Композиции и способы профилактики и лечения злокачественных новообразований

Композиции и способы профилактики и лечения злокачественных новообразований

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

[0001] Данная заявка заявляет приоритет согласно 35 USС §119(е) по отношению к предварительной патентной заявке США с порядковым номером 61/413330, поданной 12 ноября 2010 года, которая включена в данный документ ссылкой в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

[0002] Данное изобретение относится к композициям и способам, связанным с иммунотерапией и медициной. Конкретно, данное изобретение относится к терапевтическим средствам для предотвращения и лечения злокачественных новообразований.

Уровень техники

[0003] Онкоиммунология представляет собой перспективную область в сфере терапевтических средств против злокачественных новообразований, целью которой является использование собственной защиты организма для направленного воздействия и для уничтожения злокачественных клеток. Идея использования собственной иммунной системы организма для атаки на злокачественные клетки имеет много преимуществ по отношению к традиционным терапиям, которые являются сайтспецифическими, такими как облучение и хирургическое вмешательство, или по отношению к химиотерапевтическим методам, с которыми связаны неблагоприятные побочные эффекты и с высокая токсичность.

[0004] Данная область существенно продвинулась благодаря идентификации и описанию множества различных опухолеспецифичных антигенов. Подобные опухолеспецифичные антигены специфичны для злокачественных клеток. Если бы можно было запускать иммунный ответ, который был бы нацелен на такие опухолеспецифичные антигены, то организм был бы сам способен эффективно уничтожать злокачественные клетки. Однако стратегии индуцирования опухолеспецифичного иммунитета у пациентов до сих пор не увенчались успехом. Исследования наводят на мысль о том, что существуют различные факторы, которые вносят вклад в провал существующих в настое время противоопухолевых иммунотерапевтических стратегий. Во-первых, эти стратегии не приспособлены к достаточной наработке циркулирующих цитотоксических Т-лимфоцитов. Во-вторых, у онкологических пациентов часто подавлен иммунитет и они не способны вырабатывать костимулирующие молекулы, необходимые для инициации иммунного ответа. Таким образом, главная цель иммунотерапии злокачественных новообразований заключается в получении большого количества высокоавидных опухолеспецифичных Т-клеток, которые могут эффективно атаковать злокачественные клетки in vivo.

[0005] В настоящем изобретении используется наночастица с покрытием в виде комплексов опухолеспецифичный антиген/МНС и костимулирующих молекул. Данный уникальный комплекс может индуцировать наработку циркулирующих CD8+ Т-клеток в количестве, которое превосходит количество, получаемое с использованием известных в настоящее время иммунотерапий злокачественных новообразований.

Сущность изобретения

[0006] Обычная иммунотерапия злокачественных новообразований не способна эффективно нарабатывать Т-клетки, которые специфично направленно воздействуют на злокачественные клетки, в количествах, достаточных для существенного уменьшения размера опухоли. Предполагается, что наночастицы, покрытые молекулами МНС класса I и/или класса II, презентирующие опухолеспецифичные антигены и костимулирующие молекулы, способны активировать наивные (naïve) Т-клетки, что приводит к массивной наработке антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток, способных дифференцироваться в цитотоксические Т-клетки, эффекторные Т-клетки, Т-клетки памяти и хелперные Т-клетки, которые необходимы для инициации и поддержания устойчивого иммунного ответа против злокачественных, предзлокачественных или неопластических клеток in vivo. В настоящем изобретении описан системный подход направленного воздействия на злокачественные и предзлокачественные клетки, которые являются циркулирующими клетками, как в случае лимфом, так и мигрирующими метастатическими клетками, как в случае твердых опухолей. Такой подход резко контрастирует с сайтспецифичными терапиями, такими как облучение, хирургическое вмешательство и биопсия.

[0007] Аспекты и воплощения данной технологии включают новый способ профилактики или лечения опухолей и злокачественных новообразований, включающий введение объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей, в количестве, достаточном для наработки противоопухолевых Т-клеток. Традиционно, иммунотерапии, направленно воздействующие на опухоли и злокачественные новообразования, не имели успеха в наработке Т-клеток в количествах, достаточных для эффективного лечения пациентов, имеющих злокачественные клетки и/или опухоли. Аспекты настоящего изобретения относятся к новым комплексам, которые неожиданно оказались способны приводить к наработке популяции противоопухолевых Т-клеток на уровне, который традиционно был не достижим с использованием других иммунотерапий.

