Способ получения оптимизированного твердого ген-активированного материала, способ получения твердого матрикса носителя, оптимизированный твердый ген-активированный материал для регенерации тканей

Способ получения оптимизированного твердого ген-активированного материала, способ получения твердого матрикса носителя, оптимизированный твердый ген-активированный материал для регенерации тканей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предшествующий уровень техники

Распространенность заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся или приводящих к повреждениям тканей и органов человека, чрезвычайно велика. Основными причинами повреждений костей и скелетной мускулатуры, кожи, подкожной жировой клетчатки, слизистых оболочек, сосудов, периферических нервов, внутренних органов являются травмы, онкологические, воспалительные, дегенеративно-дистрофические заболевания, врожденные аномалии развития и деформации, а также первые этапы их хирургического лечения.

Травмы занимают ведущее место в структуре причин формирования повреждений тканей и органов. По данным ВОЗ, ежегодное количество пострадавших только в результате дорожно-транспортных происшествий составляет 30-50 млн чел. [1]. В России, по данным ГИБДД, около 230 тыс человек ежегодно получают травмы в результате ДТП [2]. В части онкологических заболеваний, по прогнозам ВОЗ, ежегодное количество вновь диагностированных случаев увеличится с 14 млн (в 2012 г. ) до 22 млн к 2020 г. [3].

В этой связи, ежегодное количество пациентов, нуждающихся в реконструктивно-восстановительных операциях, чрезвычайно велико. Эффективное лечение большинства из них может быть достигнуто с применением стандартных методов и средств, однако у значительной части пациентов не удается добиться действительно успешных результатов, восстановления исходного уровня качества жизни. Это обусловлено тем фактом, что при выраженных (объемных, протяженных) повреждениях тканей и органов, при наличии сопутствующей патологии и факторов риска, отягощающих клиническую ситуацию, в зоне дефекта количество камбиальных клеток и биологически активных веществ, индуцирующих репаративную регенерацию тканей, минимизировано и не позволяет реализовать полное гистотипическое восстановление. Эффективное лечение в таких случаях может быть обеспечено только теми методами и средствами, которые воздействуют на репаративную регенерацию тканей, восполняют утраченные структуры, камбиальный резерв, привносят факторы, регулирующие восстановительный процесс и т.д. Фактически, понимание этого положения и привело к формированию так называемой «регенеративной медицины» [4].

В рамках регенеративной медицины ведутся активные исследования и разработки новых биофармацевтических препаратов (генных [5], клеточных [6]), медицинских изделий и технологий, способных оказать выраженное влияние на репаративную регенерацию тканей, восстановить утраченную структуру и функцию поврежденных органов [7] и позволяющих выполнить их частичную и даже полную замену (персонализированные технологии с применением трехмерной печати) [8].

В регенеративной медицине сформирован арсенал инструментов, относящихся к клеточным, генным и постгеномным технологиям. Живые клетки, факторы роста, генные конструкции отдельно или в различных комбинациях как без дополнительных элементов, так и в составе различных матриксов-носителей разрабатываются и оцениваются на предмет безопасности и эффективности в восстановлении поврежденных тканей и органов [8, 9].

В качестве матриксов-носителей используются любые материалы, главным образом, биорезорбируемые, не содержащие в своем составе биологически активные компоненты, стандартизированные по качественным и количественным показателям. Основными материалами являются аллогенные и ксеногенные матриксы различных технологий обработки (децеллюляризация, деминерализация, депротеинизация и т.п.) [10]; неорганические соединения (β-трикальция фосфат [11], октакальциевый фосфат (ОКФ) [12], натуральный или синтетический гидроксиапатит [13], силикаты [14] и т.п.); синтетические (PLGA, агароза и т.д.) [15] и натуральные (коллаген, хитозан, желатин, альгинат натрия) органические вещества, полимеры и соли органических кислот [16], а также композитные изделия из вышеперечисленных материалов. Матриксы-носители могут быть твердыми веществами, гелями (в том числе гидрогелями), аэрогелями [17, 18].

