концевую соединительную последовательность трансгена/инсерционной области генома по настоящему изобретению (между 800-1400 парами оснований SEQ ID NO:14), их сегменты, комплементы приведенных последовательностей и любые их сегменты. Созданы последовательности ДНК, включающие 3'-концевую соединительную последовательность трансгена/инсерционной области генома по настоящему изобретению (между 13897-14497 парами оснований SEQ ID NO:14), их сегменты, комплементы приведенных последовательностей и любые их сегменты. Соединительная последовательность инсерционной области заполняет место соединения между гетерологичной ДНК, введенной в геном, и ДНК из клетки сои, фланкирующей инсерционный сайт. Такие последовательности позволяют диагностировать данный трансформант.

На основании указанной вставки и краевых последовательностей могут быть созданы трансформантспецифические праймеры. Анализ методом ПЦР показал, что линии сои по настоящему изобретению могут быть идентифицированы в разных генотипах сои путем анализа ампликонов ПЦР, созданных с помощью наборов трансформантспецифических праймеров. Для идентификации линий сои по настоящему изобретению могут быть использованы вышеуказанные и другие родственные методы. Таким образом, ампликоны ПЦР, полученные из таких пар праймеров, являются уникальными и могут быть использованы для идентификации указанных линий сои.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к последовательностям ДНК, включающим смежный фрагмент нового трансгена/инсерционной области генома. В объем настоящего изобретения входят последовательности ДНК, включающие полинуклеотиды вставочной последовательности трансгена достаточной длины и полинуклеотиды геномной последовательности сои достаточной длины, из одного или более чем из трех вышеуказанных растений сои, и/или последовательности, пригодные для использования в качестве последовательностей праймеров с целью получения ампликона, позволяющего диагностировать одно или несколько указанных растений сои.

Родственные варианты осуществления изобретения относятся к последовательностям ДНК, включающим по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов части трансгена последовательности ДНК, идентифицированной в настоящем описании изобретения (такой как SEQ ID NO:1 и ее сегменты), или ее комплементов, и фланкирующей последовательности ДНК сои аналогичной длины из указанных последовательностей или их комплементов. Такие последовательности могут быть использованы в качестве ДНК-праймеров при осуществлении методов амплификации ДНК. Ампликоны, полученные с помощью указанных праймеров, позволяют диагностировать любые трансформанты сои по настоящему изобретению. Поэтому настоящее изобретение также относится к ампликонам, полученным с помощью таких ДНК-праймеров и гомологичных праймеров.

Настоящее изобретение также относится к способам обнаружения в образце ДНК, соответствующей трансформанту сои по настоящему изобретению. Такие способы могут включать: (а) приведение образца, включающего ДНК, в контакт с набором праймеров, которые при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с ДНК по меньшей мере одного из указанных трансформантов сои, образуют ампликон, позволяющий диагностировать указанный трансформант; (b) выполнение реакции амплификации нуклеиновой кислоты с образованием ампликона; и (с) обнаружение полученного ампликона.

Другие способы обнаружения по настоящему изобретению включают способ обнаружения в образце ДНК, соответствующей указанному трансформанту, который включает: (а) приведение образца, включающего ДНК, в контакт с праймером, который гибридизирует в строгих условиях гибридизации с ДНК по меньшей мере одного из указанных трансформантов сои и не гибридизирует в строгих условиях гибридизации с ДНК контрольного растения сои (ДНК не представляющего интереса трансформанта); (b) гибридизацию образца и зонда в строгих условиях гибридизации; и (с) обнаружение гибридизации зонда с указанной ДНК.

Наборы для обнаружения ДНК могут быть созданы с использованием композиций по настоящему изобретению и методов, хорошо известных в области обнаружения ДНК. Указанные наборы могут быть использованы для идентификации ДНК трансформанта сои по настоящему изобретению в образце и в процессе селекции растений сои, содержащих указанную ДНК. Наборы включают последовательности ДНК, гомологичные или комплементарные ампликонам, рассмотренным в настоящем описании изобретения, или последовательности ДНК, гомологичные или комплементарные ДНК, содержащейся в генетических элементах трансгена трансформантов по настоящему изобретению. Указанные последовательности ДНК могут быть использованы при осуществлении реакций амплификации ДНК или в качестве зондов в процессе гибридизации ДНК. Наборы могут также содержать реагенты и вещества, необходимые для выполнения данного метода обнаружения.

Термин ”зонд” означает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, к которой присоединена стандартная детектируемая метка или репортерная молекула (такая как радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентное вещество или фермент). Такой зонд является комплементарным цепи нуклеиновой кислоты-мишени в случае настоящего изобретения, цепи геномной ДНК одного из указанных трансформантов сои из растения сои или образца, включающего ДНК данного трансформанта. Зонды по настоящему изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие вещества зонда, которые специфически связываются с последовательностью ДНК-мишени и могут быть использованы для обнаружения указанной последовательности ДНК-мишени.

Термин ”праймеры” означает выделенные/синтезированные нуклеиновые кислоты, которые гибридизированы с цепью комплементарной ДНК-мишени методом гибридизации нуклеиновых кислот с образованием гибрида между праймером и цепью ДНК-мишени и затем удлинены по цепи ДНК-мишени полимеразой, например, ДНК-полимеразой. Пары праймеров по настоящему изобретению используют для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, например, при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других стандартных методов амплификации нуклеиновых кислот.

Зонды и праймеры обычно состоят из

или большего числа полинуклеотидов. Такие зонды и праймеры специфически гибридизируют с последовательностью-мишенью в строгих условиях гибридизации. Зонды и праймеры по настоящему изобретению предпочтительно обладают полным сходством последовательности с последовательностью-мишенью, хотя стандартными методами могут быть созданы зонды, отличающиеся от последовательности-мишени, но сохраняющие способность гибридизировать с последовательностями-мишенями.

Методы получения и использования зондов и праймеров описаны, например, в публикации Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Пары праймеров для ПЦР могут быть выделены из известной последовательности, например, при помощи компьютерных программ, предназначенных для указанной цели.

Праймеры и зонды на основе фланкирующих последовательностей ДНК и вставочных последовательностей по настоящему изобретению могут быть использованы для подтверждения (и при необходимости для коррекции) рассмотренных последовательностей стандартными методами, например, методами повторного клонирования и секвенирования таких последовательностей.

Зонды и праймеры нуклеиновых кислот по настоящему изобретению гибридизируют в строгих условиях с последовательностью ДНК-мишени. Для идентификации ДНК из трансгенного трансформанта в образце могут быть использованы любые стандартные методы гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты могут специфически гибридизировать с другими молекулами