[0008] Конкретные воплощения настоящего изобретения относятся к способу ингибирования роста опухолей и профилактики или лечения злокачественных новообразований, который включает введение объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей, в количестве, достаточном для наработки противоопухолевых Т-клеток, где способ дополнительно включает введение комплексов антиген/МНС/наночастица в количестве, достаточном для активации и/или наработки уже существующих противоопухолевых клеток памяти. Предполагается, что введение пациенту комплексов антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица будет способствовать дифференцировке наивных Т-клеток в различные типы популяций антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток. Как таковая, одна из этих популяций будет представлять собой антигенспецифичные противоопухолевые Т-клетки памяти. Дополнительно предполагается, что последующее введение комплексов антиген/МНС/наночастица без костимулирующих молекул может активировать указанные антигенспецифичные противоопухолевые клетки памяти.

[0009] В следующем аспекте в данном описании предлагается способ активации антигенспецифичных противоопухолевых клеток памяти у пациента, нуждающегося в этом, путем введения эффективного количества комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей.

[0010] Еще в одном воплощении изобретение включает способы диагностики злокачественного новообразования, включающие оценку индуцированного лечением увеличения ответов противоопухолевых CD8⁺ или CD4⁺ Т-клеток в качестве показателя активного иммунитета.

[0011] Другой аспект относится к способу ингибирования метастазирования злокачественного новообразования у пациента, включающий введение объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей, в количестве, достаточном для наработки популяции антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток, где указанной наработанной популяции достаточно для лечения указанного злокачественного новообразования, где указанный антиген специфичен к указанной опухоли, где указанное введение обеспечивает системную циркуляцию комплекса у указанного пациента.

[0012] Следующие воплощения изобретения включают способы наработки антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток, включающие введение объекту или в клетки in vitro комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица в количестве, достаточном для стимуляции наработки антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток. В определенных аспектах Т-клетка представляет собой CD8⁺ или CD4⁺ Т-клетку или NKT-клетку. В других аспектах изобретения Т-клетка представляет собой CD8⁺ или CD4⁺ Т-клетку памяти. В следующих аспектах изобретения Т-клетка представляет собой CD8⁺ цитотоксическую Т-клетку или CD4⁺ хелперную Т-клетку.

[0013] Определенные воплощения настоящего изобретения относятся к способам селективной наработки и/или наращивания популяций антигенспецифчных противоопухолевых Т-клеток у объекта, причем способ включает введение указанному объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица, где указанный комплекс вводят в количестве и с частотой, которые достаточны для наработки указанных популяций. Таким образом, настоящее изобретение может инициировать и поддерживать иммунный ответ, который уменьшает или исключает развитие злокачественных и предзлокачественных клеток in vivo. С помощью настоящего изобретения, как такового, можно нарабатывать описываемые Т-клетки, такие как Т-клетки, которые распознают опухолевые антигены, для профилактики, лечения и/или ослабления заболеваний, ассоциированных с развитием опухолей.

[0014] Настоящее изобретение относится к направлению клеток в организме по антигенспецифическому пути. Опухолеспецифичные антигены хорошо известны в данной области и описаны в различных публикациях, например, в Dranoff, G. ("Targets of Protective Tumor Immunity.» (2009) Cancer Vaccines: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174: 74-80), и в Патентах США 7795224, 7812116, 7785801, которые включены в данный документ ссылкой. Технология не ограничивается конкретными антигенами, а технологии идентификации опухолеспецифичных антигенов хорошо известны в данной области и ранее были описаны, например, в Schlichtholz et al. ("The immune response to p53 in breast cancer patients is directed against immunodominant epitopes unrelated to the mutational hot spot.» Cancer Res 1992; 52: 6380-4), De Plaen E et al. ("Immunogenic (tum-) variants of mouse tumor P815: cloning of the gene of tum-antigen P91A and identification of the tum-mutation.» Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 2274-8), and Sahin U. et al. ("Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host.» Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 11810-3, которые включены в данный документ ссылкой. Таким образом, без связи с теорией, данная технология инициирует иммунный ответ против любых клеток в организме, которые характеризуются, как имеющие специфический антиген. Настоящее изобретение, как таковое, не ограничивается последовательностью специфического антигена, но может относиться к любой последовательности антигена, которая, как обнаружено, является уникальной по отношению к пораженной клетке в организме.