Большинство матриксов без биологически активных компонентов оказывают лишь оптимизирующее влияние на репаративную регенерацию тканей, но не способны ее активировать и поддержать на высоком уровне до полного гистотипического заживления. Иными словами, они выполняют только механическую функцию (восполнение зоны дефекта, направление формирующихся тканей со стороны краев дефекта к центру), а также способны доставить биологически активные вещества, предварительно внесенные в материал [9]. Основными направлениями совершенствования матриксов-носителей являются оптимизация состава (в том числе за счет комбинации нескольких веществ), модификация поверхности как в виде обработки веществами, улучшающими прикрепление биологически активных компонентов (клеток, белков, генных конструкций) [19], так и в форме изменения макро- и микрорельефа поверхности, наноструктурирования, что позволяет модулировать функцию клеток, совмещенных с матриксов до введения in vivo, и (или) клеток реципиентного ложа [20, 21].

Нашей исследовательской группой ранее был разработан биокомпозит, состоящий из матрикса-носителя, плазмидной ДНК, несущей гены vegf и (или) sdf, и клеток, вовлеченных в репаративную регенерацию тканей [22]. Другие исследователи остановили свой выбор на сложной четырехкомпонентной системе, представленной матриксом-носителем, клетками, генными конструкциями и факторами роста [23]. Основной предпосылкой для разработки таких биокомпозитов стала неудовлетворенность результатами двухкомпонентных систем: «матрикс-носитель + клетки», «матрикс-носитель + факторы роста», «матрикс-носитель + генные конструкции».

Тканеинженерные материалы

Данная группа материалов представляет собой изделия, состоящие из двух основных компонентов: биорезорбируемый носитель и живые (ауто- или аллогенные) клетки. Основная идея подхода состоит в восполнении утраченных камбиальных резервов и повышении концентрации факторов, индуцирующих репаративный процесс, в области введения материала. Трансплантированные клетки в реципиентном ложе в случае сохранения жизнеспособности могут оказать благоприятный терапевтический эффект за счет двух механизмов действия: непосредственный - дифференцировка в специализированные клетки поврежденных тканей (показано для аутогенных клеток [24]), а также опросредованный - паракринный эффект - регуляция морфофункциональной активности других клеток за счет продукции биологически активных веществ - факторов локальной регуляции гистогенеза. Важно, что, по мнению многих авторов, именно паракринная активность клеток тканеинженерных материалов является основным их механизмом действия [25].

Клетки, использующиеся для создания тканеинженерных материалов, могут подвергаться технологиям культивирования или использоваться непосредственно после выделения из тканевого источника. К основным применяющимся для создания тканеинженерных материалов видам культивированных клеток относятся мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [26, 27], остеогенные клетки и остеобласты [28, 29], эндотелиоциты [30, 31], фибробласты, эпителиоциты [32], стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью [33] и другие виды малодифференцированных и специализированных клеток отдельно и в различных комбинациях. К числу некультивированных клеточных популяций относятся клетки костного мозга («гетерогенная смесь» ММСК, фибробластов, эндотелиальных прогениторных клеток, гемопоэтических стволовых и дефинитивных клеток гемопоэтической линии и др.) [34] и стромально-васкулярная фракция жировой ткани (СВФ ЖТ) (ММСК, эндотелиоциты и эндотелиальные прогенеторные клетки, лейомиоциты, фибробласты, преадипоциты и иммунокомпетентные клетки) [35].

Изготовление тканеинженерных материалов с аллогенными клетками может быть выполнено с использованием принципиально иных технологий, предполагающих сберегательную обработку донорских тканей с сохранением компонентов межклеточного матрикса и живых клеток [36].

Несмотря на то что некоторые тканеинженерные изделия уже зарегистрированы и разрешены для применения в рутинной клинической практике («Osteocel plus» (NuVasive, США) (2005), «Trinity Evolution)) (Orthofix, США) (2009), «AlloStem» (AlloSource) (2011), «Cellentra VCBM» (BioMet, США) (2012), «OvationOS» (Osiris Therapeutics, США) (2013), BioSeed-Oral Bone» (BioTissue Technologies, Германия) (2001)), данный подход имеет ряд недостатков:

- недостаточная эффективность в случае протяженных (объемных) дефектов тканей и органов из-за гибели большинства клеток, входящих в состав тканеинженерного материала непосредственно после трансплантации - тканеинженерные изделия без префабрикации аваскулярны, а клетки требуют активного кровоснабжения, которое критически минимизировано в зоне повреждения;

- высокая себестоимость и сложность технологического процесса (клеточного сервиса) создания тканеинженерного материала, который должен осуществляться в соответствии со стандартами GMP и GTP;

- невозможность организации полноценного серийного производства наиболее эффективных - персонализированных (содержащих аутогенные клетки) - тканеинженерных изделий;

- особые условия хранения, не всегда являющиеся доступными для лечебно-профилактических учреждений (например, температура ниже -80°C);

- сохраняющиеся сложности правового регулирования и регистрации медицинских изделий, содержащих живые клетки.

