Моноклональные антитела и способы их применения

Моноклональные антитела и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Методика относится к иммуногенам и к связывающим средствам, которые связываются с иммуногенами, таким как моноклональные антитела, для идентификации или выделения злокачественных клеток, которые содержат иммуногены, или лечения или профилактики злокачественных опухолей, содержащих злокачественные клетки, в частности, у собак.

ИНФОРМАЦИЯ О ПРЕДШЕСТВУЮЩЕМ УРОВНЕ ТЕХНИКИ

Связывающие средства, такие как моноклональные антитела, являются подходящими для диагностики и лечения заболеваний, таких как злокачественная опухоль. Например, у псовых (собак) тип злокачественной опухоли представляет собой B-клеточную лимфому, при которой неконтролируемая B-клеточная пролиферация может приводить к заболеванию и смерти. Лимфома также возникает у людей, и ее можно лечить антителами против CD20 человека, например, такими как ритуксимаб. Эти антитела, которые взаимодействуют или связываются с CD20 человека, как правило, не связываются с CD20 собак (Jubala et al., Vet. Pathol., Jul; 42(4):468-76, 2005; Impellizeri et al., Vet. J., May; 171(3):556-8, 2006; Gravanis et al., The Oncologist, Dec; 15:1335-1343, 2010). Таким образом, желательными являются связывающие средства, способные взаимодействовать с CD20 на поверхности B-клеток собаки. Описываемая в настоящем описании методика относится к таким реагентам и терапевтическим средствам, как продемонстрировано ниже.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к реагентам и способам профилактики и/или лечения болезненных состояний у собак (например, лимфомы). Например, были идентифицированы эпитопы CD20 собаки, которые можно использовать в качестве мишени для уменьшения B-клеточной лимфомы клеток в крови и/или ткани собак. Были идентифицированы иммуногены, как описано в настоящем описании, которые можно использовать для индукции и/или усиления иммунного ответа (например, продукции антител), подходящие для использования при профилактике и/или лечении таких заболеваний. Также описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуногены и полипептидные/пептидные иммуногены по существу, и способы их получения. В определенных вариантах осуществления иммуногены представляют собой или содержат конкретные представляющие интерес эпитопы, такие как LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1) и/или DIHNCD (SEQ ID NO:2). Эти иммуногены можно использовать самостоятельно и/или с другими иммуногенами, и/или ʺостовамиʺ (например, Fc собак) для индукции и/или усиления иммунного ответа, например, против CD20 собаки.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к связывающим средствам, подходящим для выделения и/или идентификации клеток, экспрессирующих CD20 собаки, или клеток, которые содержат белок клеточной поверхности, который взаимодействует с этими связывающими средствами (например, B-клеток, B-клеток лимфомы, CD20 собаки), и/или лечения и профилактики злокачественной опухоли у млекопитающего (например, у собак). В определенных вариантах осуществления связывающее средство может представлять собой антитело, реактивное против CD20 собаки, экспрессируемого на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления одно или более связывающих средств (например, антитело, такое как моноклональное антитело) связываются или взаимодействуют с CD20 собаки в его области, которая содержит аминокислотные последовательности или эпитоп(ы), LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1) и/или DIHNCD (SEQ ID NO: 2).

Другие варианты осуществления относятся к способам детекции клеток собак с использованием таких связывающих средств. В определенных вариантах осуществления можно идентифицировать и/или выделять клетки, экспрессирующие CD20 на своей клеточной поверхности (например, B-клеточной лимфомы), у животного (например, собак) посредством приведения в контакт тестируемого биологического образца, содержащего клетки, со связывающим средством и детекции связывающего средства, связанного с биологическим образцом, или его компонентов (например, клеток лимфомы). В определенных вариантах осуществления способ может включать сравнение количества связывания в тестируемом биологическом образце с количеством связывания в контрольном биологическом образце, где повышенное связывание с тестируемым биологическим образцом относительно контрольного биологического образца может указывать на наличие одной или более клеток лимфомы в тестируемом биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой кровь собак или отобранный шприцем аспират. Эти способы также предоставлены в формате in vivo и/или in vitro.