[0015] Воплощения изобретения относятся к способам диагностики, профилактики или лечения развития опухоли, включающим введение комплекса антиген/МНС/костимулирующпя молекула/наночастица объекту в количестве, достаточном для наработки антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток. В общем, и при использовании в данном документе, термин «антиген» включает в частности все или часть таких компонентов, как пептид, нуклеиновая кислота, углевод, липид или другое соединение, которые могут модулировать активность Т-клеток или Т-клеточных популяций, когда они в контексте МНС или МНС-подобной молекулы связаны с субстратом. В некоторых аспектах данного изобретения наночастица является биоабсорбируемой, что предотвращает продолжительное накапливание наночастиц in vivo без какой-либо сопутствующей токсичности.

[0016] Воплощения изобретения для применения в описанных способах охватывают частицы, включающие наночастицу, связанную с комплексом антиген/МНС/костимулирующая молекула. Комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула может быть связан непосредственно с наночастицей посредством линкера. Наночастица может включать различные слои, которые в свою очередь могут включать множество компонентов (например, металлическое ядро с покрытием или оболочкой из других молекул, которые могут более легко соединяться с комплексом антиген/МНС/костимулирующая молекула, таких как стрептавидин или авидин или другие известные молекулы, используемые для присоединения компонентов к наночастицам). В определенных аспектах наночастица содержит один или несколько материалов, выбранных из группы, состоящей, например, из селенида кадмия, титана, диоксида титана, олова, оксида олова, кремния, диоксида кремния, железа, оксида железа III, серебра, никеля, золота, меди, алюминия, стали, сплава кобальт-хром, сплава титана, брушита, трикальцийфосфата, оксида алюминия, кремнезема, циркония, алмаза, полистирола, силикона, резины, поликарбоната, полиуретанов, полипропиленов, полиметилметаакрилата, поливинилхлорида, сложных полиэфиров, простых полиэфиров, и полиэтилена, трикальцийфосфата, хрома, галлия, а также биосовместимых, биоабсорбируемых полимеров, таких как PGLA, PLLA, PGA, PDLLA, PCL, PDLGA, PLDLA, PLC (каждый из которых имеется в продаже у «Zeus», 3737 Industrial Blvd, Ориджберг, Южная Каролина, 29118 США од торговой маркой «Absorv™»), гиалуроновой кислоты, альгината, полигидроксиалканоатов и так далее. В следующих аспектах биосовместимая, биоабсорбируемая наночастица содержит один или несколько компонентов из числа металлической наночастицы или способной намагничиваться наночастицы, или наночастицы из суперпарамагнетика. Биосовместимая, биоабсорбируемая наночастица может дополнительно включать одно или несколько биодеградируемых покрытий, образованных из декстрана; поли(этиленгликоля); поли(этиленоксида); маннита; поли(гидроксиалканоатов) класса PHB-PHV; и других модифицированных поли(сахаридов), таких как крахмал, целлюлоза и хитозан.

[0017] Определенные аспекты изобретения включают способы и композиции, включающие антигенные композиции, которые, в свою очередь, включают один или несколько сегментов, фрагментов или эпитопов полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и других молекул, которые вызывают или индуцируют антигенный или иммунный ответ, который, как правило, относится к антигенам.