Материалы с факторами роста

К данной группе медицинских изделий относятся материалы, состоящие из матрикса-носителя и факторов роста (одного или нескольких), обеспечивающих регуляцию репаративной регенерации тканей. Данный технологический подход является наиболее успешным в аспекте «клинической трансляции». Уже зарегистрированы и разрешены для клинического применения такие изделия как «Emdogain» (Straumann, Германия) - материал с эмалевыми матричными протеинами (1997); «ОР-1» (Stryker Biotech, США) - с рекомбинантным ВМР-7 (2001); «Infuse» (Medtronic, США) (2002, 2004, 2007) - с рекомбинантным ВМР-2; «GEM21S», «Augment bone graft» (BioMimetic Therapeutics Inc., США) - с рекомбинантным PDGF-BB (2005, 2009), «i-Factor Putty» (Cerapedics, США) - с белком P-15 (лиганд для интегринов α2β1, экспрессирующихся клетками остеобластического дифферона) (2008) и др.

Передовые исследования и разработки материалов с факторами роста направлены на два основных аспекта. Первый предполагает комбинацию нескольких факторов, в том числе неспецифических (ангиогенных) и специфических (селективно влияющих на определенный механизм в общем процессе репаративной регенерации какой-либо ткани), в одном изделии. Например, иммобилизация VEGF и ВМР-2 на одном носителе [37]. Второй - обеспечение пролонгированного контролируемого высвобождения терапевтических белков из структуры матрикса, в частности, за счет управления динамикой биодеградации гидрогелевых матриксов [38] или инкапсулирования молекул факторов роста в микросферы из органических полимеров [39]. Некоторые авторы за счет специальных технологий (например, сайт направленный мутагенез) изменяют структуру факторов роста, объединяют несколько в один, создавая «мутантные» молекулы, обладающие большей эффективностью в активации репаративного процесса. Например, P. Kasten с со авт. (2010) модифицировали фактор роста и дифференцировки-5 (growth-and-differentiation factor-5, GDF-5), добавив в его последовательность сайты ВМР-2, ответственные за связывание со специфическими рецепторами. В результате полученная молекула GDF-5 приобрела свойства, характерные для ВМР-2 [40].

Однако двухкомпонентные биокомпозиты, состоящие из матрикса-носителя и факторов роста, также имеют ряд недостатков, ограничивающих их эффективность. Во-первых, молекулы белка в условиях операционной раны (экссудация, высокая активность протеолитических ферментов) подвергаются быстрой биодеградации, являются короткоживущими и короткодистантными, что не позволяет материалу в полной мере проявить индуцирующее действие. Во-вторых, количество терапевтического белка в материале ограничено, а его действие даже при условии контролируемого и пролонгированного высвобождения - кратковременное и «грубое». Иными словами, та меньшая часть молекул белка, которая отделилась от носителя, сохранила свою биологическую активность и достигла клеток-мишеней - вступит во взаимодействие со специфическими рецепторами на их поверхности и вызовет биологический эффект. При этом быстро произойдет инактивация рецепторов вместе с лигандом как компенсаторно-адаптационный механизм, предохраняющий клетки от избыточной стимуляции, биологическое действие фактора роста прекратится, а его количество иссякнет. Этот аспект механизма действия таких материалов оказывает особенно негативное влияние на их эффективность при отсутствии заданной кинетики высвобождения факторов роста (что характерно для большинства изделий данной группы). Непосредственно после имплантации происходит последовательная смена ранних фаз воспалительного процесса (альтерация, затем экссудация), при которых высвободившиеся из материала факторы роста - регуляторы репаративной регенерации - еще не требуются. Более того, на столь ранней (первой) стадии репаративного процесса для факторов роста из состава имплантированного материала может не оказаться достаточного рецепторного поля, поскольку основными клетками в зоне повреждения будут иммунокомпетентные - нейтрофилы и макрофаги. Указанных недостатков теоретически лишен третий альтернативный подход.

