Антитела против notch1

Антитела против notch1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам против Notch1. Настоящее изобретение кроме того относится к способам применения таких антител в лечении рака.

ПРЕДШЕСТВУЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рецепторы Notch контролируют в многоклеточных организмах нормальные рост, дифференцировку и гибель клеток через путь сигнализации, который запускается протеолизом, индуцированным лигандом (Bray, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7(9):678-689, 2006). Зрелый гетеродимер Notch, после расщепления в сайте S1 фурин-подобной протеазой, поддерживается в автоингибированном состоянии околомембранной негативной регуляторной областью (NRR), состоящей из трех повторов Lin12/Notch (LNR-A, B, C) и домена гетеродимеризации (HD). Домен HD разделяется на N-концевую (HD1) и C-концевую (HD2) части посредством расщепления в сайте S1. Через неясный механизм связывание лигандов семейства Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) с N-концевой областью с повтором EGF снимает это ингибирование и индуцирует два последовательных дополнительных расщепления в S2 около C-концевой области HD-2 и S3 в пределах трансмембранного домена в Notch, которые катализируются металлопротеиназой типа ADAM и гамма-секретазой соответственно (Gordon, W.R., et al, Nature Structural & Molecular Biology, 2007, volume 14, 295-300). Последнее расщепление высвобождает внутриклеточный домен Notch (Notch^ICD), позволяя ему транслоцироваться в ядро и активировать транскрипцию генов-мишеней.

В клетках млекопитающих есть четыре известных рецептора Notch. Notch1-4 имеет широкие перекрывающиеся паттерны экспрессии в эмбриональных и взрослых тканях и выполняет неизбыточные роли во время спецификации гематопоэтических стволовых клеток, развития Т-клеток, спецификации клеток кишечных крипт и развития сосудов. Приобретенные нарушения с участием специфичных рецепторов Notch1 связывали с раковыми заболеваниями, такими как T-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), рак молочной железы и рак легкого. Кроме того, активированный Notch1 является мощным индуктором лейкоза в мышиных моделях и сверхэкспрессируется в различных солидных опухолях, включая немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы и рак яичника.

Более 50% пациентов с T-ALL имеют мутации в рецепторе Notch1, некоторые из них приводят к конститутивному расщеплению рецептора и продукции Notch^ICD частично из-за гиперчувствительности Notch1 к лиганду или лиганд-независимой активации, вызванной изменениями в или около автоингибирующего домена NRR. Данные мутации классифицируют на 3 главных класса. Мутации класса 1 представляют собой замены одиночных аминокислот и маленькие делеции в рамке считывания или вставки в HD1. Мутации класса 2 представляют собой более длинные вставки в дистальной области HD2, которые перемещают сайт расщепления металлопротеиназой S2 за пределы автоингибирующего домена NRR. Мутации класса 3, также именуемые мутациями околомембранного удлинения (JME), происходят в результате больших вставок, которые вытесняют NRR из клеточной мембраны.

Для терапевтических целей при раковом заболевании разрабатываются несколько стратегий для ингибирования Notch сигнализации. Одним подходом является блокирование протеолитического высвобождения внутриклеточного Notch из мембраны путем обработки ингибиторами гамма-секретазы (GSI). Несмотря на то, что GSI дошли до клинического применения, они не могут различать индивидуальные рецепторы Notch и вызывают кишечную токсичность, приписываемую к ингибированию как Notch1, так и Notch2. В данной области до сих пор имеется потребность в новой терапии против Notch1 для лечения ракового заболевания при обеспечении ослабленных побочных эффектов, в частности, кишечной токсичности.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую область CDR1 (гипервариабельная область 1), область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 71.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие вариабельную область легкой цепи, имеющую область CDR1, область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 97.

Согласно настоящему изобретению также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие:

1) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую область CDR1, область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 71 и

2) вариабельную область легкой цепи, имеющую область CDR1, область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 97.

Также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 71. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 71.

Также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 97. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 97.

Также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 111. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 111.