Некоторые варианты осуществления также относятся к способам элиминации клеток, экспрессирующих CD20 собаки, с использованием таких связывающих средств. Также предоставлены способы лечения одного или более болезненных состояний (например, лимфомы) у животного (например, собак) посредством введения животному по меньшей мере одной или более эффективных доз связывающего средства или его производного. В некоторых вариантах осуществления, в которых связывающее средство представляет собой моноклональное антитело, моноклональное антитело можно вводить при величине дозы приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/кг массы тела животного, приблизительно от 1 приблизительно до 30 мг/кг или приблизительно от 5 приблизительно до 30 мг/кг (например, приблизительно 10 мг/кг). Связывающие средства можно вводить более одного раза в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах осуществления связывающее средство можно вводить в сочетании с одним или более других средств (например, химиотерапевтических средств).

Также изобретение относится к наборам для использования связывающего средства для идентификации или детекции полипептидов и/или реагирующих с ними клеток и/или для использования таких связывающих средств для профилактики и/или лечения заболевания (например, лимфомы собак). Набор может содержать, например, связывающее средство или его производное в любой форме (например, в растворе, в лиофилизированной форме) необязательно совместно с инструкциями по использованию. Другие варианты осуществления станут понятны из описаний, предоставленных в настоящем описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. FACS-анализ аффинности связывания моноклональных антител с клетками B-клеточной лимфомы собак.

Фигура 2. A. Выравнивание внеклеточных доменов CD20 собаки и человека и вариантов гибридов человека/собаки V1-V4. B. Анализ связывания ELISA гибридомных антител 1E4, 1G1 и 1G10 с ECD2 CD20 собаки и V1-V4.

Фигура 3. FACS-анализ связывания гибридомного антитела 1E4 с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) собаки.

Фигура 4. A. Анализ SDS-PAGE очищенного химерного антитела 1E4-cIgGB против CD20 собаки, экспрессируемого клетками CHO. B. Анализ эксклюзионной хроматографией очищенного 1E4-cIgGB.

Фигура 5. Анализ ELISA связывания пептида ECD2 CD20 немодифицированным (WT) антителом 1E4-cIgGB и антителами с указанными заменами аминокислот на последовательность NG в V_L 1E4-cIgGB в увеличивающихся концентрациях.

Фигура 6. Дозозависимая элиминация B-клеток собаки in vivo с использованием иллюстративного антитела 1E4-cIgGB. Ритуксан-cIgGB включали в качестве отрицательного (изотипического) контроля.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Связывающие средства

Настоящее изобретение относится к связывающим средствам, которые связываются с CD20 собаки на поверхности клеток in vitro и/или in vivo. Связывающие средства могут также связываться с выделенными полипептидами и/или фрагментами и/или их производными CD20 собаки. Также предоставлены способы диагностики, лечения и/или профилактики одного или более заболеваний, связанных с наличием клеток, экспрессирующих CD20 собаки. Например, связывающие средства могут представлять собой антитела (например, моноклональные антитела), которые могут взаимодействовать и/или связываться с эпитопами SEQ ID NO: 1 и/или 2. Эти моноклональные антитела могут содержать любую одну или более из аминокислотных последовательностей, представленных в таблицах 1 и 4-5, например, (и/или один или более их фрагментов и/или производных), и их может кодировать любая одна или более нуклеотидных последовательностей, представленных в настоящем описании (и/или один или более их фрагментов и/или производных). Настоящее изобретение также относится к использованию таких моноклональных антител для выделения, идентификации, и/или клеток-мишеней, экспрессирующих CD20 собаки (например, клеток B-клеточной лимфомы собак) для ингибирования (например, цитотоксичности) для профилактики и/или лечения злокачественной опухоли у животных (например, у собак). В определенных вариантах осуществления эти моноклональные антитела могут быть реактивными против CD20 собаки, экспрессируемого на поверхности клеток.