Ген-активированные материалы

Данная группа материалов представляет собой комплекс «матрикс-носитель + генные конструкции (кодирующие нуклеиновые кислоты)», компоненты которого объединены различными методами: за счет технологий «химического связывания» [41], использования вспомогательных веществ (например, гелевых биополимеров) [42], непосредственного включения нуклеиновых кислот в состав носителей на этапе синтеза матрикса и т.д. Развитие ген-активированных материалов напрямую связано с достижениями генной терапии в целом, в рамках которой генные конструкции разрабатываются как действующие вещества генно-терапевтических лекарственных препаратов.

В механизме остеоиндуктивного действия ген-активированного материала можно выделить два последовательных этапа: неспецифический и специфический. Первый состоит в высвобождении нуклеиновых кислот из структуры носителя после имплантации в зону дефекта, поступлении в клетки реципиентного ложа и экспрессии в них. Фактически, он является одинаковым для любых генных конструкций, а вариабельность в части поступления в клетку обусловлена лишь системами доставки трансгена. Второй состоит в специфическом действии регуляторной молекулы белковой природы, кодируемой трансгеном и продуцируемой трансфицированными клетками, которые работают как «биореакторы» терапевтического белка, синтезируя его в течение контролируемого периода времени. В отличие от изделий, содержащих факторы роста, основной компонент ген-активированных остеопластических материалов действует «мягко». Иными словами, попадание трансгена в ядро клетки-мишени не принуждает ее к облигатной экспрессии терапевтического белка. Клетка сохраняет свое нормальное функциональное состояние и реакцию на стимулы микроокружения, в связи с чем при отсутствии потребности в терапевтическом белке в конкретный промежуток времени она за счет внутриклеточных посттранскрипционных механизмов регуляции полужизни мРНК способна снизить уровень мРНК трансгена и, тем самым, предотвратить продукцию белка [43]. Кроме того, даже без заданной кинетики высвобождения генных конструкций, их поступление в клетки реципиентного ложа, последующая экспрессии и начало пролонгированной продукции терапевтического белка требует времени. В этой связи, пик секреции белка трансфицированными клетками придется уже на вторую стадию репаративного процесса, после завершения воспалительной. Такой механизм действия генных конструкций значительно повышает эффективность ген-активированного материала по сравнению с изделиями, содержащими факторы роста [44].

Любые генные конструкции состоят из терапевтического гена (в виде кДНК или РНК) и системы его внутриклеточной доставки (вектор). Векторы разделяются на две основные группы: вирусные и невирусные. В первом случае трансген заключается в частице ретро-, ленти-, аденовируса или адено-ассоциированного вируса и др., а во втором - в плазмиду - кольцевую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую ряд вспомогательных последовательностей, обеспечивающих экспрессию трансгена. Вирусная и невирусная системы доставки отличаются по эффективности трансфекции. В первом случае до 40% и более генных конструкций поступают в клетки-мишени, а во втором - показатель не превышает 1-2% в виду размеров и отрицательного заряда «голой» плазмидной ДНК. Предложены подходы (физических, химических), обеспечивающие повышение эффективности трансфекции плазмидной ДНК до 8-10% [45].

Ряд вирусных векторов (ретро-, лентивирусные и др.) встраиваются в геном. Иными словами, экспрессия трансгена, который они переносят, длительная, в то время как остальные, в том числе плазмидная ДНК, в геном не интегрируются, поэтому экспрессируются временно, в течение 10-14 сут. Ретро- и лентивирусные векторы чаще применяются в генно-клеточном подходе, когда культура клеток трансфицируется ex vivo и после этого совмещается с матриксом-носителем [46].