Также предложены антитела, имеющие аминокислотную последовательность легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 113. Кроме того, предложены антитела, имеющие аминокислотную последовательность легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 113.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 71; и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 97. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 71; и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 97.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 111; и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 113. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 111; и аминокислотную последовательность легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 113.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с человеческим Notch1, где данные антитела связываются с эпитопом, имеющим по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, выбранных из Asn 1461, Lys 1462, Val 1463, Cys 1464, Leu 1466, Leu 1580, Tyr 1621, Gly 1622, Met 1670, Asp 1671, Val 1672, Arg 1673, Leu 1707, Ala 1708, Leu 1710, Gly 1711, Ser 1712, Leu 1713, Pro 1716 и Lys 1718.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую область CDR1, область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 115.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие вариабельную область легкой цепи, имеющую область CDR1, область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 129.

Согласно настоящему изобретению также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие:

1) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую область CDR1, область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 115 и

2) вариабельную область легкой цепи, имеющую область CDR1, область CDR2 и область CDR3 из вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 129.

Также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 115. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 115.

Также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 129. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 129.

Также предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 149. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 149.

Также предложены антитела, имеющие аминокислотную последовательность легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 151. Кроме того, предложены антитела, имеющие аминокислотную последовательность легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 151.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 115; и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 129. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную, последовательность вариабельной области тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 115; и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 129.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 149; и аминокислотную последовательность легкой цепи, которая является по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 151. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, имеющие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 149; и аминокислотную последовательность легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO: 151.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с человеческим Notch1, где данные антитела связываются с эпитопом, имеющим по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, выбранных из Asp 1458, Asn 1461, Val 1463, Cys 1464, Leu 1466, Leu 1580, Met 1581, Pro 1582, Tyr 1621, Gly 1622, Arg 1623, Asp 1671, Val 1672, Arg 1673, Gly 1674, Leu 1710, Gly 1711, Ser 1712, Leu 1713, Asn 1714, Ile 1715, Pro 1716 и Lys 1718.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые демонстрируют большее ингибирование активации Notch1 мутантного рецептора Notch1 по сравнению с ингибированием активации Notch1 нативного рецептора Notch1. Кроме того, предложено то, что мутантный рецептор Notch1 имеет мутацию в негативной регуляторной области (NRR). В другом воплощении мутация в NRR выбрана из группы, состоящей из мутации класса 1, класса 2 и класса 3. В другом воплощении мутация в NRR ассоциирована с клетками, имеющими ненормальную активацию Notch1. Кроме того, предложено то, что клетки представляют собой клетки T-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL). Также предложено то, что клетки T-ALL выбраны из группы, состоящей из клеток HPB-ALL, ALL-SIL, CCRF-CEM, MOLT-4 и DND-41.

Также предложены антитела, которые связываются с Notch1 и конкурируют за связывание с Notch1 с любым из описанных здесь антител.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с Notch1, где данные антитела имеют изотип IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Кроме того, предложены антитела, которые связываются с Notch1, где изотипом является IgG, и где подклассом является IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или происходящий из него. Также предложены антитела, которые связываются с Notch1, где подкласс происходит от IgG1.

В другом воплощении согласно изобретению предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют любое из описанных здесь антител, или которые кодируют любую из тяжелых цепей и/или легких цепей описанных здесь антител. Например, в одном воплощении согласно изобретению предложены нуклеиновые кислоты, имеющие последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 112. В другом воплощении согласно изобретению предложены нуклеиновые кислоты, имеющие последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 114. В другом воплощении согласно изобретению предложены нуклеиновые кислоты, имеющие последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 150. В другом воплощении согласно изобретению предложены нуклеиновые кислоты, имеющие последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 152.