Связывающие средства, как правило, взаимодействуют или специфически связываются с мишенью. Например, связывающие средства, описываемые в настоящем описании, как правило, специфически взаимодействуют с областями CD20 собаки в качестве мишени. Связывание ʺспецифическиʺ с CD20 означает, что количество связывания с CD20 является больше чем количество связывания с мишенями не-CD20 (т.е. существует фоновое неспецифическое связывание). Как правило, специфическое связывание связывающих средств с белком, например, можно получать посредством связывания с конкретной последовательностью аминокислот в белке-мишени. Эти последовательности можно обозначать как эпитопы. Молекулы, содержащие эпитопы, можно использовать для стимуляции связывающих средств, такие как антитела, и их можно обозначать как иммуногены. Связывающие средства могут также распознавать конкретные 2- и/или 3-мерные структуры в составе эпитопа. В одном из примеров моноклональные антитела, описываемые в настоящем описании, могут связываться с эпитопами CD20 собаки, такими как LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1) и/или DIHNCD (SEQ ID NO:2).

Предполагают, что специфическое взаимодействие или связывание связывающего средства со своей мишенью представляет собой тип равновесной реакции. В одном из примеров можно количественно определять специфическое связывание. Для количественного определения можно использовать константу диссоциации или K_d. В данной области известно, что K_d представляет собой тип константы равновесия, которая описывает способность, в данном случае, антитела отделяться от антигена или эпитопа, с которым оно связалось. Таким образом, K_d описывает аффинность, которой обладает антитело по отношению к эпитопу. Чем ниже K_d, тем выше аффинность связывающего средства по отношению к своей мишени.

В определенных вариантах осуществления связывающее средство представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 1E4, 1G10 и 1G1, как описано в настоящем описании. Моноклональное антитело может содержать аминокислотную последовательность любую одну или более из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 11, 13 и/или 15 (например, как в таблице 1) и/или любой один или более их фрагментов и/или производных. Антитела могут содержать любую из последовательностей CDR, указанных в таблице 4. Антитело (например, моноклональное антитело) также может быть любого подходящего изотипа или подкласса изотипа. В определенных вариантах осуществления антитело относится к подклассу IgG собаки, например, IgGA, IgGB (например, SEQ ID NO:55 или 57; таблица 5), IgGC и/или IgD, как описано у Tang et al., Vet. Immunol. Immunopathol., Aug; 80(3-4):259-70, 2001.

Связывающее средство также может представлять собой производное антитела (например, моноклонального антитела 1E4, 1G10 и/или 1G1), такое как, например, Fab, F(ab')₂, Fab', одноцепочечное антитело, Fv, одноцепочечное моноспецифическое антитело, биспецифическое антитело, триспецифическое антитело, поливалентное антитело, химерное антитело, химерное антитело собаки-человека, химерное антитело собаки-мыши, антитело, содержащее F_c собаки, гуманизированное антитело, антитело человека, канинизированное антитело, CDR-трансплантированное антитело, антитело акулы, нанотело (например, антитело, содержащее одиночный мономерный вариабельный домен), антитело верблюда (например, семейства Camelidae), микротело, интраантитело (например, внутриклеточное антитело) и/или дефукозилированное антитело и/или его производное. Также предоставлены миметики связывающих средств и/или антител. Связывающее средство также может содержать детектируемую метку и/или эффекторную молекулу, обратимо связанную с ним.

Также предоставлены выделенные полинуклеотиды, кодирующие подходящие связывающие средства. Такие полинуклеотиды могут содержать, например, любую одну или более из SEQ ID NO:4, 5, 7, 8, 10, 12, 14 и/или 16 (например, таблица 1) и/или любой один или более их фрагментов и/или производных. Определенные варианты осуществления относятся к векторам экспрессии и/или клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотиды, и/или кодирующим и/или экспрессирующим такие полипептиды.