Все ген-активированные материалы могут быть разделены по технологическому варианту совмещения матрикса и генных конструкций, а также по составу биологически активного компонента: природе вектора и трансгена, количеству трансгенов или различных генных конструкций в составе одного изделия. Однако главным дифференциальным признаком, обусловливающим различия в биологическом действии ген-активированных материалов, является именно трансген. Наиболее часто применяющимися при создании ген-активированных материалов трансгенами являются последовательности нуклеотидов, кодирующие основные факторы роста и транскрипционные факторы, вовлеченные в положительную регуляцию репаративного процесса - индукцию миграции, пролиферации, дифференцировки клеток, синтеза ими компонентов гистотипического межклеточного матрикса и биологически активных веществ [9]. Кроме того, в качестве трансгенов могут быть использованы последовательности нуклеотидов, кодирующие белки рецепторов клеток (увеличение рецепторного поля увеличивает восприимчивость клеток реципиентного ложа к факторам микроокружения и веществам, введенным извне), цитокины (интерлейкины, фактор некроза опухолей-α и др.), гормоны и гормоноподобные вещества, что может улучшить регенерацию тканей.

Однако разработанные к настоящему времени ген-активированные материалы и технологии их создания имеют ряд специфических недостатков.

Во-первых, невирусные генные конструкции, входящие в состав ген-активированных материалов, характеризуются крайне низкой эффективностью трансфекции, а использование физических (электрофорез, ультразвук и т.д.) или химических (совмещение с катионными белками, липосомы и т.д.) методов увеличения уровня поступления биологически активного компонента в клетки не всегда возможно. В этой связи, исследователи вынуждены использовать высокие дозы генных конструкций, чтобы увеличить количество акцептировавших их клеток и добиться желаемого биологического эффекта. Увеличение дозы закономерно влечет к повышению себестоимости изделия, а также может скомпрометировать его безопасность. Кроме того, технологии создания ген-активированных материалов, основанные на формировании химических связей между матриксом-носителем и нуклеиновыми кислотами, далеко не всегда позволяют увеличить дозу генных конструкций, так как такое увеличение требует изменения состава матрикса.

Во-вторых, начало экспрессии трансгена после имплантации материала in vivo у большинства ген-активированных материалов является поздним - приходится на вторую стадию репаративного процесса, т.е. после завершения воспалительной стадии (через 2 недели после введения in vivo), а максимальный уровень продукции трансгена - на еще более поздние сроки, что зависит от кинетики высвобождение генных конструкций из матрикса-носителя. Однако инициировать более раннюю экспрессию генных конструкции и обеспечить смещение сроков достижения максимального уровня продукции терапевтического белка «влево» стандартные ген-активированные материалы не способны. Для этого разрабатываются различные способы оптимизации ген-активированных материалов, направленные на изменение и «программирование» кинетики высвобождения биологически активного компонента из структуры матрикса-носителя. Наиболее известными являются методы инкапсуляции молекул нуклеиновых кислот с последующим связыванием комплексов с матриксом-носителем за счет чувствительных к определенным факторам (температура, pH, ультразвук, специфические ферменты) посредников. Постепенное разрушение вещества, обеспечивающего связь микрокапсул или иных комплексов, содержащих нуклеиновую кислоту, с матриксом-носителем обеспечивает контролируемое высвобождение генных конструкций [47].

В-третьих, как было отмечено выше, в случаях, когда объединение матрикса-носителя и нуклеиновых кислот обеспечивается за счет химического взаимодействия указанных компонентов, точность дозы генных конструкций практически невозможно проконтролировать. Этот недостаток особенно характерен для твердых материалов, выбранных в качестве матриксов-носителей. В частности, известна способность материалов, содержащих соединения кальция, удерживать молекулы нуклеиновых кислот за счет комплексообразования, реализуемого, вероятно, по механизму донорно-акцепторной (координативной) связи. Данный механизм используется в хроматографических колонках при очистке нуклеиновых кислот [48]. Этот же принцип экстраполирован на создание ген-активированных материалов с использованием матриксов, содержащих фосфаты кальция [49]. Однако образцы разных серий изготовления и даже в пределах одной серии могут существенно отличаться по количеству связываемых ими нуклеиновых кислот, а среднее количество невозможно прогнозировать и контролировать - оно вычисляется экспериментальным путем при объединении каждого варианта матрикса с нуклеиновой кислотой.

В-четвертых, важнейшим условием для внедрения в клиническую практику любого имплантируемого медицинского изделия, к которым относятся и ген-активированные материалы, является стерильность. На заключительном этапе производственной технологии подавляющего большинства медицинских изделий предусмотрена стерилизация. Однако все методы стерилизации направлены на элиминацию в том числе и нуклеиновых кислот, которые в случае ген-активированных материалов являются важнейшим, отличительным компонентом изделия, обеспечивающим его главный механизм действия и терапевтический эффект. В случае геннотерапевтических препаратов (генные конструкции + матрикс- носитель), таких как «Неоваскулген» (ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека»), в виду отсутствия в их составе матрикса-носителя, реализуема стерильная микрофильтрация. Однако проблема изготовления стерильного ген-активированного материала до настоящего времени не решена. В каждом частном случае разработчики вынуждены искать удобоваримые варианты.