[0018] В определенных аспектах комплекс антигена/МНС и костимулирующей молекулы может быть перекрестно связан (конъюгирован) с наночастицами, описанными в данном документе, с использованием способов, известных в данной области. Один частный пример такого способа конъюгации наночастицы с комплексом антигена/МНС и к-стимулирующей молекулы включает (а) реакцию комплекса антигена/МНС и костимулирующей молекулы с конъюгирующим агентом, с образованием таким образом комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула; и (b) реакцию наночастицы с комплексом стадии (а). Другой частный пример такого метода конъюгации наночастицы с комплексом антигена/МНС и костимулирующей молекулы включает (а) реакцию комплекса антигена/МНС и костимулирующей молекулы с конъюгирующим агентом по отдельности, с образованием, таким образом, комплекса антиген/МНС и комплекса костимулирующей молекулы; и (b) реакцию наночастицы с комплексом стадии (а), так что комплексы антигена/МНС и костимулирующей молекулы по отдельности связываются с наночастицей. В одном воплощении, способ включает концентрированно комплекса стадии (а) перед осуществлением стадии (b). В другом воплощении, конъюгирующий агент включает гетеробифункциональный агент. Еще в одном воплощении, конъюгирующий агент включает DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-б-метил-б-(2-пиридилдитио)толуол-), сульфо-LC-SMPT (сульфосукцинимидил-6-(б-метил-б-(2-пиридилтио)толуамидо)гексаноат, реагент Трота (2-иминотиолан-HCl), или любую их комбинацию. См. Патентные публикации США No. 20070059775; Пат. США No. 4671958, 4659839, 4414148, 4699784; 4680338; 4569789; 4589071; 7186814 и 5543391 Европейскую Патентную Заявку No. 188256 на предмет обсуждения конъюгации комплексов с микрочастицами или с наночастицами, описание публикаций включено в данный документ ссылкой.

[0019] В определенных воплощениях комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула получают путем осуществления сначала перекрестного связывания костимулирующей молекулы и наночастицы. В этом случае в описании также предлагается промежуточное соединение, которое включает наночастицу и костимулирующую молекулу, связанную с указанной наночастицей.

[0020] Злокачественные новообразования, предзлокачественные, опухоли и/или неопластические патологические состояния, подвергнутые лечению с помощью способов и композиций по настоящему описанию, не ограничены каким-либо конкретным типом клеток или опухолей или конкретным злокачественным новообразованием, но включает любое такое патологическое состояние (например, злокачественное новообразование), в котором опухолеспецифичный антиген присутствует в клетках, таких как злокачественные клетки. В определенных аспектах пептидный компонент комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица выделяют или конструируют из антигена или антигенного эпитопа, или его имитатора, который экспрессируется или присутствует в опухолевых, злокачественных, предзлокачественных или в неопластических клетках. Множество таких белков были идентифицированы для различных злокачественных новообразований.

[0021] В других аспектах данного изобретения, МНС-компонент комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица представляет собой классический или неклассический полипептидный компонент МНС класса I или МНС класса II. Компонент МНС класса I может включать всю или часть молекул из числа HLA-A, HLA-В, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, конкретно всю или часть молекул HLA-A, таких как молекула HLA-A*0201 МНС класса I. Неклассический компонент МНС класса I может включать CD1-подобные молекулы. Компонент МНС класса II может включать все или часть из числа HLA-DR, HLA-DQ, или HLA-DP. В определенных аспектах, комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула ковалентно или нековалентно связан с субстратом или присоединен к нему (комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица).

[0022] Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы, которые производят вторичный сигнал in vivo, служащий для активации наивных Т-клеток в антигенспецифичные Т-клетки, способные вырабатывать иммунный ответ к клеткам, обладающим указанным специфичным антигеном. Различные костимулирующие молекулы хорошо известны в данной области, и настоящее изобретение не ограничивается одной конкретной костимулирующей молекулой. Некоторые примеры костимулирующих молекул представляют собой В7.1, 4-IBBL, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, и ICOS. В некоторых воплощениях только одна специфичная костимулирующая молекула связана с наночастицей. В другом воплощении множество различных костимулирующих молекул связаны с одной и той же наночастицей. В конкретных воплощениях костимулирующая молекула представляет собой белок, такой как антитело, который может быть агонистом костимулирующего рецептора на Т-клетке. В данном случае антитело способно индуцировать костимулирующий сигнал, который необходим для активации наивных Т-клеток и индукции иммунного ответа антигенспецифичным образом.