Некоторые варианты осуществления также относятся к композициям, содержащим такие связывающие средства, полипептиды, пептиды, полинуклеотиды, векторы экспрессии и/или клетки-хозяева. В определенных вариантах осуществления композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель.

Моноклональные антитела, описываемые в настоящем описании, (обозначаемые как антитела ʺAʺ для этого примера), которые связываются с конкретным эпитопом или эпитопами, могут конкурировать за связывание с другими антителами (обозначаемыми как антитела ʺBʺ для этого примера), которые распознают такие же или аналогичные эпитопы, или которые распознают эпитопы, которые находятся по близости с эпитопами, распознаваемыми антителами ʺAʺ (например, перекрывающиеся эпитопы). Конкуренция означает, что одно из антител связывается в ущерб другому антителу, или по меньшей мере ингибирует до некоторой степени связывание другого антитела. Например, говорят, что антитело ʺAʺ, которое снижает или предотвращает связывание антитела ʺBʺ, конкурирует с ʺBʺ за связывание. Такие антитела ʺBʺ также представляют собой примеры антител, которые являются частью изобретения, описываемого в настоящем документе. Конкуренция между антителами ʺAʺ и ʺBʺ за связывание со своими эпитопами можно измерять с использованием так называемых конкурентных экспериментов. Как правило, в конкурентных экспериментах связывающие средства, которые необходимо сравнивать, добавляют/помещают по близости от мишени, с которой связывающие средства способны связываться, или предполагают, что они связываются. Эксперименты планируют таким образом, чтобы было возможно количественно определять связывание индивидуальных связывающих средств с мишенью. Конкуренцию выявляют, например, когда добавление по меньшей мере одного антитела ʺAʺ приводит к связыванию антитела ʺBʺ с меньшей степенью, чем если бы антитело ʺAʺ не присутствовало. В одном из примеров связывающее средство ʺAʺ конкурирует со связывающим средством ʺBʺ за связывание с мишенью. ʺBʺ также может конкурировать с ʺAʺ. Антитела ʺAʺ и ʺBʺ могут обладать или могут не обладать по существу одинаковыми Kd.

В случае, когда связывающее средство представляет собой антитело, его можно идентифицировать по отношению к нуклеотиду и/или аминокислотной последовательности, соответствующей его вариабельным и/или определяющим комплементарность областям (ʺCDRʺ). Например, иллюстративное связывающее средство, которое представляет собой, получают из или является родственным моноклональному антителу 1E4, 1G10 или 1G1, может содержать тяжелую и/или легкую цепь, каждая из которых содержит одну или более константных и/или вариабельных областей. Вариабельные области, как правило, содержат одну или более CDR, которые в значительной степени определяют специфичность связывания антитела. Такие моноклональные антитела можно идентифицировать анализом нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные области. Моноклональные антитела также можно идентифицировать анализом аминокислотных последовательностей (например, которые могут кодироваться нуклеотидными последовательностями) вариабельных областей. Например, иллюстративные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи 1E4, 1G10 и 1G1 и иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие их, представлены ниже:

Таблица 1
Описание	Последовательность
Вариабельная область легкой цепи (VL) 1E4	DVVMTQNPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIYNNGNTYLHWYRQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:3)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:3 (1E4,VL)	GATGTTGTGATGACCCAAAACCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTATATACAATAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCGGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO:4)

Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:3 (1E4,VL)	GATGTCGTGATGACTCAGAATCCACTGTCCCTGCCTGTGTCCCTGGGCGATCAGGCTTCCATTAGCTGTCGTTCCTCTCAGTCCCTGATCTACAACAATGGTAACACCTACCTGCACTGGTATAGACAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAAGTGAGTAATAGGTTCTCAGGAGTCCCAGACCGGTTTTCCGGCAGCGGATCTGGGACCGATTTCACACTGAAAATCTCTAGGGTGGAGGCCGAAGACCTGGGCGTCTACTTTTGTAGTCAGAGCACTCACGTCCCCTTCACCTTCGGCAGCGGAACAAAACTGGAAATCAAG (SEQ ID NO:5)
Вариабельная область тяжелой цепи (VH) 1E4	EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMLWVRQAPEKGLEWIAYISSGSSTIYYADRVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCSTGTFAYWGQGTPVTVSS (SEQ ID NO:6)
Нуклеотидная последовательность, кодирующаяSEQ ID NO:6 (1E4, VH)	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCTCTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGATTGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCATCTACTATGCAGACAGAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTTCAACTGGGACGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCCGGTCACTGTCAGCTCA (SEQ ID NO:7)
Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:6 (1E4, VH)	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTGGTCAAGCCTGGAGGTTCCCTGAAACTGAGTTGTGCCGCATCTGGGTTTACATTCTCTGACTACGGAATGCTGTGGGTGAGGCAGGCACCAGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGCTTATATTTCCAGCGGATCTAGTACTATCTACTATGCAGACAGGGTCAAGGGCCGGTTCACCATTAGCAGAGATAACGCCAAAAATACCCTGTTTCTGCAGATGACATCACTGAGGTCCGAGGATACCGCTATGTATTATTGCTCCACAGGGACTTTTGCTTACTGGGGACAGGGGACACCCGTGACCGTCAGCTCA (SEQ ID NO:8)

Вариабельная область легкой цепи (VL) 1G10	DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSNKSLLHRNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:9)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:9 (1G10, VL)	GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAATAAGAGTCTCCTGCATCGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTTCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAATCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTGGAATTTCCTTTCACGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 10)
Вариабельная область тяжелой цепи (VH) 1G10	EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTSYNQKFKGKAPLTVDKSSSTAYMEVRSLTSEDSAVYFCARGGVLRYPYYYVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 11)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 11 (1G10, VH)	GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGACATTAATCCTAACAATGGTGATACTAGCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAAGGCCCCCTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGGTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGGAGGAGTACTACGGTACCCGTATTACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCAGCTCA (SEQ ID NO: 12)

Вариабельная область легкой цепи (VL) 1G1	DIVMTQSQKFMSRSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYQQRPGQSPKPLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 13)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 13 (1G1, VL)	GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCAGATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTCCTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAATCTCCTAAACCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAACTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 14)
Вариабельная область тяжелой цепи (VH) 1G1	EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGHTKYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSLRHYYGSSYVSPHYYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 15)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 15 (1G1, VH)	GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAATATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTCATACTAAATATGCCTCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTTCCCTCCGGCATTACTACGGTAGTAGCTACGTATCGCCCCATTACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACTGTCAGCTCA (SEQ ID NO: 16)

При желании специалист в данной области также может заменять любую из аминокислот, представленных в таблице 1 (и/или любого одного или более их фрагментов и/или производных) на любую другую аминокислоту. Например, специалист в данной области также может проводить консервативные замены, заменяя конкретные аминокислоты другими, представленными в таблице 7, ниже. Иллюстративные аминокислоты, которые можно заменять, могут включать, например, остатки 26, 28, 33 и/или 34 SEQ ID NO:9 (вариабельная область легкой цепи 1G10), остатки 55 и/или 56 SEQ ID NO: 11 (вариабельная область тяжелой цепи 1G10), и/или остатки 52, 53, 55 и/или 56 SEQ ID NO: 15 (вариабельная область тяжелой цепи 1G1), которые можно заменять любой другой o аминокислотой, включая, но ими не ограничиваясь, консервативные замены, представленные в таблице 7, ниже. Нуклеотидные последовательности, кодирующие консервативные аминокислотные замены, можно конструировать с использованием генетического кода, как указано в таблице 6. Примеры таких замещенных аминокислотных последовательностей включают, например:

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSXKXLLHRXXNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 17), где X представляет собой любую аминокислоту (модификацию вариабельной области легкой цепи 1G10, указанную посредством SEQ ID NO:9);

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNXXDTSYNQKFKGKAPLTVDKSSSTAYMEVRSLTSEDSAVYFCARGGVLRYPYYYVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 18), где X представляет собой любую аминокислоту (модификацию вариабельной области тяжелой цепи 1G10, указанную посредством SEQ ID NO: 11); и

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGWIXXEXXHTK YASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSLRHYYGSSYVSPHYYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 19), где X представляет собой любую аминокислоту (модификацию вариабельной области тяжелой цепи 1G1, указанную посредством SEQ ID NO: 15.