В другом воплощении согласно изобретению предложен вектор, содержащий любую из описанных здесь нуклеиновых кислот. В другом воплощении согласно изобретению предложены клетки-хозяева, содержащие любой из описанных здесь векторов. В другом воплощении согласно изобретению предложен способ получения любого из описанных здесь антител, включающий культивирование любых описанных здесь клеток-хозяев и выделение антител из культуральных сред. В другом воплощении согласно изобретению предложены клетки-хозяева, которые рекомбинантно продуцируют любое из описанных здесь антител. В одном воплощении выделяют любую из описанных здесь клеток-хозяев.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие любое из описанных здесь антител и фармацевтически приемлемые носители. В другом воплощении согласно изобретению предложены способы лечения расстройств у субъектов, нуждающихся в этом, включающие введение данным субъектам любого из описанных здесь антител или фармацевтических композиций. Согласно изобретению кроме того предложены способы лечения расстройств, которые ассоциированы с ненормальной активацией Notch1 у субъектов, нуждающихся в этом, включающие введение данным субъектам любого из описанных здесь антител или фармацевтических композиций. В другом воплощении согласно изобретению предложены способы лечения расстройств, таких как T-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак молочной железы и рак толстой кишки, у субъектов, нуждающихся в этом, включающий введение данным субъектам любого из описанных здесь антител или фармацевтических композиций. Согласно изобретению кроме того предложен способ лечения расстройств у субъектов, нуждающихся в этом, включающий введение субъектам любого из описанных здесь антител или фармацевтических композиций в комбинации с одним или более чем одним терапевтическим агентом.

В другом воплощении согласно изобретению предложено любое из раскрытых здесь антител для применения в терапии. В другом воплощении согласно изобретению предложено применение любого из раскрытых здесь антител для изготовления лекарственных средств для терапии. В другом воплощении согласно изобретению предложено любое из раскрытых здесь антител для применения в лечении расстройств, которые ассоциированы с ненормальной активацией Notch1, у субъектов, нуждающихся в этом. В другом воплощении согласно изобретению предложено любое из раскрытых здесь антител для применения в лечении таких расстройств, как T-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак молочной железы и рак толстой кишки, у субъектов, нуждающихся в этом.

В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с человеческим, мышиным Notch1 и Notch1 яванского макака (далее «макак»), но не связываются с человеческим Notch2. В другом воплощении согласно изобретению предложены антитела, которые связываются с человеческим, мышиным Notch1 или Notch1 макака, но не связываются с человеческим или мышиным Notch3.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 показана схематическая диаграмма рекомбинантного, расщепленного по S1, гетеродимерного белкового иммуногена NRR Notch1 с метками Avi и His.

На Фиг.2 показаны рекомбинантные человеческие химерные конструкции, на основе доменов NRR Notch1 и NRR Notch3 для картирования эпитопов антител против Notch1: крысиного 351-mIgG1, крысиного 438-mIgG1 и A2.

На Фиг.3 показана структура эпитопа крысиного антитела 438 на человеческом NRR Notch1.

На Фиг.4 показана структура эпитопа крысиного антитела 351 на человеческом NRR Notch1

На Фиг.5 показана структура эпитопа A2 на человеческом NRR Notch1.

На Фиг.6 показано наложение структур NRR Notch1, связанного с антителами: крысиным 438 и A2.

На Фиг.7 показано наложение структур NRR Notch1 (показана в виде лент), связанного с антителами: крысиным 351 и A2 (показаны в виде молекулярных поверхностей).

На Фиг.8 показана нейтрализующая активность антител: гуманизированного 438 VH1.1/VL1.8, крысиного 438-mIgG1 и A2 против сигнализации, зависимой от Notch1, в человеческих Notch1-репортерных клетках.

На Фиг.9 показана нейтрализующая активность антител: гуманизированного 438 VH1.1/VL1.8, крысиного 438-mIgG1 и A2 против сигнализации, зависимой от Notch1, в мышиных Notch1-репортерных клетках.

На Фиг.10 показана нейтрализующая активность антител: крысиного 351 и A2 против человеческой Notch1 сигнализации м.

На Фиг.11 показана нейтрализующая активность антител: крысиного 351 и А2 против мышиной Notch1 сигнализации.

На Фиг.12 показана нейтрализующая активность антител: гуманизированных вариантов 351, крысиного 351-mIgG1 и А2 против сигнализации, зависимой от Notch1, в человеческих Notch1-репортерных клетках.

На Фиг.13 показана нейтрализующая активность антител: гуманизированных вариантов 351, крысиного 351-mIgG1 и А2 против сигнализации, зависимой от Notch1, в мышиных Notch1-репортерных клетках.

На Фиг.14А и 14Б показаны структуры поверхности взаимодействия между крысиным 351 и NRR Notch1 в области LNR-A.

На Фиг.15 показана, нейтрализующая активность крысиного 351, мутантного крысиного 351 и A2 в анализах сокультуры с репортерными генами.