[0023] Субстратом, как правило, является наночастица. Одним из критических аспектов настоящего изобретения является наночастица. В одном воплощении диаметр наночастицы составляет от около 1 нм до около 100 нм. Предпочтительно, диаметр наночастицы составляет от около 5 нм до около 15 нм. В другом воплощении диаметр наночастицы составляет от около 5 до около 25 нм, или от около 1 до около 50 нм, или от около 2 до около 25 нм, или от около 1 до около 10 нм, или от около 10 до около 20 нм или от около 1 до около 30 нм. В одном воплощении наночастица включает металл, такой как железо или оксид железа. В другом воплощении, наночастица включает биосовместимый, биоабсорбируемый полимер. В определенных воплощениях, наночастица подвергается биоабсорбции in vivo, так что накопление наночастиц in vivo ограничено. Пептиды по изобретению могут быть химически связаны с субстратом и конкретно связаны посредством пептидного линкера. Молекулы CD1 представляют собой пример неклассической молекулы МНС. Неклассические молекулы МНС характеризуются как неполиморфные, консервативные среди видов и обладающие узкими, глубокими, гидрофобными лигандсвязывающими карманами. Эти связывающие карманы способны презентировать гликолипиды и фосфолипиды естественным киллерным Т-клеткам (NKT). NKT-клетки представляют собой уникальную популяцию лимфоцитов, которые коэкспрессируют маркеры клеток NK и полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR). Они вовлечены в регуляцию иммунного ответа, ассоциированного с широким спектром заболеваний.

[0024] В определенных аспектах комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица не нуждается во введении вместе с адъювантом с целью индукции иммунного ответа, например, антительного ответа. В конкретных воплощениях, композиция антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица может использоваться совместно с другими терапевтическими методами, которые индуцируют антительный ответ, направленный против злокачественных клеток.

Описание чертежей

[0025] Следующие чертежи образуют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть более понятно посредством ссылки на один или несколько из этих чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных воплощений, представленных в данном документе.

[0026] На Фиг.1 представлено характерное изображение, полученное с помощью ТЕМ. рМНС-покрытые GNP (англ. Gold Nanoparticles, золотые наночастицы) (14 нм) сконцентрированы в высокой плотности (~5×10¹³/мл) и монодиспергированы. Увеличение: 50000Х.

[0027] На Фигуре 2 показано влияние, которое оказывают на агонистические свойства рМНС-покрытых GNP доза рМНС (GNP) и валентность рМНС. На Фигуре сравниваются количества IFNγ, секретированного когнатными 8.3-CD8+ Т-клетками в ответ на два различных образца pMHC-GNP (оба состоят из ~2×10¹³ GNP по 14 нм в диаметре/мл). Au-022410 и Au-21910, несущие ~250 и ~120 pMHCs/GNP, соответственно. Au-011810-С, несущие ~120 контрольных pMHC/GNP.

[0028] На Фигуре 3 показано влияние размера на агонистическую активность. Au-022410 представляли собой 14 нм GNP, покрытые рМНС с относительно низкой валентностью, но приготовленные с высокой плотностью; Au-032310 представляли собой 40 нм GNP, покрытые рМНС с высокой валентностью, но с низкой плотностью. Образец Au-022410 обладал большей агонистической активностью, чем образец Au-032310. Au-032310-С представляли собой NP (англ. Nanoparticles, наночастицы), покрытые TUM/K^d (отрицательный контроль рМНС).

[0029] На Фигуре 4 показано влияние защитных PEG на функцию pMHC-GNP. Au-021910, состояли из ~2×10¹³ GNP 14 нм в диаметре/на мл, защищенные с помощью 2 кДа тиол-PEG и покрытые ~120 pMHC/GNP. Au-011810 GNP (также ~2×10¹³ 14 нм GNP/мл) защищали с помощью 5 кДа тиол-PEG и покрывали ~175 pMHC/GNP. Образец Au-021910 очевидно обладал большей агонистической активностью.

[0030] На Фигуре 5 изображена in vivo наработка когнатных саморегулирующихся CD8+ Т-клеток с помощью GNP, напрямую покрытых IGRP_206-214-K^d. Средний % CD8+ Т-клеток в крови или в лимфоидных органах (панкреатические или мезентериальные лимфоузлы -PLN и MLN, соответственно), которые связываются с IGRP_206-214-K^d тетрамерами (n=3 мыши). Контрольные рМНС-GNP представляли собой GNP, приготовленные также, но покрытые не связанным с заболеванием комплексом рМНС (TUM/K^d).

[0031] На Фигуре 6 изображена массивная наработка когнатных CD8+ Т-клеток у мышей, обработанных рМНС-покрытыми NP. Верхняя панель: профиль мыши, умерщвленной после 4 доз. Нижняя панель двух различных мышей после 10 инъекций (только кровь; живы на момент подачи данного документа).