Любую из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 1, и/или любые их фрагменты и/или производные можно также комбинировать с любой другой вариабельной областью и/или CDR в любом порядке и/или комбинации с получением гибридных и/или слитых связывающих средств и/или встраивать в другие вариабельные области тяжелых и/или легких цепей стандартными способами. Их можно использовать в сочетании с любыми константными областями (например, как в таблице 5).

CDR (определяющие комплементарность области) представляют собой аминокислотные последовательности из антител, которые по меньшей мере частично ответственны за связывание антитела с конкретной мишенью. Специалистам в данной области следует понимать, что CDR можно идентифицировать любым из некоторых способов и/или с использованием систем. CDR связывающих средств, продемонстрированных в настоящем описании, можно идентифицировать любые из таких способов. Например, специалист в данной области может идентифицировать CDR с использованием системы нумерации Kabat, системы нумерации Chothia, улучшенной системы нумерации Chothia и/или любой из доступных систем определения CDR (например, AbM, определение контакта, и/или как описано MacCullum et al., J. Mol. Biol., 262(5):732-745, 1996). Сущность различных систем, частично основанных, например, на Kabat et al., ʺSequences of Proteins of Immunological Interestʺ, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication No. 91-3242 (1991), и Al-Lazikani et al., ʺStandard conformations for the canonical structures of immunoglobulinsʺ, J. Mol. Biol., 273:927-948, 1997, приведена в таблице 2 ниже:

Таблица 2
CDR Петля*	Kabat	AbM	Chothia	Контакт
L1	L24--L34	L24--L34	L24--L34	L30--L36
L2	L50--L56	L50--L56	L50--L56	L46--L55
L3	L89--L97	L89--L97	L89--L97	L89--L96
H1	H31--H35B(нумерация по Kabat)	H26--H35B	H26--H32..34	H30--H35B
H1	H31--H35(нумерация по Chothia)	H26--H35	H26--H32	H30--H35
H2	H50--H65	H50--H58	H52--H56	H47--H58
H3	H95--H102	H95--H102	H95--H102	H93--H101
*L=легкая цепь; H=тяжелая цепь

CDR также можно идентифицировать, следуя следующему набору правил, таких как набор правил, указанный в таблице 3 ниже (как описано http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid):

Таблица 3
CDR*/Признак	Стандартная характеристика признака**
CDR-L1
Начало	приблизительно остаток 24
Остатки перед	как правило, Cys
Остатки после	как правило, Trp (например, Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu)
Длина	от 10 до 17 остатков
CDR-L2
Начало	как правило, 16 остатков после конца L1
Остатки перед	как правило, Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys или Ile-Phe
Длина	как правило, семь (7) остатков
CDR-L3
Начало	как правило, 33 остатка после конца L2
Остатки перед	как правило, Cys
Длина	как правило, Phe-Gly-X-Gly
Остатки после	от 7 до 11 остатков
CDR-H1
Начало	приблизительно остаток 26 (как правило, четыре (4) остатка после Cys) (определение по Chothia/AbM), в определении по Kabat начинают после 5 остатков
Остатки перед	как правило, Cys-X-X-X
Остатки после	как правило, Trp (например, Trp-Val, Trp-Ile, Trp-Ala)