На Фиг.16 показаны репрезентативные эпифлуоресцентные изображения иммуноокрашивания CD3-Cy3 отростков HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) на 10-е сутки обработки крысиным 438, крысиным 351, A2, одной контрольной средой и антителом против VEGF (фактор роста эндотелия сосудов).

На Фиг.17 показаны репрезентативные конфокальные изображения окрашивания изолектином B4-Алекса488 в мышиной ретинальной модели ангиогенеза после обработки антителами: крысиным 438-mIgG1, крысиным 351-mIgG1 и A2, контрольным антителом против E.tenella и при отсутствии обработки.

На Фиг.18 показан анализ вестерн-блоттингом белковых экстрактов, полученных из человеческих фибробластов CCD1076SK, высаженных на чашках на рекомбинантном человеческом лиганде DLL4 и обработанных возрастающими концентрациями крысиного 351, крысиного 438, A2 и контрольного антитела против E.tenella.

На Фиг.19 показан анализ вестерн-блоттингом белковых экстрактов, полученных из клеток HBP-ALL, обработанных возрастающими концентрациями гуманизированного 438 VH1.1/VL1.8, крысиного 438-mIgG1 и контрольного антитела против E.tenella.

На Фиг.20 показан анализ вестерн-блоттингом белковых экстрактов, полученных из линий клеток T-ALL, обработанных возрастающими концентрациями крысиного 351-mIgG1, крысиного 438-mIgG1, А2 и контрольного антитела против E.tenella.

На Фиг.21 показана иммуногистохимическая детекция рецепторов Notch1 и лиганда Jagged1 в ксенотрансплантате 37622A1, происходящем от пациента с NSCLC.

На Фиг.22 продемонстрирована хроматограмма, показывающая то, что ксенотрансплантат 37622A1, происходящий от пациента с NSCLC, обладал мутацией G13V в человеческом гене K-ras.

На Фиг.23 показан анализ вестерн-блоттингом белковых, экстрактов, полученных из ксенотрансплантатов 37622A1, происходящих от пациента с NSCLC, обработанных крысиным 438-mIgG1, A2 и контрольным антителом против E.tenella.

На Фиг.24 показан анализ вестерн-блоттингом белковых экстрактов, полученных из ксенотрансплантатов 87393A1, происходящих от пациента с NSCLC, обработанных антителами: крысиным 351-mIgG1 и контрольным против E.tenella.

На Фиг.25 показана иммуногистохимическая детекция экспрессии инволюкрина в ксенотрансплантатах 87393A1, происходящих от пациента с NSCLC, после обработки антителами: крысиным 351-mIgG1 и контрольным против E.tenella.

На Фиг.26 показан анализ вестерн-блоттингом экспрессии инволюкрина в ксенотрансплантатах 87393A1, происходящих от пациента с NSCLC, после обработки антителами: крысиным 351-mIgG1 и контрольным против E.tenella.

На Фиг.27 показана гистохимическая идентификация секреторных бокаловидных клеток с использованием окрашивания альциановым синим на срезе подвздошной кишки кишечника мыши из исследования эффективности Calu-6, при обработке антителами: крысиным 438-mIgG1, A2 и контрольным против E.tenella.

На Фиг.28 показана иммуногистохимия антителом против Ki67 на криптах кишечника мыши из исследования эффективности Calu-6, при обработке антителами: крысиным 438-mIgG1, A2 и контрольным против E.tenella.

На Фиг.29 показана иммуногистохимия антителом против Ki67 на криптах кишечника мыши из исследования эффективности на полученном от пациента ксенотрансплантате 87393А1, при обработке антителами: крысиным 351-mIgG1 и контрольным против E.tenella.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным антителам, в частности к человеческим, гуманизированным, химерным и крысиным моноклональным антителам, которые связываются с Notch1. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены выделенные антитела, которые демонстрируют более сильное ингибирование активации Notch1 мутантного рецептора Notch1 по сравнению с ингибированием активации Notch1 нативного рецептора Notch1. Согласно изобретению предложены выделенные антитела и способы получения таких антител и фармацевтических композиций, содержащих данные антитела. Настоящее изобретение кроме того относится к иммуноконъюгатам и биспецифичным молекулам, содержащим.такие антитела. Данное изобретение также относится к способам применения антител для ингибирования активации Notch1 и лечения различных заболеваний, относящихся к ненормальному росту клеток, таких как рак (например T-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак толстой кишки, рак молочной железы и рак яичника.