[0032] На Фигуре 7 представлено 30000x и 40000х увеличение рМНС-конъюгированных Fe₃O₄ наночастиц (IGRP/анти-CD28-SFPE-080411) в PBS. Железные наночастицы (SFPE-072611) имели размер ядра 9,4 нм. Концентрация рМНС составила 380 мкг/мл согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Концентрация анти-CD28 составила 124 мкг/мл согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Концентрация Fe составила 700 мкг/мл (3,5×10¹⁴ рМНС-FeNP/мл). Валентность рМНС составляет 13 pMHC/NP согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Валентность анти-CD28 составила 1,4 pMHC/NP согласно измерениям методом иммуноферментных пятен.

[0033] На Фигуре 8 представлено 30000х и 40000х увеличение рМНС-конъюгированных Fe₃O₄ наночастиц (IGRP-SFPE-080411) в PBS. Железные наночастицы (SFPE-072611) имели размер ядра 9,4 нм. Концентрация рМНС составила 340 мкг/мл согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Концентрация Fe составила 500 мкг/мл (2,5×10¹⁴ pMHC-FeNP/мл). Валентность рМНС составляет 16 pMHC/NP согласно измерениям методом иммуноферментных пятен.

[0034] На фигурах 9А-С представлен анализ рМНС-конъюгированных SFPE наночастиц на агарозном и нативном гелях. На Фигурах 9А и 9В представлены агарозные гели перед окрашиванием кумасси синим (Фигура 9А) и после окрашивания (Фигура 9В) при этом на дорожки 1-5 внесены: 4 мкг рМНС (дорожка 1), 2 мкг рМНС (дорожка 2), 10 мкг SFPE-080311 (дорожка 3), 20 мкл рМНС/анти-CD28-SFPE-080411 (дорожка 4), и 20 мкл pMHC-SFPE-080411 (дорожка 5). На Фигуре 9С изображен нативный гель, в который внесли 4 мкг рМНС (дорожка 1), 2 мкг рМНС (дорожка 2), 4 мкг анти-CD28 (дорожка 3), 2 мкг анти-CD28 (дорожка 4), 18 мкл pMHC-SFPE-080411 (дорожка 5), 18 мкл pMHC/анти-CD28-SFPE-0080411 (дорожка 6), и 10 мкл SFPE-080311 (дорожка 7).

[0035] На Фигурах 10А-В представлен IFN-γ-ответ и пролиферативный ответ 8,3-клеток на рМНС-конъюгированные SFPE-NP. На Фигуре 10А представлен IFN-γ-ответ (IFNγ, левая панель) и пролиферативный ответ (СРМ, правая панель) на pMHC-SFPE-080411. На Фигуре 10В представлен IFN-γ-ответ (IFNγ, левая панель) и пролиферативный ответ (СРМ, правая панель) на рМНС/анти-CD28-SFPE-080411.

[0036] На Фигурах 11А-В представлены последовательности белка и ДНК конструкта mB7.1-hFcAA. Последовательности индивидуальных компонентов в гибридном белке выделены следующим образом: лидерная белковая последовательность НА выделена в рамке, последовательность белка mB7.1 подчеркнута, последовательность фрагмента белка hFcAA закрашена серым, последовательность биотинилирования белка BirA выделена в диагональной рамке, и мутированный сайт связывания FcR (LL на АА) внутри области СН2 отмечен звездочками (А*А*).

[0037] На Фигуре 12 представлен пролиферативный ответ CD4+ Т-клеток на гибридный белок mB7.1-hFc в присутствии субоптимальной концентрации анти-CD3 (0,5 мкг/мл). Данная фигура демонстрирует, что сконструированный гибридный белок mB7.1-hFc может эффективно передавать костимулирующий сигнал TCR-стимулированным Т-клеткам.

Подробное описание

[0038] Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными воплощениями, и как таковое может, конечно, варьировать. Также следует понимать, что использованная в настоящем документе терминология необходима только для целей описания конкретных воплощений, и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которые будут ограничены только прилагаемой формулой изобретения.

[0039] Следует отметить, что примененные в версии данного документа и приложенной формуле изобретения на английском языке формы единственного числа «a», «and» и «the» включают значение во множественном числе, если контекст ясно не указывает иное. Таким образом, например, «наполнитель» включает множество наполнителей.