Длина	от 10 до 12 остатков (определение AbM), в определении по Chothia исключают последние четыре (4) остатка
CDR-H2
Начало	как правило, 15 остатков после конца CDR-H1 согласно определению по Kabat/AbM
Остатки перед	как правило, Leu-Glu-Trp-Ile-Gly
Остатки после	как правило, Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala
Длина	Определение по Kabat от 16 до 19 остатков, определение AbM (и последнее Chothia) от 9 до 12 остатков
CDR-H3
Начало	как правило, 33 остатка после конца CDR-H2 (как правило, два (2) остатка после Cys)
Остатки перед	как правило, Cys-X-X (как правило, Cys-Ala-Arg)
Остатки после	как правило, Trp-Gly-X-Gly
Длина	как правило, от 3 до 25 остатков
*L=легкая цепь; H=тяжелая цепь; **X=любая аминокислота

Эти системы определения CDR являются только иллюстративными, и подходящими могут быть другие системы, как понятно специалисту в данной области. Определяемые таким образом CDR можно использовать для идентификации подходящих связывающих средств. Например, эквиваленты одного или более моноклональных антител 1E4, 1G10 и/или 1G1 могут представлять собой связывающие средства, содержащие аминокислотные последовательности. Такие CDR также можно комбинировать друг с другом в любом порядке, и/или они могут представлять собой комбинации с образованием гибридных и/или слитых связывающих средств, и/или их можно встраивать стандартными способами в другие вариабельные области тяжелых и/или легких цепей. Аминокислотные последовательности, представленные в таблице 1, и/или любой один или более их фрагментов и/или производных могут быть кодированы любой из нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты. Такие последовательности нуклеиновой кислоты также можно использовать для идентификации и/или получения (например, в качестве молекул нуклеиновой кислоты) подходящих связывающих средств. Например, специалист в данной области может конструировать нуклеотидные последовательности, кодирующие любые такие аминокислотные последовательности на основании любой одной или более из таблиц 1-7 в настоящем описании. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области легкой цепи 1E4, 1G10 и 1G1, могут представлять собой такие, как описанные в таблице 1. Любую из нуклеотидных последовательностей, представленных в таблице 1, и/или их фрагменты и/или производные можно комбинировать друг с другом в любом порядке и/или комбинации для кодирования гибридных и/или слитых связывающих средств и/или введения в другие последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области легкой и/или тяжелой цепей (и/или их фрагменты и/или производные). Иллюстративные фрагменты могут представлять собой, например, любую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любую из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 1, и/или любой ее фрагмент и/или производное (например, один или более ее CDR). Предполагаемые CDR моноклональных антител 1E4, 1G10 и 1G1 перечислены в таблице 4. Эти CDR были идентифицированы с использованием систем, указанных Kabat et al., ʺSequences of Proteins of Immunological Interestʺ, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication No. 91-3242 (1991), и Al-Lazikani et al., ʺStandard conformations for the canonical structures of immunoglobulinsʺ, J. Mol. Biol., 273:927-948, 1997.

Таблица 4
CDR	Kabat CDR(Kabat et al. 1991)	Chothia CDR(Al-Lazikani et al. 1997)
1E4 CDRH1	DYGML(SEQ ID NO:20)	GFTFSDY(SEQ ID NO:21)
1E4 CDRH2	YISSGSSTIYYADRVKG(SEQ ID NO:22)	SSGSST(SEQ ID NO:23)
1E4 CDRH3	GTFAY(SEQ ID NO:24)	GTFAY(SEQ ID NO:24)
1E4 CDRL1	RSSQSLIYNNGNTYLH(SEQ ID NO:25)	SQSLIYNNGNTY(SEQ ID NO:26)
1E4 CDRL1от N33 до K	RSSQSLIYNKGNTYLH(SEQ ID NO:70)	SQSLIYNKGNTY(SEQ ID NO:71)
1E4 CDRL1от G34 до K	RSSQSLIYNNKNTYLH(SEQ ID NO:72)	SQSLIYNNKNTY(SEQ ID NO:73)
1E4 CDRL1от G34 до Q	RSSQSLIYNNQNTYLH(SEQ ID NO:74)	SQSLIYNNQNTY(SEQ ID NO:75)