Общие методики

Если не указано иначе, способы и методики по настоящему изобретению обычно проводятся согласно традиционным способам, хорошо известным в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые процитированы и обсуждаются во всем настоящем описании изобретения, если не указано иначе. Смотрите, например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) и Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), которые включены сюда посредством ссылки.

Определения

Термины «Notch1» или «Notch-1» относятся к нативным, вариантам, изоформам и видам гомологов человеческого белка Notchl. Нативный человеческий белок Notchl, например, составлен из лидерного пептида, большой повторяющейся области, подобной эпидермальному фактору роста (EGF), трех повторов Lin12, N-концевого домена гетеродимеризации (HD-1), C-концевого домена гетеродимеризации (HD-2), трансмембранной (TM) последовательности и внутриклеточного домена (Notch1^ICD). Номером доступа NCBI (Национальный центр биотехнологической информации)/GenBank полноразмерного человеческого Notch1 является NM_017617.2.

Фразы «негативная регуляторная область Notch1» или «NRR Notch1» в том виде, как они здесь используются, если не указано иное, относятся к любой нативной или синтетической полипептидной области Notch1, состоящей из трех доменов Lin12 и аминокислотной последовательности или последовательностей, расположенных между тремя доменами Lin12, плюс к доменам Notch1: HD1 и HD2. В одном воплощении «NRR Notch1» включает три домена Lin12 и два домена тетеродимеризацииь HD-1 и HD-2, где домены Notch1: HD-1 и HD-2 являются ковалентно связанными и еще не расщепленными фурин-подобной протеазой (до расщепления по S1). В другом воплощении «NRR Notch1» включает три домена Lin12 и два домена гетеродимеризации HD-1 и HD-2, где домены HD-1 и HD-2 нековалентно связаны (после расщепления по S1). В одном аспекте данного воплощения сайт S2 в пределах домена HD-2 не был расщеплен металлопротеазами типа ADAM. В другом конкретном аспекте данного воплощения сайт S2 в пределах домена HD-2 расщепляется или уже был расщеплен металлопротеазами типа ADAM. (Gordon, W.R., et. al, Nature Structural & Molecular Biology, 2007, volume 14, 295-300).

«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфично связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством по меньшей мере одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Данный термин, в том виде, как он здесь используется, охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (например антигенсвязывающие части) (такие как Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv), одноцепочечные (ScFv) и доменные антитела, такие как антитела акул и верблюдов), слитые белки, содержащие часть в виде антитела (такую как доменные антитела), и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или его подкласс), и антитело не должно принадлежать к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константных доменов тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины можно приписывать к разным классам. Существуют пять главных классов (изотипов) иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно подразделить на подклассы, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры, субъедниц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Подразумевается, что термин «выделенное антитело» в том виде, как он здесь используется, относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например выделенное антитело, которое специфично связывается с Notch1, по существу не содержит антител, которые специфично связываются с антигенами, отличными от Notch1). Выделенное антитело, которое специфично связывается с Notch1, может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы Notch-1 из других видов. Кроме того, выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических реактивов.

Термин «моноклональное антитело» в том виде, как он здесь используется, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в малых количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного антигенного сайта.

«Гуманизированное» антитело относится к формам антител, не являющихся человеческими (например мышиных), которые предствляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab’, F(ab’)₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Предпочтительно гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в котором остатки из области, определяющей комплементарность (CDR), реципиента заменены остатками из CDR вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, имеющей желательную специфичность, аффинность и эффективность. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FW) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортированных последовательностях CDR или каркаса, но включаются для дальнейшего уточнения и оптимизации эффективности антитела. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области CDR соответстуют областям CDR иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все области FW представляют собой области FW консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), типично часть константной области или домена человеческого иммуноглобулина. Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более чем одну CDR (L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 или H-CDR3), которая изменена по отношению к исходному антителу, которая также именуется одна или более чем одна CDR, «происходящая из» одной или более чем одной CDR из исходного антитела.