I. Определения

[0040] Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют тот же смысл, который вкладывается в них специалистами в области, к которой принадлежит данное изобретение. В описании данного изобретения следующие термины имеют следующие значения:

[0041] При использовании в данном документе, термин «включающий» или «включает» предназначен для обозначения того, что композиции и способы включают перечисленные элементы, но не исключают других. «По существу состоящий из» при применении в отношении определенных композиций и способов будет означать исключение других элементов любого существенного значения по отношению к комбинации для установленных целей. Таким образом, композиция, по существу состоящая из элементов, определенных в данном документе, не будет исключать других материалов или стадий, которые не оказывают материального эффекта на основные и новые характеристики заявленного изобретения. «Состоящий из» будет означать исключение более чем редких элементов или других ингредиентов и существенных стадий способа. Воплощения, определенные каждым из этих переходных терминов, находятся в рамках настоящего изобретения.

[0042] С помощью термина «биосовместимый» обозначают, что компоненты системы доставки не будут вызывать поражения тканей или поражения биологической системы человека. Для придания биосовместимости предпочтительно будут использоваться полимеры и вспомогательные вещества, о которых известно, что они безопасно применялись для человека или имеют статус GRAS (англ. Generally Accepted As Safe, общепринятые как безопасные). С помощью биосовместимости указывают на то, что ингредиенты и вспомогательные вещества, используемые в композиции, будут в конечном счете «биоабсорбированы» или выведены организмом без вредного воздействия на организм. Для того чтобы композиция была биосовместимой и рассматривалась как нетоксичная, она не должна быть причиной токсичности по отношению к клеткам. Аналогично, термин «биоабсорбируемый» относится к наночастицам, сделанным из материалов, которые подвергаются биоабсорбции in vivo в течение такого периода времени, при котором удается избежать продолжительного накапливания материала в пациенте. В предпочтительном воплощении биосовместимая наночастица биабсорбируется в течение периода, составляющего менее, чем 2 года, предпочтительно, менее чем 1 год и еще более предпочтительно, менее чем 6 месяцев. Скорость биоабсорбции связана с размером частицы, используемым материалом и с другим факторами, хорошо известными специалистам в данной области. Смесь из биоабсорбируемых, биосовместимых материалов может использоваться для образования наночастиц, используемых по изобретению. В одном воплощении могут быть объединены оксид железа (III) и биосовместимый, биоабсорбируемый полимер. Например, могут быть объединены оксид железа (III) и PGLA с образованием наночастицы.

[0043] Комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица относятся к презентации пептида, углевода или другого антигенного сегмента, фрагмента или эпитопа антигенной молекулы или белка на поверхности, такой как наночастица. При использовании в данном документе термин «антиген» относится ко всей молекуле, ее части, фрагменту или сегменту, которые могут индуцировать иммунный ответ у объекта или наработку антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток.

[0044] При использовании в данном документе термин «костимулирующая молекула» обозначает молекулу, которая может вызывать костимулирующий сигнал, который активирует наивную Т-клетку. Полная активация наивных Т-клеток требует, по меньшей мере, двух сигналов. Первый сигнал обеспечивается антигеном, представляемым антигенпрезентирующими клетками, связанный с комплексом МНС. Второй сигнал представляет собой костимулирующий сигнал. Данный сигнал является агонистическим сигналом, направленным на костимулирующие рецепторы на Т-клетках. Т-клеточный костимулирующий сигнал является критическим компонентом для пролиферации, дифференцировки и выживания Т-клетки. Настоящее изобретение охватывает молекулы, способные вырабатывать костимулирующий сигнал. Как таковое, настоящее изобретение не ограничено конкретной костимулирующей молекулой. В некоторых случаях костимулирующая молекула представляет собой антитело, способное быть агонистом костимулирующего рецептора на Т-клетке.

[0045] Термин «около» при использовании перед числовым обозначением, например, температуры, времени, количества и концентрации, включая интервал, указывает на приближения, которые могут варьировать в сторону (+) или (-) на 10%, 5%, или на 1%.

[0046] С помощью термина «уничтожение» или «уничтожает» обозначают, что клеточная смерть происходит путем апоптоза или некроза. Апоптоз или некроз может быть опосредован с помощью любого пути клеточной смерти.