Два первых из вышеуказанных недостатков предопределяют менее выраженную эффективность ген-активированных материалов в регенерации тканей по сравнению с теоретически возможной. Две последние проблемы в большей степени обусловливают экономические издержки и являются препятствиями для внедрения ген-активированных материалов в качестве медицинских изделий в клиническую практику.

Учитывая вышеизложенное, наши усилия были направлены на исследования и разработки по созданию оптимизированных ген-активированных материалов, в той или иной степени лишенных указанных выше недостатков.

Перечень иллюстраций:

Рис. 1. Регенерат в центральной зоне дефекта теменной кости кролика, 30 сут после имплантации материалов: А - обычный ген-активированный материал; Б - оптимизированный ген-активированный материал с двумя фракциями нуклеиновых кислот. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: ×40.

Рис. 2. Доля костного регенерата в центральных зонах костных дефектов через 30-90 сут после имплантации материалов: А - обычного ген-активированного материала; Б - оптимизированного ген-активированного материала с двумя фракциями нуклеиновых кислот.

Рис. 3. Исследование выполняли в стандартных модельных условиях без эвакуации/деструкции выделившихся в раствор нуклеиновых кислот, т.е. определяли накопленную концентрацию в растворе.

Рис. 4. Динамика высвобождения генных конструкций из обычных и оптимизированных ген-активированных материалов, содержащих различные комплексообразователи.

Рис. 5. Микрочастицы фосфатов-комплексообразователей в культуре ММСК костного мозга, ко-инкубированной с ген-активированными материалами: А - ОКФ/plVEGF; Б - ОКФ+ Mg²⁺/plVEGF; В -ОКФ+Ba²⁺/plVEGF.

Подробное описание изобретения

Задачей настоящего изобретения была оптимизация ген-активированных материалов за счет:

- повышения минимальной дозы нуклеиновых кислот в составе ген-активированного материала;

- обеспечения стандартизации состава ген-активированного материала за счет точного воспроизведения выбранной дозы нуклеиновых кислот в каждом образце изделия каждой серии;

- коррекции динамики высвобождения генных конструкций из состава матрикса-носителя в соответствии со стадийностью репаративного процесса;

- создания стерильного ген-активированного материала, включающего твердый матрикс-носитель.

Технический результат изобретения состоит в разработке способа получения оптимизированного твердого ген-активированного материала, включающего создание матрикса-носителя, связавшего как минимум одну молекулу нуклеиновой кислоты, с последующим размещением на его поверхности еще как минимум одной дополнительной молекулы нуклеиновой кислоты любым физическим методом, способа получения твердого матрикса-носителя, пригодного для создания оптимизированного твердого ген-активированного материала, самого оптимизированного, в том числе стерильного, твердого ген-активированного материала для регенерации тканей. В контексте настоящего исследования под термином «оптимизированный ген-активированный материал» понимается изделие, состоящее из матрикса-носителя и нуклеиновых кислот, отличающееся тем, что, по меньшей мере, два из четырех вышеперечисленных направлений оптимизации были успешно реализованы при создании такого материала.

Оптимизированные ген-активированные материалы с двумя фракциями нуклеиновых кислот

Первый способ касается ген-активированных материалов, в составе которых как минимум часть матрикса-носителя представлена твердым веществом, элементы которого способны к транзиторному удержанию (связыванию) молекул нуклеиновых кислот. Перечень таких матриксов включает, но не ограничивается следующими группами: гидроксиапатит, фосфаты кальция, костные матриксы различных технологий обработки и др.

Как было отмечено выше, в таких материалах до настоящего времени невозможно было предсказать и контролировать дозу генных конструкций, а также не были разработаны эффективные способы повышения этой дозы. Каждый вариант материала из вышеуказанных групп отдельно или в составе комплекса с какими-либо другими дополнительными компонентами (коллагеном, желатином, альгинатами, агарозой, полимерами органических кислот и др.) способен связать некоторое количество нуклеиновых кислот, которое может существенно различаться между образцами матриксов-носителей одного и того же состава, даже одной серии.