1E4 CDRL1от G34 до A	RSSQSLIYNNANTYLH(SEQ ID NO:76)	SQSLIYNNANTY(SEQ ID NO:77)
1E4 CDRL2	KVSNRFS(SEQ ID NO:27)	KVS(SEQ ID NO:28)
1E4 CDRL3	SQSTHVPFT(SEQ ID NO:29)	STHVPF(SEQ ID NO:30)
1G1 CDRH1	DDYMH(SEQ ID NO:31)	GFNIKDD(SEQ ID NO:32)
1G1 CDRH2	WIDPENGHTKYASKFQG(SEQ ID NO:33)	DPENGH(SEQ ID NO:34)
1G1 CDRH3	LRHYYGSSYVSPHYY(SEQ ID NO:35)	LRHYYGSSYVSPHYY(SEQ ID NO:36)
1G1 CDRL1	KASQNVGPNVA(SEQ ID NO:37)	SQNVGPN(SEQ ID NO:38)
1G1 CDRL2	SASYRYS(SEQ ID NO:39)	SAS(SEQ ID NO:40)
1G1 CDRL3	QQYNNYPYT(SEQ ID NO:41)	YNNYPY(SEQ ID NO:42)
1G10 CDRH1	DYYMN(SEQ ID NO:43)	GYTFTDY(SEQ ID NO:44)
1G10 CDRH2	DINPNNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:45)	NPNNGD(SEQ ID NO:46)
1G10 CDRH3	GGVLRYPYYYVMDY(SEQ ID NO:47)	GGVLRYPYYYVMDY(SEQ ID NO:48)
1G10 CDRL1	RSNKSLLHRNGNTYLY(SEQ ID NO:49)	NKSLLHRNGNTY(SEQ ID NO:50)

1G10 CDRL2	RMSNLAS(SEQ ID NO:51)	RMS(SEQ ID NO: 52)
1G10 CDRL3	MQHLEFPFT(SEQ ID NO:53)	HLEFPF(SEQ ID NO:54)

В некоторых вариантах осуществления связывающее средство может содержать аминокислотные последовательности, указанные в таблице 4 выше. Подгруппы из этих комбинаций и/или других комбинаций CDR, представленные в таблице 4, также могут являться подходящими, как будет понятно специалистам в данной области. В одном из примеров, для получения канинизированных антител можно использовать различные комбинации указанных выше CDR.

Последовательности вариабельных областей, описываемые в настоящем описании (которые могут содержать их фрагменты и/или производные), включая, но ими не ограничиваясь, аминокислотные последовательности, представленные в таблице 1 (и/или их фрагменты и/или производные), и/или нуклеотидные последовательности, представленные в таблице 1 (и/или их фрагменты и/или производные), можно использовать в комбинации с одной или более аминокислотных последовательностей и/или нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более константных цепей (и/или их фрагмент и/или производные) молекулы антитела. Например, аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные в таблице 1, можно присоединять к константным областям любой молекулы антитела того же самого или вида, отличного (например, человека, козы, крысы, овцы, курицы) от того для которого получали аминокислотную последовательность вариабельной области.

Дезаминирование остатков аспарагина до аспарагиновой кислоты или изоаспарагиновой кислоты представляет собой широко распространенную посттрансляционную модификацию белков. Дезаминирование может возникать с высокой частотой, когда аспарагин является частью дипептида аспарагин-глицин (Asp-Gly или N-G, последовательность ʺNGʺ). Дезаминирование может оказывать неблагоприятное влияние на белки. В одном из примеров дезаминирование может потенциально приводить к изменению трехмерной структуры белка. В другом примере для антитела дезаминирование в области, которая влияет на связывание с антигеном (например, вариабельных областях и/или CDR), может потенциально приводить к более слабому или потери связывания антитела с антигеном.

Таким образом, благоприятн