[0047] «Иммунные клетки» включают, например, зрелые спленоциты, Т-лимфоциты, В-лимфоциты и клетки, происходящие из костного мозга, такие как клетки млекопитающего, презентирующие дефектный антиген, которые обладают активностью по отношению к организму, из которого была выделена иммунная клетка.

[0048] «Имитатор» представляет собой аналог данного лиганда или пептида, где аналог по существу аналогичен лиганду. «По существу аналогичный» означает, что аналог имеет профиль связывания, аналогичный профилю лиганда, за исключением того, что имитатор содержит одну или несколько функциональных групп или модификаций, который суммарно соответствуют менее чем около 50%, менее чем около 40%, менее чем около 30%, менее чем около 20%, менее чем около 10%, или менее чем около 5% молекулярной массы лиганда.

[0049] «Эффективное количество» это количество, достаточное для достижения предназначенной цели, например, модуляции Т-клеточной активности или Т-клеточных популяций. Согласно описанию в данном документе, эффективное количество или дозировка и частота введения зависят от цели и антигена и могут определяться согласно настоящему описанию.

[0050] «Антигенспецифичная противоопухолевая Т-клетка» или «противоопухолевая Т-клетка» представляет собой Т-клетку, которая вовлечена в иммунный ответ, направленный на лечение заболевания, связанного со злокачественными клетками, предзлокачественными клетками, неопластическими клетками или с развитием опухолей. Предполагается, что при введении опухолеспецифичных антигенов, ковалентно связанных с комплексами МНС/костимулирующая молекула/наночастица, пациентам, страдающим опухолевым заболеванием или имеющим риск развития опухоли, наивные Т-клетки будут дифференцироваться в Т-клетки, способные воздействовать на иммунный ответ, который направлен на злокачественные клетки, обладающие указанным опухолеспецифичным антигеном. Такие злокачественные клетки, необязательно должны быть в форме твердой опухоли, но также могут циркулировать в крови, как в виде злокачественных лимфатических клеток, так и могут мигрировать по организму, как в случае метастатических клеток. Специфические противоопухолевые Т-клетки, наработанные данным способом, включают, в частности, противоопухолевые CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки памяти, противоопухолевые цитотоксические CD8⁺ Т-клетки и противоопухолевые хелперные CD4⁺ Т-клетки.

[0051] Термины «ингибирование», «уменьшение» или «предотвращение» или любой вариант этих терминов при использовании в формуле изобретения и/или в описании включают любое измеряемое уменьшение или полное ингибирование с достижением целевого результата. Термин предотвращение, когда он относится к злокачественному новообразованию, обозначает предотвращение прогрессии от предзлокачественного состояния до злокачественного состояния.

[0052] Термин «злокачественная клетка» обозначает клетку, которая проявляет одну или несколько характеристик или признаков злокачественного новообразования. Такие признаки злокачественного новообразования включают самодостаточность в сигналах роста, нечувствительность к сигналам, ингибирующим рост (антиростовым), уклонение от программируемой клеточной смерти (апоптоз), безграничный репликативный потенциал, замедленный ангиогенез, и инвазия ткани и матастазирование. Каждое из этих физиологических изменений - новые способности, приобретаемые в процессе развития опухоли - представляют собой успешный прорыв механизма противоопухолевой защиты, имеющийся в клетках и тканях.

[0053] Термин неопластический относится к аномальной массе ткани появившейся в результате неоплазии. Неоплазия представляет собой аномальную пролиферацию клеток. Рост неопластических клеток превышен и не скоординирован с ростом нормальных тканей вокруг них. Рост продолжается в такой же избыточной манере даже после отмены стимулов. Неоплазии могут быть доброкачественные, предзлокачественными или злокачественными. В одном воплощении композиции и способы, описанные в данном документе, направлены на предзлокачественные или злокачественные клетки. При использовании в данном документе, «предзлокачественный» означает раннюю форму злокачественного новообразования, которое определяется отсутствием инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани. «Предзлокачественный» также относится к дисплазии, которая является ранней формой предзлокачественного поражения, распознаваемого патологоанатомом по биопсии.

[0054] Использование артиклей «а» или «an» при их использовании совместно с термином «включающий» в формуле изобретения и/или в описании может означать «один», но соответствует значению «один или более», «по меньшей мере, один» и «один или более чем один».

[0055] Термин «противоопухолевый» относится к клеткам, которые обладают защитным эффектом против развития опухоли, неопластических клеток и