Нам удалось разработать первый способ создания оптимизированных ген-активированных материалов, в составе которых нуклеиновые кислоты были разделены на две фракции. Первая - связанная с матриксом-носителем, вероятно, за счет комплексообразования с соединениями кальция. Вторая - несвязанная, размещенная на поверхности твердого матрикса-носителя фракция нуклеиновых кислот.

Разработанный способ включает нижеприведенные этапы.

1. Создание первичного комплекса «матрикс-носитель - нуклеиновая кислота» в следующих вариантах: а) синтез матрикса-носителя, способного связать на своей поверхности нуклеиновую кислоту, с последующим объединением с как минимум одной молекулой нуклеиновой кислоты; б) добавление как минимум одной молекулы нуклеиновой кислоты к исходным материалам в процессе синтеза матрикса-носителя (выполнимо для материалов, имеющих на одном из этапов изготовления жидкую или гелевую формы). Указанные два технологических варианта создания первичного комплекса не являются взаимоисключающими. В частности, после реализации варианта «б», полученный матрикс-носитель с генными конструкциями может быть подвергнут объединению с дополнительным количеством нуклеиновых кислот, согласно варианту «а».

2. Размещение на поверхности полученного первичного комплекса «матрикс-носитель - нуклеиновая кислота» еще как минимум одной дополнительной молекулы нуклеиновой кислоты любым физическим методом, позволяющим осуществить такое размещение без образования химической связи между указанным матриксом-носителем и дополнительной нуклеиновой кислотой. Данный этап является критически значимой отличительной особенностью разработанного способа, так как позволяет повысить общую дозу нуклеиновых кислот до необходимого уровня.

Реализация второго этапа осуществима только в случае твердых матриксов-носителей. Увеличение эффективности и количества нуклеиновых кислот, размещенных на поверхности твердых материалов без образования химических связей с ними, закономерно, зависит от общей площади поверхности, ее макро- и микрорельефа, гидрофильности, сорбционных свойств матрикса-носителя и иных факторов. В этой связи за счет модификации указанных факторов возможно увеличивать количество размещенных на поверхности матрикса-носителя генных конструкций.

Для реализации второго этапа наиболее приемлемым является использование нуклеиновых кислот в водном растворе (вода, различные фосфатные или иные буферные растворы). Для более эффективного размещения несвязанной фракции нуклеиновых кислот на поверхности матриксов-носителей в растворы нуклеиновых кислот могут быть добавлены фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как глюкоза, декстроза, натрия гидрофосфата додекагидрат, натрия дигидрофосфата дигидрат и любые другие, корректирующие заряд поверхности матриксов-носителей, нуклеиновых кислот, функционализирующие поверхность и предназначенные для удержания на ней молекулы, а также обеспечивающие первичное размещение нуклеиновых кислот для последующей фиксации на поверхности под воздействием физических методов без образования химических связей. Кроме того, фармацевтически приемлемые вещества обеспечивают стабилизацию нуклеиновых кислот, что увеличивает сроки хранения.

Перечень таких физических методов представлен, но не ограничен следующими: сушка при любых удобоваримых температуре, влажности, газовом составе среды, давлении, времени экспозиции; воздействие низких температур, ультразвука, магнитных и электрических полей и т.д.

Разрабатывая данный способ, мы рассчитывали, главным образом, на точность дозирования и повышение минимально возможной концентрации нуклеиновых кислот в составе ген-активированного материала.

Для исследований в качестве матриксов-носителей были отобраны следующие 10 наименований твердых изделий: ксеногенный деминерализированный костный матрикс - «Биоматрикс» (Конектбиофарм, Россия); аллогенный деминерализированный костный матрикс - «Перфоост» (Тканевый банк ЦИТО им. Н.Н. Приорова, Москва), «Остеоматрикс» (Конектбиофарм, Россия), «Аллоплант» (Всероссийский центр глазной и пластической хирургии, Уфа); ксеногенный депротеинизированный костный матрикс - «Bio-oss spongiosa» (Geistlich, Швейцария); композитный материал из синтетического гидроксиапатита и ксеногенного коллагена - «Колапол-КПЗ» (НПО Полистом, Россия); β-трикальция фосфат - «Cerasorb» (Curasan, Германия), «Chronos» (Synthes, Швейцария), «Трикафор» (БиоНова, Россия); октакальциевый фосфат (ОКФ, Институт металлургии и материаловедения РАН им. А.А. Байкова, Москва).