Подразумевается, что «человеческое антитело» или «полностью человеческое антитело» включают антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR области происходят из последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Кроме того, если антитело содержит константную область, данная константная область также происходит из последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Человеческие антитела по данному изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например мутации, введенные случайным или сайт-направленным мутагенезом in vitro, или посредством соматической мутации in vivo). Данное определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид человеческой тяжелой цепи или по меньшей мере один полипептид человеческой легкой цепи. Человеческие антитела могут быть получены с использованием разных методик, известных в данной области.

Подразумевается, что термин «химерное антитело» относится к антителам, в которых последовательности вариабельной области происходят от одного вида, и последовательности константной области происходят от другого вида, как, например, антитело, в котором последовательности вариабельной области происходят из мышиного антитела, и последовательности константной области происходят из человеческого антитела.

Термин «рекомбинантное антитело» в том виде, как он здесь используется, включает все антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют способами генной инженерии. Такие рекомбинантные антитела имеют вариабельные области, в которых каркасные и CDR области происходят из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии. Однако в определенных воплощениях такие рекомбинантные антитела можно подвергать мутагенезу in vitro (или, при использовании животного, трансгенного в отношении последовательностей Ig - соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, происходя от и имея родство с последовательностями VH и VL зародышевой линии, могут не существовать в природе в пределах репертуара антител зародышевой линии in vivo.

Фразы «антитело, распознающее антиген» и «антитело, специфичное в отношении антигена», используются здесь взаимозаменяемо с термином «антитело, которое специфично связывается с антигеном».

Как известно в данной области, термин «область Fc» используется для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина (CH2+CH3). «Область Fc» может представлять собой нативную последовательность области Fc или вариант области Fc.

«Нативная последовательность области Fc» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности области Fc, обнаруженной в природе. «Вариант области Fc» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности нативной последовательности области Fc за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации, тем не менее сохраняет по меньшей мере одну функцию нативной последовательности области Fc.

Термины «рецептор Fc» или «FcR» используются для описания рецептора, который связывается с областью Fc антитела. Например, FcR может представлять собой нативную последовательность человеческого FcR. Кроме того, FcR может представлять собой FcR, который связывается с антителом IgG (гамма рецептор), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII, FcγRIII и FcγRIV, включая аллельные варианты данных рецепторов и формы, подвергнувшиеся альтернативному сплайсингу. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в его цитоплазматическом домене иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина (ITAM). Как будет понятно специалистам в данной области, ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в его цитоплазматическом домене иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM). FcR часто рассматривались в обзорах, и они являются хорошо известными специалистам в данной области. Другие FcR, включая FcR, которые предстоит идентифицировать в будущем, охватываются здесь термином «FcR». Данный термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод и продленный период полувыведения IgG.

Термин «связывается» относится к аффинности между двумя молекулами, например, антигеном и антителом. Фраза антитело, которое «специфично связывается с Notch1», относится к предпочтительному связыванию антитела с антигеном Notch1 в образце, содержащем многочисленные разные антигены, с по меньшей мере 100-кратным или предпочтительно 1000-кратным различием в K_D.

Термин «высокая аффинность» относится к антителу, имеющему K_D 1×10^-6 M или менее, более предпочтительно имеющему K_D 1×10^-8 M или менее. Аффинность можно измерять, например, с использованием поверхностного плазмонного резонанса.

«Эпитоп» включает любую белковую детерминанту, способную к специфичному связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клетки. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфичные трехмерные структурные характеристики, а также специфичные характерстики заряда.

Подразумевается, что термин «k_on» в том виде, как он здесь используется, относится к скорости образования или скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как подразумевается, что термин «k_off» в том виде, как он здесь используется, относится к скорости разрушения или скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Подразумевается, что термин «K_D» в том виде, как он здесь используется, относится к равновесной константе диссоциации, которая получается из отношения k_off к k_on (т.е. k_off/k_on) и выражается в виде молярной концентрации (M). Значения K_D для антител можно определять с использованием способов, прочно установившихся в данной области. Одним способом для определения K_D антитела является применение поверхностного плазмонного резонанса, типично с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore®.

Термины «полипептид», «олигопептид», «пептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для отнесения к цепям аминокислот любой длины, предпочтительно к относительно коротким (например 10-100 аминокислот). Цепь может быть линейной или разветвленной