В качестве генных конструкций была использована высокоочищенная сверхскрученная плазмидная ДНК с геном, кодирующим VEGF (pCMV-VEGF165). Указанная генная конструкция является действующим веществом лекарственного препарата «Неоваскулген» (ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», РУ ЛП-000671 от 28.09.11), содержащего в качестве адъювантов декстрозы моногидрат - 60,0 мг (НД 42-11395-07), натрия гидрофосфата додекагидрат - 3,94 мг (ГОСТ 4172-76), натрия дигидрофосфата дигидрат - 0,160 мг (ГОСТ 245-76). Препарат выпускается в форме лиофилизированного порошка белого цвета в стерильных стеклянных флаконах с содержанием плазмидной ДНК 1,2 мг и показан для лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей 2а-3 ст по классификации Фонтейна в модификации А.В. Покровского.

Совмещение вышеуказанных носителей и генных конструкций выполнялось по разработанному оригинальному протоколу, описанному в патенте РФ №2519326, и частично модифицированному. Содержание основных этапов лабораторного протокола:

1) Отмывка носителей. Образцы стандартной массы (100 мг) инкубировали в 0,5 М фосфатном буфере в объеме 1 мл при 37°С при постоянном встряхивании в течение 10 ч.

2) Уравновешивание. Образцы отмывали 10 мМ фосфатным буфером в объеме 1 мл при 37°С и постоянном встряхивании 4 раза по 10 мин.

3) Высушивание. Образцы выдерживали при 37°С до полного высыхания в течение 10 ч.

4) Совмещение носителей и генных конструкций. Раствор плазмидной ДНК (в концентрации 1 мкг/мкл) наносили в объеме 0,5 мл на образцы носителей. Материалы инкубировали при 37°С и постоянном встряхивании в течение 10 ч.

5) Промывка. Образцы отмывали 5 мМ фосфатным буфером в объеме 1 мл 3 раза, что позволяло убрать из раствора не связавшуюся с матриксом-носителем плазмидную ДНК.

6) Высушивание. Образцы выдерживали при 37°С до полного высыхания в течение 10 ч.

Для каждого материала выполнялось 4 повторения. Результаты - количество связавшейся с носителем плазмидной ДНК - оценивались после ее диссоциации (обработка 0,5 М раствором фосфатного буфера в объеме 200-600 мкл при 37°С и постоянном встряхивании в течение 10 мин) с определением концентрации нуклеиновых кислот в растворе с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США).

Оказалось, что все выбранные для исследования материалы были способны связать некоторое количество нуклеиновых кислот. По всей видимости, связь реализовывалась за счет комплексообразования между соединениями кальция, входящими в состав матриксов, и плазмидной ДНК. Однако различные материалы даже в пределах оной и той же группы (β-трикальция фосфат, деминерализованный костный матрикс) существенно различались по количеству нуклеиновых кислот, которое они удерживали (табл. 1). Это полностью согласуется с вышеуказанными особенностями и недостатками разрабатываемых к настоящему времени твердых ген-активированных материалов.

На втором этапе данного исследования для повышения уровня нуклеиновых кислот в составе ген-активированного материала и точного их дозирования в количествах 100, 300 и 500 мкг на 1,0 г указанных в табл.1 материалов, технология изготовления была модифицирована:

- совмещение матриксов-носителей с генными конструкциями выполнялось сразу в растворе с целевыми концентрациями нуклеиновых кислот (100, 300 и 500 мкг на 1,0 г матрикса-носителя), раствор также содержал 10 мМ фосфатного буфера и 60,0 мг декстрозы моногидрата, инкубирование выполнялось в течение 4 ч;

- этап последующей промывки был отменен - сразу после инкубации материалы не извлекались из раствора и помещались в лиофилизатор;

- лиофилизация выполняла по различным протоколам (варьировались основные параметры) продолжительностью до 4 сут, однако результаты существенно не отличались.

После выполнения указанного способа лиофилизированные ген-активированные материалы подвергались инкубаци